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1、10申请公布号CN104211815A43申请公布日20141217CN104211815A21申请号201410464802822申请日20140912C07K19/00200601C12N15/62200601C12N15/70200601C12N1/21200601C12P21/02200601A61K47/42200601A61P35/0020060171申请人华东理工大学地址200237上海市徐汇区梅陇路130号72发明人曹旭妮黄雅佩黄培森沈阳74专利代理机构上海科盛知识产权代理有限公司31225代理人蒋亮珠54发明名称一种铁蛋白重链亚基纳米载药系统及其制备方法与应用57摘要本发明公。
2、开了一种表皮生长因子铁蛋白重链亚基蛋白的衍生蛋白，即表皮生长因子5半胱氨酸铁蛋白重链亚基蛋白EGF5CYSFTH1，其氨基酸序列如序列表中SEQIDNO1所示。本发明还公开了一种铁蛋白重链亚基纳米载药系统DOX/EGF5CYSFTH1，其采用所述EGF5CYSFTH1蛋白作为药物载体通过交联剂含马来酰亚胺酰肼的三氟乙酸盐与阿霉素连接，可以特异性地在富含EGFR的肿瘤细胞表面富集。所述纳米载药系统提高了载药量，有望在制造抗肿瘤药物，特别是在抗乳腺癌药物中有所应用。51INTCL权利要求书1页说明书12页附图2页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书12页附图2页10。
3、申请公布号CN104211815ACN104211815A1/1页21一种表皮生长因子铁蛋白重链亚基蛋白的衍生蛋白，其特征在于，所述的衍生蛋白为表皮生长因子铁蛋白重链亚基蛋白中间插有5个半胱氨酸，即为表皮生长因子5半胱氨酸铁蛋白重链亚基蛋白，所述的衍生蛋白的氨基酸序列如序列表中SEQIDNO1所示；较佳地，编码所述的衍生蛋白的核苷酸序列如序列表中SEQIDNO2所示。2一种编码表皮生长因子铁蛋白重链亚基蛋白的衍生蛋白的DNA分子，其特征在于，所述DNA分子编码如序列表中SEQIDNO1所示的氨基酸序列；较佳地，所述DNA分子的核苷酸序列如序列表中SEQIDNO2所示。3一种含有如权利要求2所述。
4、的DNA分子的核苷酸序列的表达载体；较佳地，所述的表达载体的空质粒为PET28A。4一种含有如权利要求2所述的DNA分子的核苷酸序列的基因工程菌；较佳地，所述的基因工程菌含有如权利要求3所述的表达载体；较佳地，所述的基因工程菌的宿主细胞为大肠埃希氏菌ECOLIBL21DE3。5一种如权利要求1所述的衍生蛋白的制备方法，其特征在于，所述的制备方法包括培养含有如权利要求3所述的表达载体的转化体，分离纯化培养物得到所述的衍生蛋白；较佳地，所述的转化体为如权利要求4所述的基因工程菌。6一种铁蛋白重链亚基纳米载药系统，其特征在于，所述的铁蛋白重链亚基纳米载药系统采用如权利要求1所述的衍生蛋白作为药物载体。
5、。7如权利要求6所述的铁蛋白重链亚基纳米载药系统，其特征在于，所述的铁蛋白重链亚基纳米载药系统还包括含羰基的药物，所述的衍生蛋白和所述的含羰基的药物通过交联剂连接；较佳地，所述的含羰基的药物为阿霉素；更佳地，所述的交联剂为含马来酰亚胺酰肼的三氟乙酸盐。8一种铁蛋白重链亚基纳米载药系统的制备方法，其特征在于，所述的制备方法包括以下的步骤交联剂含马来酰亚胺酰肼的三氟乙酸盐与阿霉素反应形成化合物A，所述的化合物A与如权利要求1所述的衍生蛋白连接。9如权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述连接的PH条件为6575；所述连接中，所述的化合物A与所述的衍生蛋白用量的摩尔比为12401，较佳地为1201。
