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1、10申请公布号CN104212896A43申请公布日20141217CN104212896A21申请号201410445480222申请日20140903C12Q1/68200601C12Q1/04200601C12N15/1120060171申请人中国烟草总公司黑龙江省公司牡丹江烟草科学研究所地址157011黑龙江省牡丹江市爱民区西地明街425号72发明人万秀清乔婵李若李丽杰王春军元野贺国强颜培强李尊强郭思达孙宏伟焦玉生李恒全邱恩建刘德育陈荣平黄磊张海霞刘伟魏继承74专利代理机构北京正理专利代理有限公司11257代理人赵晓丹54发明名称一种烟草角斑病菌的分子鉴定引物及鉴定方法57摘要本发明公。
2、开了一种烟草角斑病菌的分子鉴定引物及鉴定方法。该烟草角斑病菌的分子鉴定引物如序列表SEQIDNO1至SEQIDNO2所示，其中，序列SEQIDNO1为鉴定烟草角斑病菌的上游引物，序列SEQIDNO2为鉴定烟草角斑病菌的下游引物。本发明所述烟草角斑病菌分子鉴定引物可以特异性鉴定烟草角斑病病菌。此外，本发明还提供了可靠、特异性强、灵敏度高的烟草角斑病菌快速分子鉴定的方法。51INTCL权利要求书1页说明书4页序列表2页附图2页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书4页序列表2页附图2页10申请公布号CN104212896ACN104212896A1/1页21一组烟草角。
3、斑病菌的分子鉴定引物，其特征在于，该引物如序列表SEQIDNO1至SEQIDNO2所示，其中，序列SEQIDNO1为鉴定烟草角斑病菌的上游引物，序列SEQIDNO2为鉴定烟草角斑病菌的下游引物。2一种烟草角斑病菌的鉴定方法，其特征在于，该方法包括以下步骤1烟草角斑病菌分离培养；2PCR扩增；其中，PCR扩增时的引物为序列SEQIDNO1所示的用于鉴定烟草角斑病菌的上游引物，序列SEQIDNO2所示的用于鉴定烟草角斑病菌的下游引物；3PCR扩增产物分离及结果判别。3根据权利要求2所述的鉴定方法，其特征在于，烟草角斑病菌分离培养的具体步骤为用灭菌的剪刀将烟草角斑病疑似病叶病斑剪下，消毒后置于LB固。
4、体培养基中25培养23天，收集病斑周围长出的细菌菌落于无菌的LB液体培养基中，混匀后，吸取菌液涂LB固体平板，25培养23天，挑取单菌落于LB液体培养基中，25培养，用于PCR检测，或者直接用灭菌牙签蘸取单菌落用于PCR检测。4根据权利要求2所述的鉴定方法，其特征在于，PCR扩增产物分离及结果判别的具体步骤为将PCR扩增产物用15琼脂糖电泳分离，于紫外分析仪中根据扩增产物的大小判定结果。权利要求书CN104212896A1/4页3一种烟草角斑病菌的分子鉴定引物及鉴定方法技术领域0001本发明涉及一种烟草角斑病菌的分子鉴定引物及鉴定方法，属于植物病菌检测领域。背景技术0002烟草是我国重要的经济。
5、作物之一。烟草角斑病PSEUDOMONASSYRINGAEPVANGULATA是烟草主要的细菌性病害，在我国北方烟区发生严重，每年均造成一定程度的危害和经济损失。0003传统细菌的分类鉴定主要是基于形态学特征、致病性测定、生理生化特性等，工作繁琐，时间长，鉴定时还易受人为及环境等诸多因素的干扰，而且不能直接从植物组织中检测出病原菌，难以满足病害控制中快速、灵敏、稳定的检测要求，很容易错过病害防治的最佳时期，而免疫血清学鉴定方法特异性较差，常常受到抗血清质量的影响，容易造成假阳性，因此这些方法的应用均受到一定的限制。目前，我国官方机构进行细菌鉴定过程中主要采用传统的分类学鉴定以及生物学鉴定16S。
6、RRNA序列测定分析相结合的方式，鉴定时间至少需要1个月以上，对于农业生产过程中所面临的需要及时快速鉴定的病原菌，这些方法存在明显的不足。随着生物技术在病害鉴定方面开发应用及病菌DNA数据在基因库中的不断积累，使分子生物学方法鉴定细菌种类技术日趋完善和成熟。建立细菌的PCR特异鉴定引物，利用细菌分离培养技术及PCR技术，可以在12D内对初期侵染的细菌进行鉴定，从而指导烟农及时准确用药，对保障我国烟叶生产具有重要的意义。0004对于烟草角斑病的分子鉴定方法，河南农业大学的蒋世君等2010年申请了中国专利CN101206193“快速检测和鉴定烟草野火病菌和角斑病菌的方法”，该方法涉及的角斑病菌的P。
