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1、10申请公布号CN104212853A43申请公布日20141217CN104212853A21申请号201410433214822申请日20140829C12P17/18200601C12R1/46520060171申请人宁夏泰瑞制药股份有限公司地址750101宁夏回族自治区银川市永宁县望远开发区72发明人任勇奇乃李小萍董媛74专利代理机构宁夏专利服务中心64100代理人徐淑芬54发明名称一种链霉菌发酵生产奈马菌素的培养基和培养方法57摘要本发明涉及一种链霉菌发酵生产奈马菌素的培养基和培养方法，利用本发明中提供的培养基配方和发酵控制工艺，能够提高奈马菌素发酵单位，缩短发酵周期，降低发酵成本，。
2、并且最大限度的降低原辅料来源不受环境影响，保证其供应充足，实现奈马菌素稳定、高效的生产。51INTCL权利要求书2页说明书6页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书2页说明书6页10申请公布号CN104212853ACN104212853A1/2页21一种链霉菌发酵生产奈马菌素的培养基，其特征在于包括种子培养基和发酵培养基，其中所述种子培养基的组成为豆油或玉米油510ML/L、麦芽糖1015G/L、低温黄豆饼粉1520G/L、花生饼粉1015G/L、玉米浆59ML/L、玉米蛋白粉510G/L、硫酸铵051G/L、轻质碳酸钙15G/L；所述发酵培养基的组成为豆油或玉米油812。
3、ML/L、麦芽糖1014G/L、低温黄豆饼粉2530G/L、花生饼粉1520G/L、玉米浆1015ML/L、玉米蛋白粉1015G/L、硫酸铵051G/L、轻质碳酸钙15G/L、磷酸二氢钾0509G/L、氯化钠0307G/L、硫酸镁003006G/L、硫酸亚铁0105G/L、聚氧丙烯甘油0304G/L、麦芽糖酶00020004G/L。2一种利用权利要求1所述培养基生产奈马菌素的培养方法，其特征在于其工艺步骤为1）种子培养首先将种子培养基灭菌并冷却至2530，并用无菌空气保压，然后在火焰保护下，将已经培养好的链霉菌母瓶发酵液按照0203L/M3的接种量接入种子培养基中进行种子培养，至菌体浓度203。
4、0、PH值78、培养时间4050H时移种，移种比例控制在081M3/M3；2）发酵培养先将发酵培养基灭菌，冷却至2027，并用无菌空气保压，然后将培养好的种子液移入发酵培养基进行发酵培养，至菌体浓度3540、总糖5MG/100ML、脂肪08G/L、氨基氮1020MG/100ML、化学效价3800U/ML、PH56、培养时间230240H时终止发酵。3按照权利要求2所述的培养方法，其特征在于所述灭菌后的种子培养基的质量要求氨基氮4060MG/100ML、溶磷50100UG/ML、总糖1525MG/100ML、PH78；灭菌后的发酵培养基的质量要求氨基氮6080MG/100ML、溶磷100150U。
5、G/ML、总糖3040MG/100ML、PH67。4按照权利要求2所述的培养方法，其特征在于所述培养好的链霉菌母瓶发酵液质量要求为PH68；菌体浓度1030；镜检无杂菌；发酵单位8001500U/ML。5按照权利要求2所述的培养方法，其特征在于所述种子培养条件为罐压003005MPA；罐温2833；空气流量05H，采用空气搅拌代替机械搅拌；6H移种3050M3/H；搅拌转速6080R/MIN。6按照权利要求2所述的培养方法，其特征在于所述发酵培养条件为A培养基初始PH发酵培养基灭菌后PH控制在67；B温度采用变温控制工艺，060H培养温度2930，61200H培养温度3132，201H发酵结束。