6、。10如权利要求67任一项所述的铁蛋白重链亚基纳米载药系统在制备抗肿瘤细胞的药物中的应用；较佳地，所述的药物为抗乳腺癌的药物；较佳地，在制备抗耐药株肿瘤细胞的药物中的应用；更佳地，所述的耐药株肿瘤细胞为MCF7/ADR细胞。权利要求书CN104211815A1/12页3一种铁蛋白重链亚基纳米载药系统及其制备方法与应用技术领域0001本发明属于生物制药领域，具体涉及一种铁蛋白重链亚基纳米载药系统及其制备方法与应用。背景技术0002纳米材料的特性使其在肿瘤诊断分析方面具有许多优势，将纳米技术与生物医学领域相结合已成为纳米技术领域中发展最为迅速的研究领域之一。0003铁蛋白作为天然蛋白具有高度的生物。
7、安全性，且铁蛋白作为笼状蛋白能够自行组装成天然构象为其作为纳米载药载体提供基础。近年来的研究表明，小尺寸的纳米粒子能够更深入地进入实体肿瘤组织当中，这使得铁蛋白纳米粒子引起人们更多的关注。0004另外，研究结果XULI，LIHUIQIU，XUNICAOETAL，EPIDERMALGROWTHFACTORFERRITINHCHAINPROTEINNANOPARTICLESFORTUMORACTIVETARGETING”SMALL2012，8，NO16，25052514也表明表皮生长因子EGF铁蛋白重链亚基FTH1纳米粒子EGFFTH1由于其表面的EGF能有效地与许多肿瘤细胞表面过表达的EGFR结。
8、合，使其在体内能富集于肿瘤组织。0005但是，纳米粒子EGFFTH1由于无法直接与药物连接来组成载药系统而直接作用于肿瘤细胞表面，目前仍然没有关于纳米粒子EGFFTH1作为载药系统的应用或报道。发明内容0006本发明克服现有纳米粒子EGFFTH1粒径较小，缺乏合适的高载药物的载药技术而难以直接应用到药物载体的缺陷，提供一种表皮生长因子EGF铁蛋白重链亚基FTH1蛋白的衍生蛋白，即表皮生长因子5半胱氨酸铁蛋白重链亚基蛋白EGF5CYSFTH1蛋白，并将其通过交联剂连接药物，形成铁蛋白重链亚基纳米载药系统。0007现有的EGFFTH1由于其表面的EGF能有效地与许多肿瘤细胞表面过表达的EGFR结合。
9、，能够与肿瘤细胞，特别是与EGFR高表达的肿瘤细胞相结合，说明EGFFTH1有应用于载药系统的前景，但是由于其粒径较小，缺乏合适的高载药物的载药技术，故发明人考虑到应用交联剂来尝试连接。0008具有EGFR高表达的肿瘤细胞的癌症有乳腺癌、肺癌、肝癌、胃癌等，目前，可以广谱地抑制或者治疗这些癌症的药物有顺铂、紫杉醇、阿霉素等，综合考虑所构建药物载体的药代动力学特性、毒副作用和逆转肿瘤细胞耐药性的前景，选取了经典药物阿霉素作为载药系统中的被载药物。0009由于阿霉素含有羰基，故发明人希望交联剂一方面可以与药物的羰基相连接，一方面还可以与EGFFTH1相连接。交联剂含马来酰亚胺酰肼的三氟乙酸盐NMA。
10、LEIMIDOCAPROICACIDHYDRAZIDE，TRIFLUOROACETICACIDSALTEMCH的一端为酰肼可与羰基反应形成稳定的腙键；而另一端为马来酰亚胺，可与游离巯基反应形成稳定的硫醚键。腙键在低PHPH5的条件下会断裂，而肿瘤细胞的溶酶体恰可满足这一PH说明书CN104211815A2/12页4条件，这也就意味着使用交联剂EMCH与阿霉素连接可以在药物进入肿瘤细胞时腙键发生断裂，从而可以达到药物可控释放、针对目标肿瘤细胞进行靶向定位的目的，故选择交联剂EMCH。0010由此，发明人考虑需要对纳米粒子EGFFTH1进行修饰，使其衍生蛋白含有巯基而与交联剂EMCH相连接。发明人。
11、经反复试验筛选后发现，EDF与FTH1亚基之间能够插入含有巯基的天然氨基酸，较佳地如半胱氨酸。而半胱氨酸插入数目的选择也需要筛选半胱氨酸数目的减少会导致巯基位点数目的减少并减少载药量；而半胱氨酸数目过多，如9个，则会使EGFCYSFTH1蛋白内部形成二硫键，破坏其空间构型，使其难以保持稳定性，故发明人最后选择插入5个半胱氨酸的EGF5CYSFTH1蛋白，这样每个EGF5CYSFTH纳米粒子可以提供120个巯基位点，以实现对药物的高载。0011由此，本发明提供一种表皮生长因子铁蛋白重链亚基蛋白的衍生蛋白，所述衍生蛋白为表皮生长因子铁蛋白重链亚基蛋白中间插有5个半胱氨酸，即为表皮生长因子5半胱氨酸。
