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1、10申请公布号CN104212763A43申请公布日20141217CN104212763A21申请号201410469363X22申请日20140915C12N5/0775201001A61K35/48200601A61P5/2620060171申请人中山大学地址510000广东省广州市新港西路135号72发明人项鹏姜美花蔡炳臧志军汪建成74专利代理机构广州凯东知识产权代理有限公司44259代理人姚迎新54发明名称一种睾丸间质干细胞的分离、培养方法及其用途57摘要本发明公开了一种睾丸间质干细胞的分离、培养方法及其用途，本发明所提供的方法包括利用7天或2个月小鼠，分离睾丸，去除被膜和血管，暴露。
2、生精小管后用胶原酶IV消化，过滤消化后的细胞悬液；通过CD51的细胞特异标记，利用流式细胞仪进行分选，获得单个细胞，收集表达CD51的细胞，从而分离出所述CD51阳性睾丸间质干细胞。本发明提供了根据上述方法分离的睾丸间质来源干细胞，以及进一步在培养基中培养获得的自我更新和增殖、具有多向分化潜能的细胞，并且提供了将这些细胞用于制备治疗睾酮水平低下导致的相关疾病的组合物的用途。51INTCL权利要求书1页说明书5页附图5页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书5页附图5页10申请公布号CN104212763ACN104212763A1/1页21一种睾丸间质干细胞的分离。
3、方法，其特征在于所述的分离方法是选择7天或2个月龄小鼠，分离小鼠睾丸，用胶原酶IV，过滤消化后的细胞悬液，滤过筛网，获得单个细胞，所述细胞用CD51抗体进行标记；将上述已经标记的单个细胞通过流式细胞仪进行分选，收集CD51荧光强度是阴性对照细胞的荧光强度的10倍或以上的细胞，从而分离出所述CD51阳性的睾丸间质干细胞。2如权利要求1所述的睾丸间质干细胞的分离方法，其特征在于所述的分离方法的具体步骤如下1利用生后7天或两月龄雄性小鼠，采用颈椎脱臼法处死，在无菌条件下打开阴囊部，取出双侧睾丸并在解剖显微镜下去除被膜和血管，用含1双抗的1PBS反复冲洗，随后用吸管及枪头轻轻吹打，使间质组织与曲精细管。
4、分散开，并用小剪刀剪碎组织部分，随后放入1MG/ML的IV型胶原酶溶液，于37、5CO2条件下孵育15MIN，加入含05BSA的1PBS终止胶原酶的消化，1500RMP离心5MIN；弃去上清液，用孔径为40M的尼龙网过滤悬液，去除未消化的曲细精管，收集单细胞，以1500RMP离心5MIN，得到睾丸细胞悬液；2进行CD51抗体标记，CD51抗体与睾丸细胞悬液混合，两者体积比为1100，4微旋孵育30分钟，对照细胞样本与IGG进行孵育，弃清液，PBS缓冲液洗涤2次，经流式分选收集表达CD51的抗体荧光强度是阴性对照细胞的荧光强度的10倍或以上的细胞，从而分离出所述CD51阳性睾丸间质干细胞。3一种。
5、培养如权利要求1或2所述的方法得到的睾丸间质干细胞的方法，其特征在于将分离得到的睾丸间质干细胞在培养基中进行培养，产生自我更新和增殖的细胞；所述培养基为无血清培养基，其成分包括DMEMF12培养基中加入1NM地塞米松、1NG/MLLIF,5MG/LITERINSULIN,5MG/LITERTRANSFERRIN,5UG/LITERSODIUMSELENITE的ITS、5鸡胚提取物、01MM巯基乙醇、1非必需氨基酸、1N2、2B27GIBCO、20NG/MLBFGF、20NG/MLEGF、20NG/MLPDGFBB、20NG/MLOSM。4一种如权利要求13任一项所述的方法得到的睾丸间质干细胞用。