7、CR鉴定引物设计于HRPZ基因，且同时扩增出烟草野火病菌，也就是说不能有效区分野火病和角斑病或者其它丁香假单孢菌。发明内容0005本发明的目的是针对现有技术中烟草角斑病菌的生物学检测方法特异性差、灵敏度低、周期长、血清学鉴定方法成本高并易造成假阳性等问题，提供烟草角斑病菌特异分子鉴定引物以及可靠、特异性强、灵敏度高的烟草角斑病菌快速分子鉴定的方法。0006为实现上述目的，本发明采用以下技术方案0007基于烟草角斑病的AVRPPHE基因区域设计合成了烟草角斑病菌特异的PCR鉴定引物，该引物可以特异鉴别烟草角斑病菌，烟草野火病菌、其它的丁香假单孢菌及烟草叶面分离的其它细菌分离物均扩增不出特异的条带。
8、。0008具体地，一组烟草角斑病菌的分子鉴定引物，如下0009上游引物YF15GCCCAGAACCCCGCTTCTTA3SEQIDNO10010下游引物YR25GGGTCAGAACGTTCTCGGCG3SEQIDNO20011烟草角斑病菌AVRPPHE基因序列如序列表中的SEQIDNO3所示，本发明所述引说明书CN104212896A2/4页4物对烟草角斑病菌特异性扩增出763BP的产物。0012本发明还提供了一种烟草角斑病菌的鉴定方法，该方法包括如下步骤00131烟草角斑病细菌分离培养0014用灭菌的剪刀将烟草角斑病疑似病叶病斑12CM剪下。超净工作台中，用70乙醇对病斑进行表面消毒30S6。
9、0S，灭菌水漂洗34次，置于LB固体培养基中25下培养23天，收集病斑周围长出的细菌菌落于无菌的1000ML的LB液体培养基中，混匀后，吸取100L菌液涂LB固体平板，25下培养23天，挑取单菌落于100L的LB液体培养基中，25下培养4H，用于PCR检测。也可以直接用灭菌牙签蘸取单菌落用于PCR检测。00152烟草角斑病菌PCR扩增0016在05ML的PCR管中加入10PCR缓冲液BUFFER10L，加入10PMOL/L的YF1和YR2引物各05L，加入25U/L的DNA聚合酶02L，加入DNTPS1L，加入细菌菌液或用灭菌牙签蘸取的单菌落1L，加入超纯水58L。PCR扩增程序见表1。001。
10、7表1菌液落PCR反应条件001800193PCR扩增产物分离及结果判别0020将4LPCR扩增产物用15琼脂糖电泳分离，于紫外分析仪中根据扩增产物的大小判定结果。如果能特异性地扩增出763BP产物时，即可判断所分离的细菌为烟草角斑病菌，否则所分离的细菌中未存在烟草角斑病菌。0021本发明方法适用于植物组织中烟草角斑病菌的快速可靠的检测和鉴定，对于农业生产中烟草角斑病菌引起的病害防治具有重要的实用价值。本发明与现有技术相比，具有以下的技术优势和积极效果00221、特异性强本发明检测方法是通过对角斑病菌与野火病菌及其它丁香假单孢菌的AVRPPHE基因比对分析，设计了对烟草角斑病菌具有特异扩增作用。
11、的PCR引物。利用该对引物，以烟草野火病菌、其它定香假单孢菌及健康烟草叶际分离的细菌为对照，对采集于黑龙江省、吉林、辽宁几省的烟草角斑病样品进行了测试验证，结果表明引物特异性强、结果准确。00232、灵敏度高对于肉眼可见但症状不明显的初发病斑，通过病原物分离培养16小时，取1L的细菌培养液OD600值在0305即可完成病原菌的PCR扩增、鉴定，比血清检测方法等更加灵敏。00243、实用性好本发明所设计出的特异PCR引物可用于对烟草角斑病病原细菌的高灵敏度快速检测，同时可用于烟草角斑病病原细菌的分离纯化培养，可满足科研及生产相说明书CN104212896A3/4页5关需要。00254、操作简便快。
