一株费氏丙酸杆菌菌株及其发酵生产细菌素的方法.pdf

本发明涉及一株费氏丙酸杆菌菌株及其发酵生产细菌素的方法，属于工业微生物技术领域。包括：（1）以Propionibacterium freudenreichii subsp.shermanii作为出发菌株，将其进行原生质体诱变筛选得到一株突变菌株，其分类命名为Propionibacterium freudenreichii CS1420，其保藏编号为CCTCC NO:M 2015050。（2）提供一种通过调节pH来提高新菌株Propionibacterium freudenreichii CS1420产细菌素产量及抑菌活性的新方法。本发明的新菌株Propionibacterium freudenreichii CS1420为安全菌株，该菌株在一定条件下发酵后，发酵液细菌素含量高，可作为天然防腐剂应用于食品和饲料工业中。

1.  一株费氏丙酸杆菌菌株，其特征在于，其分类命名为Propionibacterium freudenreichii CS1420，保藏编号为CCTCC NO: M 2015050。

2.  一种利用权利要求1所述的Propionibacterium freudenreichii CS1420发酵生产细菌素的方法，其特征在于，包括如下步骤：
1) 种子培养
将Propionibacterium freudenreichii CS1420单菌落接种至改良PYG培养基中活化，30℃厌氧培养2.5天；
2）发酵培养
将上述步骤1）得到的种子液按照10%接种量接入改良PYG培养基中，30℃，厌氧培养8天，培养基初始pH为5.5-7.5。

3.  根据权利要求2所述的Propionibacterium freudenreichii CS1420发酵生产细菌素的方法，其特征在于，其在步骤2）后还包括如下步骤：
将步骤2）发酵培养后的发酵液在4℃、6000r/min的条件下离心15min，取上清液，用10% NaOH调至pH7.0，再用10%酒石酸调至pH5.1-5.9，取200uL进行抑菌效果测定。

4.  根据权利要求2所述方法，其特征在于，所述步骤2）中，改良PYG培养基最适初始pH为6.0。

5.   根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤2）中改良PYG培养基的配方为：酪蛋白胨 5.0g，蛋白胨5.0 g，酵母提取物 10.0 g，牛肉提取物5.0 g，葡萄糖5.0 g，K₂HPO₄ 2.0 g， 吐温80 1.0 ml，刃天青 1.0 ml，盐溶液40.0 ml，蒸馏水 950.0 ml，氯化血红素溶液10.0 ml，维生素K₁溶液 0.2 ml，L-半胱氨酸 0.5 g，pH 7.2 ；所述的盐溶液配方为：CaCl₂·2H₂O 0.25g， MgSO4·7H₂O 0.5 g，K₂HPO₄ 1.0 g，KH₂PO₄ 1.0 g， NaHCO₃ 10.0g，NaCl2.0g，蒸馏水 1.0L；所述的氯化血红素溶液：氯化血红素 50.0 mg， 1N NaOH 1.0 ml，蒸馏水 99.0 ml；所述的维生素K₁溶液：维生素K₁  0.1 ml，95%乙醇 20.0 ml。