12、铁蛋白重链亚基蛋白EGF5CYSFTH1，所述的EGF5CYSFTH1蛋白的氨基酸序列如序列表中SEQIDNO1所示。0012较佳地，为了更好地构建质粒表达载体进行转化并适用于本发明，编码所述的EGF5CYSFTH1蛋白的核苷酸序列如序列表中SEQIDNO2所示。0013本发明还提供一种编码所述的EGF5CYSFTH1蛋白的DNA分子，所述DNA分子编码如序列表中SEQIDNO1所示的氨基酸序列。0014较佳地，为了更好地构建质粒表达载体进行转化并适用于本发明，所述DNA分子的核苷酸序列如序列表中SEQIDNO2所示。并且，本领域的技术人员都清楚，编码如序列表中SEQIDNO1所示的氨基酸序列。
13、的DNA分子中的核苷酸可以为了适应不同的表达载体或转化体等进行替换或修饰。0015本发明还提供一种含有上述如序列表中SEQIDNO2所示的核苷酸序列的表达载体。0016所述的表达载体的空质粒可以为本领域常规的表达载体的空质粒，较佳地，由于便于获得和试验操作，所述的空质粒为PET28A，由此得到的表达载体为PET28A/EGF5CYSFTH1。0017本发明还提供一种含有编码所述的EGF5CYSFTH1蛋白的DNA分子的核苷酸序列的基因工程菌。0018所述基因工程菌中的宿主细胞可以选用本领域常规的宿主细胞；较佳地，由于便于获得和试验操作，所述基因工程菌的宿主细胞为大肠杆菌；更佳地为大肠埃希氏菌E。
14、COLIBL21DE3。0019较佳地，所述的基因工程菌含有编码所述的EGF5CYSFTH1蛋白的DNA分子的核苷酸序列的表达载体，例如上述的PET28A/EGF5CYSFTH1，得到的基因工程菌为ECOLIBL21DE3/PET28A/EGF5CYSFTH1。0020所述基因工程菌的接种量为本领域常规的接种量；较佳地，所述基因工程菌的接种量与培养基的体积比为1100。0021本发明提供一种所述的EGF5CYSFTH1蛋白的制备方法，所述的制备方法包括培养所述的含有编码所述的EGF5CYSFTH1蛋白的DNA分子的核苷酸序列的表达载体的转说明书CN104211815A3/12页5化体，分离纯化。
15、培养物得到所述的EGF5CYSFTH1蛋白。0022较佳地，所述的转化体为所述的含有编码所述的EGF5CYSFTH1蛋白的DNA分子的核苷酸序列的基因工程菌，例如本发明上述ECOLIBL21DE3/PET28A/EGF5CYSFTH1。0023本发明提供一种铁蛋白重链亚基纳米载药系统，其采用本发明所述的EGF5CYSFTH1蛋白作为药物载体。0024所述的铁蛋白重链亚基纳米载药系统还包括含羰基的药物；所述的EGF5CYSFTH1蛋白和所述的含羰基的药物通过交联剂连接。较佳地，所述交联剂可以一端与含羰基的药物且另一端与所述的EGF5CYSFTH1蛋白连接。0025较佳地，所述含羰基的药物为阿霉素。
16、DOX。0026更佳地，所述的交联剂为含马来酰亚胺酰肼的三氟乙酸盐EMCH。当然，基于本发明的发明构思，其他符合一端可以与含羰基的药物连接，并且另一端与所述的衍生蛋白的巯基相连接的双功能交联剂也可以运用到载药系统的制备中来。0027更佳地，所述的铁蛋白重链亚基纳米载药系统为阿霉素与所述的EGF5CYSFTH1蛋白通过交联剂EMCH连接，得DOX/EGF5CYSFTH1纳米载药系统。0028本发明提供一种铁蛋白重链亚基纳米载药系统的制备方法，包括以下的步骤所述的交联剂EMCH与所述的DOX连接形成化合物A，所述化合物A为EMCHDOX；所述的化合物A与所述的EGF5CYSFTH1蛋白连接即得。所。
17、述化合物A的制备方法可以参见WILLNER，DETAL，6MALEIMIDOCAPROYLHYDRAZONEOFDOXORUBICINANEWDERIVATIVEFORTHEPREPARATIONOFIMMUNOCONJUGATESOFDOXORUBICINBIOCONJUGCHEM1993，4，521527。0029较佳的，所述连接的PH条件为6575；所述连接中，所述的化合物A与所述的EGF5CYSFTH1蛋白的用量的摩尔比为12401，较佳地为1201。所述连接的溶剂为常规的缓冲溶液，如PBS等；所述连接的温度为465；所述连接的时间为124小时。0030所述的EGF5CYSFTH1蛋白。