6、培养温度3031；C搅拌转速采用变频搅拌控制工艺，060H转速控制在100R/MIN，61200H转速控制在120R/MIN，201H发酵结束转速控制在90R/MIN；权利要求书CN104212853A2/2页3D压力控制罐压005006MPA；EPH控制发酵过程中PH控制在57；F空气流量060H100150M3/H；61200H200300M3/H；201H发酵结束150200M3/H；H溶氧控制发酵前60H内，不控制溶氧；60100H，溶氧控制在60以上；101200H，溶氧控制在30以上；201发酵结束溶氧控制在40以上。7按照权利要求2所述的培养方法，其特征在于在发酵过程中采用流加法。
7、进行补料，补料包括补油、补水、补硫酸铵、补糖和PH控制，其中A补油工艺控制发酵前60H不用进行补油，发酵时间在61200H，当脂肪含量低于1G/L，补入豆油或玉米油，控制脂肪含量为115G/L，每隔68H检测发酵液脂肪含量，发酵时间在201H发酵结束，当脂肪含量低于3，补入豆油或玉米油，控制脂肪含量为0508G/L，每隔68H检测发酵液脂肪含量；B补水工艺控制发酵前60H不用进行补水，发酵时间在61200H，当菌体浓度高于50，加入灭菌水，要求控制发酵液菌体浓度在4045，每隔68H检测发酵液菌体浓度，发酵时间在201H发酵结束，当菌体浓度高于40，加入灭菌水，要求控制发酵液菌体浓度在3540。
8、，每隔68H检测发酵液菌体浓度；C发酵过程PH控制工艺发酵前60H，PH不进行控制，发酵时间在61200H，若PH60，加入1020的氢氧化钠，调节PH至67；若PH7，加入30的硫酸铵溶液，调节PH至67；发酵时间在201发酵结束，若PH65，加入1020的氢氧化钠，调节PH控至56；若PH6，加入30的硫酸铵溶液，调节PH至56；D补入麦芽糖发酵前60H，总糖含量不进行控制，发酵61H至200H总糖含量10MG/100ML时，补入已灭菌的麦芽糖溶液，使总糖的含量控制在1015MG/100ML发酵201H至发酵结束总糖含量3MG/100ML时，补入已灭菌的麦芽糖溶液，使总糖的含量控制在35M。
9、G/100ML。上述补糖工艺中加入麦芽糖酶，其浓度控制在00010003。E补硫酸铵奈马菌素发酵培养过程中，分别在60H、150H和220H补入30的硫酸铵溶液，其用量控制在发酵液体积的0103。权利要求书CN104212853A1/6页4一种链霉菌发酵生产奈马菌素的培养基和培养方法技术领域0001本发明属于发酵技术领域，特别是涉及一种链霉菌发酵生产奈马菌素的新型培养基和培养方法。背景技术0002奈马菌素同伊维菌素一样，是一种广泛用于兽医临床的广谱、高效、新型大环内酯类驱虫抗生素，是美贝霉素家族中的一员。目前，国内奈马菌素的发酵生产采用二级发酵模式，该方式存在的主要问题有以下几点1奈马菌素发酵。
10、水平较低，其发酵单位低于3000U/ML。00032国内发酵生产奈马菌素的培养基中含有葡萄糖，经高温灭菌，易导致部分葡萄糖碳化，降低总糖含量，影响发酵液质量。00043奈马菌素发酵生产所需的原材料采购成本较高，特别是奈马菌素培养基中常用的有机氮源蛋白胨市场价格较高，从而提高发酵成本，降低市场竞争力。00054国内奈马菌素的发酵培养周期较长，一般在260H以上，导致能耗较高。发明内容0006本发明的目的就在于克服上述现有技术的缺陷，提供一种发酵工艺简单，有效提高发酵单位，同时最大限度的降低原辅料对发酵单位的影响，降低生产成本，且原辅料来源不受环境影响，保证其供应充足，实现奈马菌素稳定、高效生产的。
11、新型培养基。0007本发明的另一目的是提供利用上述培养基生产奈马菌素的培养方法。0008为实现上述目的所采取的技术方案为一种链霉菌发酵生产奈马菌素的培养基，其特征在于包括种子培养基和发酵培养基，其中所述种子培养基的组成为豆油或玉米油510ML/L、麦芽糖1015G/L、低温黄豆饼粉1520G/L、花生饼粉1015G/L、玉米浆59ML/L、玉米蛋白粉510G/L、硫酸铵051G/L、轻质碳酸钙15G/L；所述发酵培养基的组成为豆油或玉米油812ML/L、麦芽糖1014G/L、低温黄豆饼粉2530G/L、花生饼粉1520G/L、玉米浆1015ML/L、玉米蛋白粉1015G/L、硫酸铵051G/L。