6、于制备治疗睾酮水平低下导致的相关疾病的药物的用途。权利要求书CN104212763A1/5页3一种睾丸间质干细胞的分离、培养方法及其用途技术领域0001本发明涉及干细胞与组织工程技术领域，尤其涉及一种睾丸间质干细胞的分离、培养方法及其用途。背景技术0002随着全球老龄化进展加速，各种衰老相关性疾病日益引起人们的重视。其中由于原发性或继发性睾丸间质细胞功能障碍引起的迟发性性腺功能减退LOH、老年雄激素缺乏症等疾病在50岁以上男性的发病率高达20以上，它不仅影响生活质量，也易导致心血管疾病、精神疾病等重大疾病的发生。睾酮补充治疗是目前主要治疗手段。据估计，1997年美国的睾酮产品市场规模约为049。
7、亿美元，而在2002年就超过3亿美元。统计数字表明，45岁以上的男性有20受到低睾酮水平的困扰，而接受治疗的仅2，表明存在巨大的市场潜力。但是外源性睾酮制剂无法模拟机体睾酮的生理情况，长期给予会导致睾丸局部睾酮浓度下降，最终引起精液质量下降并进而影响男性生育功能，因此，睾酮制剂治疗LOH治疗始终有很多争议。0003睾丸间质细胞移植是治疗迟发性性腺功能减退症等疾病的最佳手段。邓春华研究团队成功体外培养出睾丸间质细胞后，对血清睾酮和游离睾酮水平均明显下降的老年SD大鼠进行了睾丸间质细胞移植，在没有应用免疫抑制剂的情况下，移植后老年SD大鼠的血清睾酮和游离睾酮均显著升高至成年SD大鼠的水平，提示同种。
8、异体睾丸间质细胞移植是一种新的、有效的、更符合生理的补充睾酮的方法。但睾丸间质细胞的来源有限，扩增能力有限，大大限制了其进一步的应用。0004睾丸间质干细胞是具有自我更新、可分化为睾丸间质细胞的一类细胞。在大鼠出生后7天，梭形的睾丸间质干细胞主要分布在大鼠睾丸间质细胞部分以及血管周围。DAVIDOFF等认为睾丸的血管即血管平滑肌细胞及周细胞是睾丸间质细胞的前体细胞DAVIDOFFMS,MIDDENDORFFR,ENIKOLOPOVG,RIETHMACHERD,HOLSTEINAF,MULLERDPROGENITORCELLSOFTHETESTOSTERONEPRODUCINGLEYDIGCEL。
9、LSREVEALEDTHEJOURNALOFCELLBIOLOGY2004；167935944。目前对睾丸间质干细胞的研究甚少，没有明确的特意标志物。而对于睾丸间质干细胞的纯化方法也仅仅局限于METRIZAMIDE或PERCOLL密度梯度离心法，结合PDGFR阳性且LHR阴性细胞的免疫选择IMMUNOSELECTION法，纯化出大鼠睾丸中的睾丸间质干细胞。葛仁山等人取60只7天龄大鼠睾丸进行睾丸间质干细胞分离，最终获得每一个睾丸中8，500睾丸间质干细胞，将分离得到的睾丸间质干细胞移植入睾丸间质细胞损伤大鼠模型中用全称，二甲磺酸乙烷，EDS，发现睾丸间质干细胞可以在体内定植，并分化成有功能的睾。
10、丸间质细胞GERS,DONGQ,SOTTASCM,PAPADOPOULOSV,ZIRKINBR,HARDYMPINSEARCHOFRATSTEMLEYDIGCELLSIDENTICATION,ISOLATION,ANDLINEAGESPECICDEVELOPMENTPROCNATLACADSCIUSA2006；10327192724。虽然，移植睾丸间质干细胞治疗LOH为临床提供了良好的应用前景，但是现行方法存在获得细胞量少，细胞种类不明确，缺乏细胞鉴定标准等众多弊说明书CN104212763A2/5页4端，明显制约了临床应用，需要进一步的深入研究。0005CD51又称为整合素蛋白V，是整合素蛋。