18、由于热稳定性极好，在65依然可以进行连接反应。0031发明人经实验发现，当所述的化合物A与所述的EGF5CYSFTH1蛋白的用量的摩尔比为小于11时，化合物A数量过少，连接效率过低，而所述的化合物A与所述的EGF5CYSFTH1蛋白的用量的摩尔比大于2401时，会极大地增加制备成本。当两者摩尔比为1201时，能够达到较佳的连接效果，同时成本比较合理。0032发明人经实验发现，PH65或者75时，连接反应副反应比较严重，所述的化合物A与巯基连接的效率较低。0033本发明提供所述的铁蛋白重链亚基纳米载药系统在制备抗肿瘤的药物中的应用。0034较佳地，所述的药物为抗乳腺癌的药物。0035较佳地，在制。
19、备抗耐药株肿瘤细胞药物中的应用。0036更佳地，所述的耐药株肿瘤细胞为乳腺癌MCF7/ADR细胞。0037在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。0038本发明所用试剂和原料均市售可得。0039本发明的积极进步效果在于以纳米粒子EGFFTH1为载体通过交联剂EMCH构建说明书CN104211815A4/12页6靶向药物，可以使药物富集在药物所作用的组织上；由于EMCH的酰肼与药物的羰基形成的腙键在低PH条件下能够断裂，从而释放药物，所以应用本发明所述的药物载体可以实现药物的可控释放；在EGFFTH1亚基中插入5个含巯基的半胱氨酸，这样每个纳米粒子将提供120。
20、个巯基位点，以实现对药物的高载药量；本发明所述的载药系统对耐药株细胞抑制作用明显，有望在制造抗肿瘤多药耐药性的药物中有所应用。附图说明0040图1为制备的EGF5CYSFTH1蛋白透射电镜图。0041图2DOX/EGF5CYSFTH1的SDSPAGEA荧光检测图B考马斯亮蓝染色图。泳道1，EGF5CYSFTH1纳米粒子8G；泳道2，DOX/EGF5CYSFTH1纳米粒子20G。0042图3为制备的DOX/EGF5CYSFTH1纳米给药系统用于MCF7/ADR细胞48小时后存活率的折线图。具体实施方式0043下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列。
21、实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。0044实施例1构建PET28A/EGF5CYSFTH1工程表达菌00451、将编码EGFFTH1蛋白的核苷酸序列插入PET28A质粒上的NCOI和NOTI多克隆位点之间，得到PET28A/EGFFTH1，具体可参见XULI，LIHUIQIU，XUNICAOETAL，EPIDERMALGROWTHFACTORFERRITINHCHAINPROTEINNANOPARTICLESFORTUMORACTIVETARGETING，SMALL2012，8，NO16，25052514。然后设计一对反向引物，在EGFFTH1之间插入。
22、5个半胱氨酸，见表1。0046表10047引物名称序列53引物FTGCGGTTCTTGCGGTTCTTGCGGTTCTTGCGGTTCTTGCGTTAACATGACGACCGCGTCCACCTCGC引物RGAATTCGCGCAGTTCCCACCACTT0048编码所述的EGF5CYSFTH1蛋白的核苷酸序列如序列表中SEQIDNO2所示；所述引物的核苷酸序列如序列表中SEQIDNO3引物F和SEQIDNO4引物R所示；0049将表1中所述的引物引物F和引物R稀释到10PMOL，并将模板PET28A/EGFFTH1质粒浓度调整为50NG/L，进行IPCRKODPLUSMUTAGENESISKIT。