12、、轻质碳酸钙15G/L、磷酸二氢钾0509G/L、氯化钠0307G/L、硫酸镁003006G/L、硫酸亚铁0105G/L、聚氧丙烯甘油0304G/L、麦芽糖酶00020004G/L。0009一种利用上述培养基生产奈马菌素的培养方法，其特征在于其工艺步骤为1）种子培养首先将种子培养基灭菌并冷却至2530，并用无菌空气保压，然后在火焰保护下，将已经培养好的链霉菌母瓶发酵液按照0203L/M3的接种量接入种子培养基中进行种子培养，至菌体浓度2030、PH值78、培养时间4050H时移种，移种比例控制在081M3/M3；说明书CN104212853A2/6页52）发酵培养先将发酵培养基灭菌，冷却至20。
13、27，并用无菌空气保压，然后将培养好的种子液移入发酵培养基进行发酵培养，至菌体浓度3540、总糖5MG/100ML、脂肪08G/L、氨基氮1020MG/100ML、化学效价3800U/ML、PH56、培养时间230240H时终止发酵。00103、按照权利要求2所述的培养方法，其特征在于所述灭菌后的种子培养基的质量要求氨基氮4060MG/100ML、溶磷50100UG/ML、总糖1525MG/100ML、PH78；灭菌后的发酵培养基的质量要求氨基氮6080MG/100ML、溶磷100150UG/ML、总糖3040MG/100ML、PH67。0011所述培养好的链霉菌母瓶发酵液质量要求为PH68；。
14、菌体浓度1030；镜检无杂菌；发酵单位8001500U/ML。0012所述种子培养条件为罐压003005MPA；罐温2833；空气流量05H，采用空气搅拌代替机械搅拌；6H移种3050M3/H；搅拌转速6080R/MIN。0013所述发酵培养条件为A培养基初始PH发酵培养基灭菌后PH控制在67；B温度采用变温控制工艺，060H培养温度2930，61200H培养温度3132，201H发酵结束培养温度3031；C搅拌转速采用变频搅拌控制工艺，060H转速控制在100R/MIN，61200H转速控制在120R/MIN，201H发酵结束转速控制在90R/MIN；D压力控制罐压005006MPA；EPH。
15、控制发酵过程中PH控制在57；F空气流量060H100150M3/H；61200H200300M3/H；201H发酵结束150200M3/H；H溶氧控制发酵前60H内，不控制溶氧；60100H，溶氧控制在60以上；101200H，溶氧控制在30以上；201发酵结束溶氧控制在40以上。0014在发酵过程中采用流加法进行补料，补料包括补油、补水、补硫酸铵、补糖和PH控制，其中A补油工艺控制发酵前60H不用进行补油，发酵时间在61200H，当脂肪含量低于1G/L，补入豆油或玉米油，控制脂肪含量为115G/L，每隔68H检测发酵液脂肪含量，发酵时间在201H发酵结束，当脂肪含量低于3，补入豆油或玉米油。
16、，控制脂肪含量为0508G/L，每隔68H检测发酵液脂肪含量；说明书CN104212853A3/6页6B补水工艺控制发酵前60H不用进行补水，发酵时间在61200H，当菌体浓度高于50，加入灭菌水，要求控制发酵液菌体浓度在4045，每隔68H检测发酵液菌体浓度，发酵时间在201H发酵结束，当菌体浓度高于40，加入灭菌水，要求控制发酵液菌体浓度在3540，每隔68H检测发酵液菌体浓度；C发酵过程PH控制工艺发酵前60H，PH不进行控制，发酵时间在61200H，若PH60，加入1020的氢氧化钠，调节PH至67；若PH7，加入30的硫酸铵溶液，调节PH至67；发酵时间在201发酵结束，若PH65，。