11、白超家族中的一员，其实质为异质二聚体整合膜蛋白由链和链两部分构成。进一步可细分为V1，V3，V5，V6和V8共5个亚型。在调控胚胎器官形成，血管生成，血管通透性，癌症演进，上皮组织的炎症及纤维化中发挥重要作用要作用。有研究报道，CD51广泛分布于牙周韧带，人脐带血及华通氏胶中MSC样细胞的表面。同时，也发现CD51存在于大部分人骨髓MSC细胞的表面，认为是MSC的标志物PINHOS,LACOMBEJ,HANOUNMETALPDGFRALPHAANDCD51MARKHUMANNESTINSPHEREFORMINGMESENCHYMALSTEMCELLSCAPABLEOFHEMATOPOIETIC。
12、PROGENITORCELLEXPANSIONTHEJOURNALOFEXPERIMENTALMEDICINE2013；21013511367。目前尚未见研究报道以CD51为标记物分离和鉴定睾丸间质干细胞的相关研究。发明内容0006本发明的目的在于简化睾丸间质干细胞的分离及培养方法，提供睾丸间质干细胞的鉴定方法，以及其应用。0007本发明采用如下技术方案0008本发明的睾丸间质干细胞的分离方法是选择7天或2个月龄小鼠，分离小鼠睾丸，用胶原酶IV，过滤消化后的细胞悬液，滤过筛网，获得单个细胞，所述细胞用CD51抗体进行标记；0009将上述已经标记的单个细胞通过流式细胞仪进行分选，收集CD51荧光。
13、强度是阴性对照细胞的荧光强度的10倍或以上的细胞，从而分离出所述CD51阳性的睾丸间质干细胞。0010本发明的分离方法的具体步骤如下00111利用生后7天或两月龄雄性小鼠，采用颈椎脱臼法处死，在无菌条件下打开阴囊部，取出双侧睾丸并在解剖显微镜下去除被膜和血管，用含1双抗的1PBS反复冲洗，随后用吸管及枪头轻轻吹打，使间质组织与曲精细管分散开，并用小剪刀剪碎组织部分，随后放入1MG/ML的IV型胶原酶溶液，于37、5CO2条件下孵育15MIN，加入含05BSA的1PBS终止胶原酶的消化，1500RMP离心5MIN；弃去上清液，用孔径为40M的尼龙网过滤悬液，去除未消化的曲细精管，收集单细胞，以1。
14、500RMP离心5MIN，得到睾丸细胞悬液；00122进行CD51抗体标记，CD51抗体与睾丸细胞悬液混合，两者体积比为1100，4微旋孵育30分钟，对照细胞样本与IGG进行孵育，弃清液，PBS缓冲液洗涤2次，经流式分选收集表达CD51的抗体荧光强度是阴性对照细胞的荧光强度的10倍或以上的细胞，从而分离出所述CD51阳性睾丸间质干细胞。0013本发明的分离方法得到的睾丸间质干细胞的培养方法如下将分离得到的睾丸间质干细胞在培养基中进行培养，产生自我更新和增殖的细胞；经实验表明，单纯在DMEM/F12基础培养基，或加10血清的培养基中培养分离的CD51阳性睾丸间质干细胞不增殖，容易分化。因此，本发。
15、明在DMEM/F12基础培养基的基础上进行改良，优选的培养基为无血清培养基，其成分包括DMEMF12培养基中加入1NM地塞米松、1NG/MLLIF,5MG/LITERINSULIN,5MG/LITERTRANSFERRIN,5UG/LITERSODIUMSELENITE的ITS、5鸡胚提取物、说明书CN104212763A3/5页501MM巯基乙醇、1非必需氨基酸、1N2、2B27GIBCO、20NG/MLBFGF、20NG/MLEGF、20NG/MLPDGFBB、20NG/MLOSM。实验表明，将该培养用于本发明所述的睾丸间质干细胞的培养，细胞增殖效果非常好。3天进行一次传代。0014本发明。