6.  根据权利要求3所述方法，其特征在于，所述的上清液先用10% NaOH调至pH7.0，再用10%酒石酸调至pH5.5。

一株费氏丙酸杆菌菌株及其发酵生产细菌素的方法
技术领域
本发明涉及一株费氏丙酸杆菌菌株及其发酵生产细菌素的方法，属于工业微生物技术领域。
背景技术
丙酸杆菌广泛存在于自然界中。早在1909年，Orla-Jensen详细地描述了丙酸杆菌属，并将其按照栖息地分为两大类，来源于人体皮肤的痤疮型丙酸杆菌、和来源于奶制品的乳品丙酸杆菌 。
乳品丙酸杆菌主要包括丙酸丙酸杆菌、费氏丙酸杆菌、詹氏丙酸杆菌、特氏丙酸杆菌。是从乳制品、青贮饲料中分离出来的无致病性的一类丙酸杆菌，现在食品工业中主要用于生产丙酸、维生素B₁₂、叶酸、乳品发酵剂等。另外，乳品丙酸杆菌在代谢过程中会合成特殊的肽或蛋白质，这类物质（细菌素）是丙酸杆菌产生的异型抑菌物质，有很好的特性，比如：其具有广泛的抑菌作用，且抑菌效果优于苯甲酸钠、山梨酸钾等常见的化学防腐剂，所以，丙酸杆菌细菌素在食品防腐保鲜中具有很好的应用前景。目前，法国罗地亚公司已经开发得到一种含有丙酸杆菌细菌素的新型生物防腐剂，得到了美国FDA的批准，已在美国和欧洲市场上销售。国内关于丙酸杆菌细菌素生产防腐剂仍处于实验室研究阶段。
Propionicin PLG-1、GBZ-1、Propionicin T1、Propionicin SM1、Jenseniin G、PAMP、Thoeniicin 447等都是先后被发现的乳品丙酸杆菌细菌素。其中Propionicin PLG-1是第一个被发现的由乳品丙酸杆菌产生的细菌素，它是由P.thoenii P127产生的，其分子量为9328u，在pH3-9之间有活性，能有效抑制特氏丙酸杆菌、丙酸丙酸杆菌和詹氏丙酸杆菌以及一些乳酸菌、酵母和霉菌；Propionicin T1是由P.thoenii419菌株产生的细菌素，具有较好的耐酸性，能抑制亲缘关系相近的詹氏丙酸杆菌、丙酸丙酸杆菌和一些乳杆菌；Propionicin SM1是由P.jensenii DF1产生的细菌素，pH值为3-9时均具有活性，其对真菌具有很强的抑制作用；Jenseniin G是由P.thoenii(jensenii)P126产生的，pH值在3-12时具有活性，它能抑制其它一些丙酸杆菌和乳杆菌。可见，丙酸杆菌细菌素都是在其最适pH范围内有活性。Coventry等人、Liu W 等人的研究表明，Nisin也是在最适pH范围内有活性。有研究也表明，细菌素发酵的产量和效价与培养基pH密切相关。
发明内容
本发明的一个目的是提供一株费氏丙酸杆菌CS1420（Propionibacterium freudenreichii CS1420），为了实现上述发明目的，本发明的技术方案为：
本发明以Propionibacterium freudenreichii subsp.shermanii（购于中国微生物菌种保藏中心）作为出发菌株，将其进行原生质体诱变筛选得到一株突变菌株，其分类命名为Propionibacterium freudenreichii CS1420，其保藏编号为CCTCC NO:M 2015050。
本发明所述的原生质体诱变筛选得到丙酸杆菌的具体方法为：
1、原生质体的制备
将已活化好的丙酸杆菌Propionibacterium freudenreichii subsp.shermanii挑取一环接种到液体培养基中，30℃厌氧培养2d。将发酵液于6000r/min、4℃条件下离心15min后弃去上清液，用PFB缓冲液洗涤菌泥两次后将菌泥重悬于PFB缓冲液中，并调整菌体浓度为10⁸cfu/mL。向菌悬液中加入溶菌酶和变溶菌素，使其浓度分别为20mg/mL和15ug/mL，于37℃条件下酶解2h去除细胞壁，之后离心将沉淀用PFB缓冲液冲洗终止反应，再次离心将原生质体重悬于PFB缓冲液中备用。
2、原生质体诱变育种
UV诱变：
取10mL已制备好的原生质体于直径为9cm的平皿中，在磁力搅拌器上进行搅拌，置于15W紫外灯下，距离25cm照射120s。期间每隔20s取诱变原生质体悬液1mL，结束后，在红灯下进行10倍系列稀释后分别取0.1mL涂布到再生平板上，用黑布包裹，置于30℃厌氧罐中厌氧培养4天。
亚硝基胍诱变：
取5等份原生质体悬液，加入一定量的亚硝基胍溶液，使混合液亚硝基胍终浓度分别为0.8 mg/mL、1.0 mg/mL、1.2 mg/mL、1.4 mg/mL、1.6mg/mL，30℃条件下震荡50min。期间，每隔10min取诱变原生质体0.1mL，加入反应液1000倍的4℃无菌生理盐水终止诱变反应，结束后，进行10倍系列稀释后分别取0.1mL涂布到再生平板上，置于30℃厌氧罐中厌氧培养4天。