23、，TOYOBOCO，LTD，即得IPCR产物PET28A/EGF5CYSFTH1。00502、用DPNI酶对PCR产物进行消化，并使PCR产物自身环化。取出DH5感受态细胞购自天根生化公司100L，冰浴溶解；取上述自身环化产物10L，加入感受态细胞中，轻轻混匀，冰浴放置30MIN；42，30S热休克，冰浴放置5MIN。加入SOC培养基900L，37振荡培养2H。取100L涂布于含卡那霉素KANAMYCIN的LB平板，室温正放05H；说明书CN104211815A5/12页7倒置于37的CO2培养箱培养16H以上。00513、每个固体LB平板上随机挑选单菌落5个，分别加入到含KANAMYCIN的。
24、新鲜LB培养基10ML中，并做记号。放37恒温箱振荡过夜；取8ML已过夜振荡培养的LB培养基离心20MIN，速度5500RPM，获得菌体。00524、用天根生化公司的高纯度小提中量试剂盒提取质粒对已提取的质粒进行HINCII酶酶切验证取5L提取的质粒加入ECOLIBL21DE3感受态细胞中购自天根生化公司，轻轻混匀后，放置冰上30MIN。42水浴90S，再冰上静置5MIN。加入900L的无菌SOC培养基，混匀放置37摇床2H。1000RPM离心5MIN，吸出800L的上清液。重悬剩下的菌液并均匀涂布于含50NG/LKANAMYCIN的LB固体平板上。室温放置05H，待全部的菌液被吸收完，将平板。
25、倒置37培养箱过夜。0053即获得转化PET28A/EGF5CYSFTH1工程表达菌ECOLIBL21DE3/PET28A/EGF5CYSFTH1，所述工程表达菌表达的EGF5CYSFTH1蛋白的氨基酸序列如序列表中SEQIDNO1所示。0054实施例2EGF5CYSFTH1目标蛋白的制备00551、从转化了质粒的LB固体培养基上随机挑选饱满的单菌落，加入含50NG/L卡那霉素的新鲜LB液体培养基中，37摇菌过夜进行活化。然后以1100的体积比例加入50ML新鲜LB培养基中进行扩培。待菌液的OD值至06时，加入1MM的诱导剂IPTG，诱导过夜，离心收集菌体。00562、往菌体加入1015ML的。
26、重悬液A重悬液A含50MMPBS磷酸盐缓冲液、150MMNACL，PH79进行细胞超声破碎。破碎条件为按超声破碎仪工作1S、间歇LS的顺序反复循环30MIN，功率300W。破碎完毕后12000RPM下离心10MIN，收集菌体沉淀。加入洗涤液洗涤液50MMTRIS，50MMNACL，1MMEDTA乙二胺四乙酸，1TRITON100C34H62O11，PH79洗涤所得的包涵体4次，即得到较纯的包涵体。00573、洗涤之后，研碎包涵体，加入变性液变性液50MMTRIS，1MMEDTA，8M尿素，10MMDTT二硫苏糖醇，PH79重悬洗涤后的包涵体，置于28的摇床中过夜使包涵体变性溶解。变性好的包涵体。
27、用变性液稀释到终浓度为01MG/ML，体积为50ML。随后置于透析袋中，于4下浸没于复性液16中逐步透析，每隔6小时更换一次复性液，每次更换的复性液配方见表2。待复性结束之后，过滤收集复性后的蛋白溶液，用50KD的超滤管超滤浓缩蛋白溶液，即获得EGF5CYSFTH1目标蛋白，所述目标蛋白的透射电镜如图1所示。0058表2复性液的配方0059说明书CN104211815A6/12页800600061实施例3交联剂EMCH与阿霉素DOX的连接00621、取12MG的DOX与19MG的EMCH粉末混合后溶解在35ML的甲醇溶液中，待DOX与EMCH的粉末完全溶解后在混合溶液中加入1L的三氟乙酸，用磁。
28、力搅拌器在室温条件下避光搅拌24小时。00632、对反应液减压分批蒸馏，水温调节为31，减压蒸馏至溶液总体积为150L时在溶液中加入25ML的乙腈并放入4冰箱使之结晶48小时。结晶过程完成后8000RPM转速离心2MIN，去除上清液，用含05ML甲醇和5ML乙腈的混合溶液洗涤沉淀两次。最后在室温条件下真空干燥至湿润的产物变为干燥的粉末状，即得到EMCHDOX化合物。对EMCHDOX化合物进行了鉴定，鉴定数据如下由核磁共振氢谱检测可知，NMRCD3OD794BD，1H，782T，1H，755D，1H，678S，2H，548S，1H，507T，1H，459D，1H，421M，1H，402S，3H，。