16、对分离得到的CD51阳性细胞进行睾丸间质干细胞系及干细胞相关蛋白表达的检测，从分子水平分析CD51阳性干细胞的分子生物学特点，进一步提供该细胞的克隆形成能力、自我更新、多向分化能力，从而对该种干细胞进行鉴定。结果表明，CD51阳性睾丸间质干细胞呈克隆球样生长。培养的CD51阳性睾丸间质干细胞表达NESTIN，PDGFR，LIFR，PH3，SSEA1，SSEA4，GATA4，但是不表达3HSD，LHR等。该细胞具有克隆形成能力。分化实验结果表明，CD51阳性睾丸间质干细胞可分化为脂肪细胞、成骨细胞。在睾丸间质细胞诱导分化条件下，可分化为睾丸间质细胞，并分泌睾酮。0015考虑到本发明所述的分离的C。
17、D51阳性睾丸间质干细胞在体内的作用，将所述细胞移植到去除睾丸间质细胞的大鼠动物模型应用大鼠睾丸间质细胞的特异性凋亡诱导剂二甲磺酸乙烷EDS，成功建立了LEYDIG细胞凋亡模型，评价该细胞在睾丸微环境中的作用。结果发现，该细胞移植后可以促进睾酮的分泌，因此本发明的方法得到的睾丸间质干细胞可以用于制备治疗睾酮水平低下相关疾病的药物。附图说明0016图1是7天、2个月小鼠CD51细胞流式分选图。0017图2是细胞体外培养培养图。0018图3是培养的CD51阳性睾丸间质干细胞从单个细胞增长到克隆球的白光观察图。0019图4是培养的CD51阳性睾丸间质干细胞向成骨、成脂分化图；0020A成骨钙结节茜素。
18、红染色B成脂油红O染色。0021图5是CD51睾丸间质细胞分化图。0022图6是CD51阳性睾丸间质干细胞在体外培养条件下分泌睾酮的示意图。0023图7是CD51阳性睾丸间质干细胞移植到EDS模型大鼠10天后，血清睾酮水平示意图。具体实施方式0024下面的实施例是对本发明的进一步详细描述。0025实施例一小鼠成体睾丸间质CD51阳性细胞的分离0026本实施例选择从小鼠成体睾丸中分离获得睾丸间质干细胞。0027分离方法具体如下0028A取出生后7天生殖系统发育健全的雄性C57BL/6雄性小鼠，采用颈椎脱臼法处死，在无菌条件下打开阴囊部，取出双侧睾丸并在解剖显微镜下去除被膜和血管，用含1双抗的1P。
19、BS反复冲洗。随后用吸管及枪头轻轻吹打，尽量使间质组织与曲精细管分散开，并用小剪刀剪碎组织部分。随后放入1MG/ML含少量DNASE酶的IV型胶原酶溶液，于37、5CO2条件下孵育15MIN，加入大量含05BSA的1PBS终止胶原酶的消化，1500RMP离心5MIN；弃去上清液，用孔径为40M的尼龙网过滤悬液，收集的滤液以1500RMP离心5MIN。说明书CN104212763A4/5页60029B进行CD51抗体标记。CD51抗体1100与睾丸细胞悬液混合，4微旋孵育30分钟，对照细胞样本与IGG进行孵育，弃清液，PBS缓冲液洗涤2次。使用流式细胞仪BDINFLUXCELLSORTER先对I。
20、GG阴性对照组细胞悬液进行流式上样，选出阴性荧光信号区域作为阴性对照。随后对CD51阳性细胞悬液进行流式上样，分选纯化出CD51荧光强度是阴性对照细胞的10倍或以上时收集细胞，用培养基对分选出的细胞进行收集。0030图1是出生7天、2个月小鼠睾丸中CD51阳性睾丸间质干细胞流式分选图。如图1所示，CD51阳性细胞的阳性率最高的为7天的小鼠6236，2个月小鼠为124，并可以看出随着年龄增长阳性率呈下降趋势，根据这一结果，为了获取更多的阳性细胞，我们就可以选择7天龄小鼠为主要实验对象。0031实施例二CD51阳性睾丸间质干细胞自我更新和增殖能力的鉴定0032本实施例是在实施例一的基础上，对所获得。
21、的CD51阳性睾丸间质干细胞自我更新和增殖能力进行鉴定。0033ACD51阳性睾丸间质干细胞自我更新能力的鉴定00341将从小鼠成体睾丸中分选获得的单个CD51阳性细胞分别置于6孔板的各个单孔中进行培养。培养液成分包括DMEMF12培养基中加入1NM地塞米松、1NG/MLLIF,5MG/LITERINSULIN,5MG/LITERTRANSFERRIN,5UG/LITERSODIUMSELENITE的ITS、5鸡胚提取物、01MM巯基乙醇、1非必需氨基酸、1N2、2B27GIBCO、20NG/MLBFGF、20NG/MLEGF、20NG/MLPDGFBB、20NG/MLOSM。观察细胞克隆的形。