3、高产菌株筛选
挑取诱变后平板上的单菌落于发酵培养基中进行发酵培养，将发酵液在4℃、6000r/min的条件下离心15min，取上清液，用10% NaOH调至pH7.0，再用10%酒石酸调至pH5.3，置于4℃保藏备用。
将灭菌平皿中先倒入一层培养基（素琼脂培养基），待凝固后，将牛津杯放置在平皿最中央培养基上，上层培养基中溶化并冷却至50℃左右时加入一定量的大肠杆菌菌液制成带菌琼脂，然后迅速倒在已冷却的底层培养基上，轻轻转动培养皿使其平铺，冷却后，吸取200uL上段所述调节pH后的发酵上清液于牛津杯中，盖上平皿盖于4℃静置3h，然后移入37℃培养箱中培养20h，再移入4℃静置3h，用直尺测量抑菌圈直径，挑取抑菌圈最大的菌株，并将其命名为费氏丙酸杆菌CS1420（Propionibacterium freudenreichii CS1420）。
本发明的另外一个目的是提供该菌株产细菌素的新方法。
二、一种本发明所述的Propionibacterium freudenreichii CS1420通过调节pH来提高该菌株产细菌素产量及抑菌活性的新方法。
具体包括以下步骤:
1) 种子培养：将Propionibacterium freudenreichii CS1420单菌落接种至改良PYG培养基中活化，30℃厌氧培养2.5天
2）发酵培养：将上述步骤1）得到的种子液按照10%接种量接入改良PYG培养中，30℃，厌氧培养8天。
3）抑菌效果的测定
将发酵液在4℃、6000r/min的条件下离心15min，取上清液，用10% NaOH调至pH7.0，再用10%酒石酸调至pH5.3， 取200uL加入3、高产菌株筛选中所述牛津杯中，盖上平皿盖于4℃静置3h，然后移入37℃培养箱中培养20h，再移入4℃静置3h，用直尺测量抑菌圈直径，抑菌圈直径越大，抑菌效果越好
所述步骤2）中通过调节pH来提高该菌株产细菌素产量的优选方案为：本发明将发酵培养用培养基的初始pH分别调整为5.5，6.0，6.5，7.0，7.5，进一步优选实施方案中，本发明使用pH6.0作为发酵培养基初始pH，在此条件下实现了Propionibacterium freudenreichii CS1420发酵生产细菌素产量的提高。
所述步骤3）中通过调节pH来提高细菌素活性的方案为：本发明取发酵培养后上清液，用10% NaOH调至pH7.0，再用10%酒石酸调至pH分别为5.1，5.3，5.5，5.7，5.9，进一步优选实施方案中，本发明用10%酒石酸调至pH5.5，在此条件下实现了Propionibacterium freudenreichii CS1420发酵生产细菌素活性的提高。
所述的改良PYG改良培养基为：酪蛋白胨 5.0g，蛋白胨5.0 g，酵母提取物 10.0 g，牛肉提取物5.0 g，葡萄糖5.0 g，K₂HPO₄ 2.0 g， 吐温80 1.0 ml，刃天青 1.0 ml，盐溶液40.0 ml，蒸馏水 950.0 ml，氯化血红素溶液10.0 ml，维生素K₁溶液 0.2 ml，L-半胱氨酸 0.5 g，pH 7.2。盐溶液：CaCl₂·2H₂O 0.25g，MgSO4·7H₂O 0.5 g，K₂HPO₄ 1.0 g，KH₂PO₄ 1.0 g， NaHCO₃ 10.0g，NaCl2.0g，蒸馏水 1.0L；氯化血红素溶液：氯化血红素 50.0 mg， 1N NaOH 1.0 ml，蒸馏水 99.0 ml；维生素K₁溶液：维生素K₁  0.1 ml，95%乙醇 20.0 ml。
本发明的有益效果在于：
本发明的Propionibacterium freudenreichii CS1420菌株安全性较高；该菌株在pH6.0改良PYG培养基中发酵培养后，发酵液抑菌圈直径达30mm，将此发酵液用10% NaOH调至pH7.0，再用10%酒石酸调至pH5.5，发酵液抑菌圈直径达35mm。且本发明所得的细菌素是一种安全的天然防腐剂，可直接用于食品和饲料工业中。
本发明的费氏丙酸杆菌菌株，其分类命名为Propionibacterium freudenreichii CS1420，于2015年1月20日提交中国典型培养物保藏中心（CCTCC），地址：中国. 武汉. 武汉大学，保藏编号为CCTCC NO:M 2015050。
具体实施方式
实施例1本发明菌株Propionibacterium freudenreichii CS1420的筛选方法
1、原生质体的制备