29、363330M，5H，255226M，4H，219188M，3H，169118M，12H；MSMH751，说明确实合成了EMCHDOX化合物。0064所述的EMCHDOX化合物的分子结构式为0065说明书CN104211815A7/12页90066实施例4EMCHDOX与EGF5CYSFTH1的连接00671、用DMSO溶解EMCHDOX粉末化合物使浓度为10G/L；配置PBS缓冲液A含有01M磷酸钠，015MNACL，调节PH为72。00682、每1MGEGF5CYSFTH1蛋白与130GEMCHDOX反应，化合物EMCHDOX与EGF5CYSFTH1蛋白的摩尔比为1201计算方法0069M。
30、OLEMCHDOX130G751G/MOL17107MOL，0070MOLEGF5CYSFTH11MG703KD14109MOL，0071MOLEMCHDOX/MOLEGF5CYSFTH11201。0072将EMCHDOX溶液加入蛋白中后避光4反应过夜反应得到反应液；将反应液倒入15ML的超滤管中，3500RPM下超滤浓缩68MIN，将游离的小分子EMCHDOX化合物除去。重复该步骤多次直至流出液澄清无颜色。00733、将得到的产物进行SDSPAGE凝胶电泳，电泳跑完后立刻在紫外下拍摄荧光条带，再用考马斯亮蓝将胶染色，脱色后观察在荧光条带位置是否有蛋白条带，其结果如图2所示，因为蛋白条带与荧光。
31、条带位置一致，可以判断DOX与EGF5CYSFTH1蛋白连接成功。即DOX/EGF5CYSFTH1载药系统构建完成。然后分别采用考马斯亮蓝法测定蛋白浓度和吸光光度法测定连接的阿霉素药物的浓度，可计算出该载药系统的载药量为72MOL/MOL纳米载药系统，即每1MOLDOX/EGF5CYSFTH1载药系统可以承载72MOL的DOX。0074实施例5DOX/EGF5CYSFTH1纳米载药系统的药效分析00751、将长至所需数量的MCF7/ADR癌细胞购自NANJINGKEYGENBIOTECHCO，LTD胰蛋白酶消化计数后以1104个细胞每孔的浓度接种于96孔板，每孔100L；加入无菌的PBS缓冲液。
32、以保证孔的温度和湿度，在37、5CO2培养箱中培养过夜使细胞贴壁。00762、将10FBS1640培养基吸出，换入新鲜的含不同浓度药物的培养基，每个浓度需设3个孔的重复；将游离阿霉素与DOX/EGF5CYSFTH1纳米载药系统分别配置成001G/MNL、01G/ML、02G/ML、05G/ML、1G/MNL、2G/ML、5G/ML、10G/ML和20G/ML的浓度，每孔100L加入96孔板；此外设置3个空白孔作为调零点、3个纯细胞孔作为阴性对照，所有药物加入后37、5CO2培养箱中培养48小时。00773、48小时后在每孔中加入20L5MG/ML的MTT34，5二甲基噻唑22，5二苯基四氮唑溴。
33、盐工作液，然后继续37孵育4个小时。00784、孵育完成后小心吸去孔中所有上清液；然后加入150L二甲基亚砜液体，室温条件放置于水平摇床上慢摇10MIN，将孵育后孔底形成的蓝紫色结晶甲臜沉淀溶解。说明书CN104211815A8/12页1000795、使用酶标仪490NM处检测各孔吸光值，记录数据，并以DOX的浓度为横坐标，细胞存活率为纵坐标绘制标准曲线，结果如图3所示。采用游离的阿霉素和DOX/EGF5CYSFTH1纳米载药系统相比较在细胞存活率上具有显著的差异P005。0080结果显示DOX/EGF5CYSFTH1载药系统较DOX对MCF7/ADR细胞具有更强的杀死作用。0081应理解，在阅读了本发明的上述内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。0082说明书CN104211815A109/12页110083说明书CN104211815A1110/12页120084说明书CN104211815A1211/12页130085说明书CN104211815A1312/12页14说明书CN104211815A141/2页15图1图2说明书附图CN104211815A152/2页16图3说明书附图CN104211815A16。