22、成情况，当细胞克隆大小达到50UM以上、密度达到70，用37的005胰蛋白酶EDTA对细胞消化30秒，进行传代。0035图2显示分选得到的原代细胞在培养基中贴壁，呈梭型生长。原代细胞传代后形成克隆球生长。00362应用免疫荧光染色的方法进行包括PDGFR、LIFR、NESTIN、CD51、胚胎干细胞标志物，例如SSEA1、SSEA4，睾丸间质细胞标志物LHR和3HSD，GATA4以及细胞增殖相关标志物PH3的染色，细胞切片用4多聚甲醛固20MIN，PBS缓冲液中浸洗5MIN3次，02TRITONX100穿透30分钟，正常山羊血清室温孵育20分钟，加一抗，湿化盒中4过夜，加二抗，室温孵育1小时，。
23、荧光显微镜观察结果。0037CD51阳性睾丸间质干细胞球与上述干细胞增殖重新编程有关的标志物的免疫荧光共染色结果表明，CD51阳性睾丸间质干细胞球表达NESTIN、PDGFR、LIFR、SSEA1、SSEA4、GATA4、PH3，但不表达LHR、3HSD。0038BCD51阳性睾丸间质干细胞增殖能力的鉴定0039为了演示CD51阳性睾丸间质干细胞的自我更新能力，我们从P7代CD51阳性睾丸间质干细胞消化得到单细胞，进行单细胞球体形成试验。图3表明单细胞培养10天后可形成克隆。结果表明，CD51阳性睾丸间质干细胞具有较强的自我更新能力。0040CCD51阳性睾丸间质干细胞分化能力的鉴定0041为。
24、了演示CD51阳性睾丸间质干细胞的分化能力，利用常规成骨，成脂培养液中进行分化。图4所示，21天后，可向成骨细胞，脂肪细胞分化。在特定睾丸间质细胞分化培养液DMEMF12培养基中加入2FCS，10NG/MLPDGFBB，1NMT3，1NG/MLLH，70NG/MLIGFI，10NGPDGFBB以及ITS中分化7天。结果显示如图5和图6，CD51阳性睾丸间质干细胞可向成熟睾丸间质细胞分化。通过免疫染色结果分析，分化的细胞表达GATA4，P450C17，说明书CN104212763A5/5页7STAR，3HSD，SF1，LHR。睾酮ELISA检测结果发现，随着分化时间的增加，睾酮分泌增高。0042。
25、实施例三观察CD51阳性睾丸间质干细胞在体内组织修复中作用0043大鼠EDS模型的建立0044干细胞对体内受损组织的再生能力是一个重要的属性。因此，我们调查CD51阳性睾丸间质干细胞是否能在睾丸间质细胞缺失的大鼠模型中促进睾丸间质恢复。先前的研究表明THECYTOTOXINETHANEDIMETHANESULFONATEEDS经过4天的处理可能耗尽睾丸间质细胞。我们选择三组成年大鼠，分别为正常组、模型组、细胞组。模型组和细胞组的大鼠接种EDS，4DAY后1X106的CD51阳性睾丸间质干细胞被注入细胞组老鼠中。移植后第10天时测量血清中睾酮浓度。结果如图7所示，CD51阳性睾丸间质干细胞在睾丸内明显促进睾酮的分泌。0045尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。说明书CN104212763A1/5页8图1说明书附图CN104212763A2/5页9图2图3说明书附图CN104212763A3/5页10图4说明书附图CN104212763A104/5页11图5说明书附图CN104212763A115/5页12图6图7说明书附图CN104212763A12。