17、加入1020的氢氧化钠，调节PH控至56；若PH6，加入30的硫酸铵溶液，调节PH至56；D补入麦芽糖发酵前60H，总糖含量不进行控制，发酵61H至200H总糖含量10MG/100ML时，补入已灭菌的麦芽糖溶液，使总糖的含量控制在1015MG/100ML发酵201H至发酵结束总糖含量3MG/100ML时，补入已灭菌的麦芽糖溶液，使总糖的含量控制在35MG/100ML。0015上述补糖工艺中加入麦芽糖酶，其浓度控制在00010003。0016E补硫酸铵奈马菌素发酵培养过程中，分别在60H、150H和220H补入30的硫酸铵溶液，其用量控制在发酵液体积的0103。0017本发明的技术优势体现在1本。
18、发明确认了种子培养基、发酵培养碳源、氮源和最佳配伍比例。00182本发明对种子培养、发酵培养的工艺进行了详细的阐述，确认了奈马菌素最佳的发酵工艺和控制参数。通过本发明发酵生产奈马菌素，最终使得发酵单位达到3500U/ML以上，生产周期不超过240H，同国内技术相比，发酵单位提高了167，生产周期减少了20H以上。00193本发明适用于规模化发酵生产奈马菌素，能够满足年产50吨奈马菌素的生产需求。00204培养基中使用麦芽糖，避免出现葡萄糖碳化现象。0021具体实施方法下面用实例予以说明本发明，应该理解的是，实例是用于说明本发明而不是对本发明的限制。本发明的范围与核心内容依据权利要求书加以确定。。
19、0022下述实施例的菌种选用肉桂地链霉菌生产使用的菌种来源为母瓶发酵液。母瓶发酵液质量要求为PH68；菌体浓度1030；镜检无杂菌；发酵单位8001500U/ML。0023实施例1种子培养基种子罐体积15M3，有效体积为1M3。0024种子培养基豆油5L、麦芽糖10KG、低温黄豆饼粉15KG、花生饼粉10KG、玉米浆说明书CN104212853A4/6页75L、玉米蛋白粉5KG、硫酸铵05KG、轻质碳酸钙1KG。0025种子培养基灭菌并冷却至25，并用无菌空气保压，灭菌后的种子培养基的质量为氨基氮41MG/100ML、溶磷50UG/ML、总糖15MG/100ML、PH78。然后在火焰保护下，将。
20、已经培养好的链霉菌母瓶发酵液按照02L的接种量接入种子培养基中进行培养，罐压003005MPA；罐温28；空气流量05H，采用空气搅拌代替机械搅拌；6H移种30M3/H；搅拌转速60R/MIN。种子培养结束，菌体浓度20、PH值79、培养时间40H。0026发酵培养基种子罐体积15M3，有效体积为10M3。0027发酵培养基豆油80L、麦芽糖100KG、低温黄豆饼粉250KG、花生饼粉150KG、玉米浆100L、玉米蛋白粉100KG、硫酸铵5KG、轻质碳酸钙10KG、磷酸二氢钾5KG、氯化钠3KG、硫酸镁03KG、硫酸亚铁1KG、聚氧丙烯甘油3KG、麦芽糖酶002KG。0028先将发酵培养基灭。
21、菌，冷却至20，并用无菌空气保压，灭菌后的发酵培养基的质量为氨基氮61MG/100ML、溶磷102UG/ML、总糖31MG/100ML、PH69。将培养好的种子液移入发酵培养基进行发酵培养，移种量为08M3。发酵培养结束，菌体浓度35、总糖31MG/100ML、脂肪02G/L、氨基氮11MG/100ML、化学效价3967U/ML、PH51、培养时间230H。0029实施例2种子培养基种子罐体积15M3，有效体积为1M3。0030种子培养基玉米油6L、麦芽糖11KG、低温黄豆饼粉16KG、花生饼粉11KG、玉米浆6L、玉米蛋白粉6KG、硫酸铵06KG、轻质碳酸钙2KG。0031种子培养基灭菌并冷。