12、速应用本发明方法，对烟草角斑病菌的分离培养物进行PCR扩增和常规的琼脂糖电泳后即可判定结果，一般整个检测过程可在1天内完成。00265、本发明可用于对烟草角斑病疑似病害组织进行高灵敏度快速分子检测，此技术对于烟草角斑病菌引起病害的早期监测，确定病害防治最佳时期具有十分重要的意义，可以为防治策略的制定提供科学依据。同时可用于烟草角斑病病原细菌的分离纯化培养、烟草品种角斑病抗性鉴定、烟草角斑病相关科学研究工作。附图说明0027图1烟草角斑病疑似样品。0028图2烟草角斑病疑似样品细菌分离物PCR鉴定结果；0029泳道1病原细菌分离物208；泳道2病原细菌分离物217；泳道3病原细菌分离物216；泳。
13、道4病原细菌分离物215；泳道5病原细菌分离物214；泳道6病原细菌分离物213；泳道7病原细菌分离物212；泳道8病原细菌分离物211；泳道9烟草野火病菌；泳道10烟草角斑病菌；泳道11丁香假单胞菌ATCC19304；泳道12健康烟草叶际分离细菌；泳道13DL2000MARKER。0030图3经分子鉴定的烟草角斑病菌分离培养物接种烟草后发病情况。具体实施方式0031下面结合具体实施方式对本发明作进一步说明。0032实施例1烟草角斑病疑似样品细菌分离物鉴定00331烟草角斑病疑似样品病原菌分离培养0034从烟草大田采集疑似烟草角斑病病叶见图1，用灭菌的剪刀将烟草角斑病疑似病叶病斑12CM剪下。。
14、超净工作台中，用70乙醇将病斑表面消毒30S60S，灭菌水漂洗34次，置于LB固体培养基中25下培养23天，收集病斑周围长出的细菌菌落于无菌的1000ML的LB液体培养基中，混匀后，吸取100L菌液涂LB固体平板，25下培养23天，挑取单菌落于100L的LB液体培养基中，25下培养4H，用于PCR检测。00352烟草角斑病菌PCR鉴定引物设计0036基于烟草角斑病的AVRPPHE基因区域设计合成了烟草角斑病菌特异的PCR鉴定引物，如下0037上游引物YF15GCCCAGAACCCCGCTTCTTA3SEQIDNO10038下游引物YR25GGGTCAGAACGTTCTCGGCG3SEQIDNO。
15、20039PCR扩增片段长度为763BP。00403烟草角斑病菌PCR扩增方法0041以烟草野火病菌、丁香假单胞菌ATCC19304、健康烟草叶际分离的阴性细菌作为阴性对照，以经过接种鉴定的烟草角斑病病原菌为阳性对照，对分离自烟草角斑病疑似样品的10个单菌落培养物进行了鉴定。PCR扩增体系为在05ML的PCR管中加入10PCR缓冲液BUFFER10L，加入10PMOL/L的YF1和YR2引物各05L，加入25U/L的DNA聚合酶02L，加入DNTPS1L，加入细菌菌液或用灭菌牙签蘸取的单菌落1L，说明书CN104212896A4/4页6加入超纯水58L。扩增程序为94预变性10MIN；94变性。
16、60S；56退火60S；72延伸2MIN，共35个循环；最后72延伸10MIN。00424PCR测定结果0043PCR扩增结果见图2。烟草野火病菌、丁香假单胞菌ATCC19304、健康烟草叶际分离的阴性细菌检测结果均为阴性；8个来自于烟草角斑病疑似样品的细菌分离培养物中5个呈阳性，3个呈阴性。为了验证鉴定为阳性和阴性的细菌分离培养物致病性，选取3个阳性细菌和3个阴性细菌，对盆栽旺长期的NC89烟草进行了病原细菌分离培养物接种鉴定。0044实施例2烟草角斑病病原菌分子鉴定结果与接种鉴定结果比对0045选取3个经PCR鉴定为阳性细菌和3个阴性细菌，NC89旺长期，用高压喷壶接种各细菌菌液OD600。
17、值在0305，接种时用清水稀释10倍，每处理接种3棵，接种20天左右调查、记载各菌种致病性。结果统计见表2。试验图片见图3。0046表2烟草角斑病病原菌PCR鉴定方法验证004700480049显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定，对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无法对所有的实施方式予以穷举，凡是属于本发明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。说明书CN104212896A1/2页700010002序列表CN104212896A2/2页8序列表CN104212896A1/2页9图1图2说明书附图CN104212896A2/2页10图3说明书附图CN104212896A10。