将已活化好的Propionibacterium freudenreichii subsp.shermanii调取一环接种到液体培养基中，30℃厌氧培养2d。将发酵液于6000r/min、4℃条件下离心15min后弃去上清液，用PFB缓冲液洗涤菌泥两次后将菌泥重悬于PFB缓冲液中，并调整菌体浓度为10⁸cfu/mL。向菌悬液中加入溶菌酶和变溶菌素，使其浓度分别为20mg/mL和15ug/mL,于37℃条件下酶解2h去除细胞壁，之后离心将沉淀用PFB缓冲液冲洗终止反应，再次离心将原生质体重悬于PFB缓冲液中备用。
2、原生质体诱变育种
UV诱变
取10mL已制备好的原生质体于直径为9cm的平皿中，在磁力搅拌器上进行搅拌，置于15W紫外灯下，距离25cm照射120s。期间每隔20s取诱变原生质体悬液1mL，结束后，在红灯下进行10倍系列稀释后分别取0.1mL涂布到再生平板上，用黑布包裹，置于30℃厌氧罐中厌氧培养4d。
亚硝基胍诱变
取5等份原生质体悬液，加入一定量的亚硝基胍溶液，使混合液亚硝基胍终浓度分别为0.8 mg/mL、1.0 mg/mL、1.2 mg/mL、1.4 mg/mL、1.6mg/mL，30℃条件下震荡50min。期间，每隔10min取诱变原生质体0.1mL，加入反应液1000倍的4℃无菌生理盐水终止诱变反应，结束后，进行10倍系列稀释后分别取0.1mL涂布到再生平板上，置于30℃厌氧罐中厌氧培养4d。
3、高产菌株筛选
挑取诱变后平板上的单菌落于发酵培养基中进行发酵培养，将发酵液在4℃、6000r/min的条件下离心15min，取上清液，用10% NaOH调至pH7.0，再用10%酒石酸调至pH5.3，置于4℃保藏备用。
将灭菌平皿中先倒入一层培养基（素琼脂培养基），待凝固后，将牛津杯放置在平皿最中央培养基上，上层培养基中溶化并冷却至50℃左右时加入一定量的大肠杆菌菌液制成带菌琼脂，然后迅速倒在已冷却的底层培养基上，轻轻转动培养皿使其平铺，冷却后，吸取200uL上段所述调节pH后的发酵上清液于牛津杯中，盖上平皿盖于4℃静置3h，然后移入37℃培养箱中培养20h，再移入4℃静置3h，用直尺测量抑菌圈直径，挑取抑菌圈最大的菌株，并将其命名为Propionibacterium freudenreichii CS1420。
实施例2本发明菌株产高产量细菌素的方法。
1) 种子培养：将Propionibacterium freudenreichii CS1420单菌落接种至改良PYG培养基中活化，30℃厌氧培养2.5d
2）发酵培养：将上述步骤1）得到的种子液按照10%接种量接入改良PYG培养中，30℃，厌氧培养8d。
3）抑菌效果的测定：将发酵液在4℃、6000r/min的条件下离心15min，取上清液，用10% NaOH调至pH7.0，再用10%酒石酸调至pH5.3， 取200uL加入实施例1中高产菌株筛选中所述的牛津杯中，盖上平皿盖于4℃静置3h，然后移入37℃培养箱中培养20h，再移入4℃静置3h，用直尺测量抑菌圈直径，抑菌圈直径越大，抑菌效果越好。
为了进一步提高突变菌株Propionibacterium freudenreichii CS1420产细菌素的产量，将所诉步骤2）中改良PYG培养基pH分别调至5.5，6.0，6.5，7.0，7.5进行发酵培养，发酵液抑菌效果测定（抑菌圈）结果分别为27mm、30mm、28mm、27mm、26mm，这表明培养基pH对丙酸杆菌产细菌素有很大影响，最适的pH为6.0。
实施例3本发明菌株产高活性细菌素方法。
1) 种子培养：将Propionibacterium freudenreichii CS1420单菌落接种至改良PYG培养基中活化，30℃厌氧培养2.5d
2）发酵培养：将上述步骤1）得到的种子液按照10%接种量接入改良PYG培养基中，pH6.0，30℃，厌氧培养8d。
3）抑菌效果的测定：将发酵液在4℃、6000r/min的条件下离心15min，取上清液，用10% NaOH调至pH7.0，再用10%酒石酸调至pH5.3， 取200uL加入实施例1高产菌株筛选中所述牛津杯中，盖上平皿盖于4℃静置3h，然后移入37℃培养箱中培养20h，再移入4℃静置3h，用直尺测量抑菌圈直径，抑菌圈直径越大，抑菌效果越好。
为了进一步提高细菌素的活性，所述步骤3）中先用10% NaOH调至pH7.0，再用10%酒石酸调至pH分别为5.1，5.3，5.5，5.7，5.9，抑菌效果测定（抑菌圈）结果分别为30mm、31mm、35mm、32mm、30mm。这表明当用10%酒石酸将pH调至5.5时，会提高抗菌代谢物细菌素的活性。