22、却至26，并用无菌空气保压，灭菌后的种子培养基的质量为氨基氮45MG/100ML、溶磷60UG/ML、总糖17MG/100ML、PH77。然后在火焰保护下，将已经培养好的链霉菌母瓶发酵液按照022L的接种量接入种子培养基中进行培养，罐压003005MPA；罐温29；空气流量05H，采用空气搅拌代替机械搅拌；6H移种35M3/H；搅拌转速65R/MIN。种子培养结束，菌体浓度22、PH值78、培养时间42H。0032发酵培养基种子罐体积15M3，有效体积为10M3。0033发酵培养基玉米油90L、麦芽糖110KG、低温黄豆饼粉260KG、花生饼粉160KG、玉米浆110L、玉米蛋白粉110KG、。
23、硫酸铵6KG、轻质碳酸钙20KG、磷酸二氢钾6KG、氯化钠4KG、硫酸镁04KG、硫酸亚铁2KG、聚氧丙烯甘油32KG、麦芽糖酶0025KG。0034先将发酵培养基灭菌，冷却至22，并用无菌空气保压，灭菌后的发酵培养基的质量为氨基氮66MG/100ML、溶磷112UG/ML、总糖33MG/100ML、PH68。将培养好的种子液移入发酵培养基进行发酵培养，移种量为085M3。发酵培养结束，菌体浓度36、总糖35G/100ML、脂肪03G/L、氨基氮13MG/100ML、化学效价4032U/ML、PH53、培养时间232H。0035实施例3种子培养基种子罐体积15M3，有效体积为1M3。0036种。
24、子培养基豆油7L、麦芽糖12KG、低温黄豆饼粉17KG、花生饼粉12KG、玉米浆7L、玉米蛋白粉7KG、硫酸铵07KG、轻质碳酸钙3KG。0037种子培养基灭菌并冷却至27，并用无菌空气保压，灭菌后的种子培养基的质量为氨基氮51MG/100ML、溶磷71UG/ML、总糖20MG/100ML、PH75。然后在火焰保护下，将已经培养好的链霉菌母瓶发酵液按照025L的接种量接入种子培养基中进行培养，罐压003005MPA；罐温30；空气流量05H，采用空气搅拌代替机械搅拌；6H移种40M3/H；搅说明书CN104212853A5/6页8拌转速70R/MIN。种子培养结束，菌体浓度25、PH值75、培。
25、养时间45H。0038发酵培养基种子罐体积15M3，有效体积为10M3。0039发酵培养基豆油100L、麦芽糖120KG、低温黄豆饼粉270KG、花生饼粉170KG、玉米浆130L、玉米蛋白粉130KG、硫酸铵75KG、轻质碳酸钙30KG、磷酸二氢钾7KG、氯化钠5KG、硫酸镁045KG、硫酸亚铁3KG、聚氧丙烯甘油35KG、麦芽糖酶003KG。0040先将发酵培养基灭菌，冷却至23，并用无菌空气保压，灭菌后的发酵培养基的质量为氨基氮71MG/100ML、溶磷126UG/ML、总糖35MG/100ML、PH66。将培养好的种子液移入发酵培养基进行发酵培养，移种量为09M3。发酵培养结束，菌体浓。
26、度37、总糖39G/100ML、脂肪04G/L、氨基氮15MG/100ML、化学效价4157U/ML、PH55、培养时间235H。0041实施例4种子培养基种子罐体积15M3，有效体积为1M3。0042种子培养基玉米油9L、麦芽糖14KG、低温黄豆饼粉19KG、花生饼粉14KG、玉米浆8L、玉米蛋白粉9KG、硫酸铵09KG、轻质碳酸钙4KG。0043种子培养基灭菌并冷却至29，并用无菌空气保压，灭菌后的种子培养基的质量为氨基氮56MG/100ML、溶磷90UG/ML、总糖23MG/100ML、PH73。然后在火焰保护下，将已经培养好的链霉菌母瓶发酵液按照028L的接种量接入种子培养基中进行培养。
27、，罐压003005MPA；罐温32；空气流量05H，采用空气搅拌代替机械搅拌；6H移种45M3/H；搅拌转速75R/MIN。种子培养结束，菌体浓度28、PH值73、培养时间48H。0044发酵培养基种子罐体积15M3，有效体积为10M3。0045发酵培养基玉米油110L、麦芽糖130KG、低温黄豆饼粉280KG、花生饼粉180KG、玉米浆140L、玉米蛋白粉140KG、硫酸铵9KG、轻质碳酸钙40KG、磷酸二氢钾7KG、氯化钠5KG、硫酸镁05KG、硫酸亚铁4KG、聚氧丙烯甘油35KG、麦芽糖酶003KG。0046先将发酵培养基灭菌，冷却至25，并用无菌空气保压，灭菌后的发酵培养基的质量为氨基。
28、氮75MG/100ML、溶磷140UG/ML、总糖38MG/100ML、PH63。将培养好的种子液移入发酵培养基进行发酵培养，移种量为095M3。发酵培养结束，菌体浓度38、总糖42G/100ML、脂肪06G/L、氨基氮17MG/100ML、化学效价4108U/ML、PH57、培养时间237H。0047实施例5种子培养基种子罐体积15M3，有效体积为1M3。0048种子培养基豆油10L、麦芽糖15KG、低温黄豆饼粉20KG、花生饼粉15KG、玉米浆9L、玉米蛋白粉10KG、硫酸铵1KG、轻质碳酸钙5KG。0049种子培养基灭菌并冷却至30，并用无菌空气保压，灭菌后的种子培养基的质量为氨基氮60。
29、MG/100ML、溶磷99UG/ML、总糖25MG/100ML、PH71。然后在火焰保护下，将已经培养好的链霉菌母瓶发酵液按照03L的接种量接入种子培养基中进行培养，罐压003005MPA；罐温33；空气流量05H，采用空气搅拌代替机械搅拌；6H移种50M3/H；搅拌转速80R/MIN。种子培养结束，菌体浓度30、PH值71、培养时间50H。0050发酵培养基种子罐体积15M3，有效体积为10M3。0051发酵培养基玉米油120L、麦芽糖140KG、低温黄豆饼粉300KG、花生饼粉200KG、玉米浆150L、玉米蛋白粉150KG、硫酸铵10KG、轻质碳酸钙50KG、磷酸二氢钾9KG、氯化钠7K。
30、G、硫酸镁06KG、硫酸亚铁5KG、聚氧丙烯甘油4KG、麦芽糖酶004KG。说明书CN104212853A6/6页90052先将发酵培养基灭菌，冷却至27，并用无菌空气保压，灭菌后的发酵培养基的质量为氨基氮79MG/100ML、溶磷150UG/ML、总糖40MG/100ML、PH61。将培养好的种子液移入发酵培养基进行发酵培养，移种量为1M3。发酵培养结束，菌体浓度40、总糖49G/100ML、脂肪08G/L、氨基氮20MG/100ML、化学效价3873U/ML、PH59、培养时间240H。0053上述实施例15的发酵过程中，根据检测情况，采用流加法进行补料，补料包括补油、补水、补硫酸铵、补糖。
31、和PH控制，其中A补油工艺控制发酵前60H不用进行补油，发酵时间在61200H，当脂肪含量低于1G/L，补入豆油或玉米油，控制脂肪含量为115G/L，每隔68H检测发酵液脂肪含量，发酵时间在201H发酵结束，当脂肪含量低于3，补入豆油或玉米油，控制脂肪含量为0508G/L，每隔68H检测发酵液脂肪含量；B补水工艺控制发酵前60H不用进行补水，发酵时间在61200H，当菌体浓度高于50，加入灭菌水，要求控制发酵液菌体浓度在4045，每隔68H检测发酵液菌体浓度，发酵时间在201H发酵结束，当菌体浓度高于40，加入灭菌水，要求控制发酵液菌体浓度在3540，每隔68H检测发酵液菌体浓度；C发酵过程P。
32、H控制工艺发酵前60H，PH不进行控制，发酵时间在61200H，若PH60，加入1020的氢氧化钠，调节PH至67；若PH7，加入30的硫酸铵溶液，调节PH至67；发酵时间在201发酵结束，若PH65，加入1020的氢氧化钠，调节PH控至56；若PH6，加入30的硫酸铵溶液，调节PH至56；D补入麦芽糖发酵前60H，总糖含量不进行控制，发酵61H至200H总糖含量10MG/100ML时，补入已灭菌的麦芽糖溶液，使总糖的含量控制在1015MG/100ML发酵201H至发酵结束总糖含量3MG/100ML时，补入已灭菌的麦芽糖溶液，使总糖的含量控制在35MG/100ML。0054上述补糖工艺中加入麦芽糖酶，其浓度控制在00010003。0055E补硫酸铵奈马菌素发酵培养过程中，分别在60H、150H和220H补入30的硫酸铵溶液，其用量控制在发酵液体积的0103。说明书CN104212853A。