技术领域
本发明涉及一种饲料及其制备方法，具体涉及一种采用乳酸菌和酵母菌混合发酵处理多种蛋白性原料混合物的方法，以及由该方法直接获得的无抗生物发酵饲料。
背景技术
传统饲料的生产，采用麸皮、玉米、小麦、豆粕、棉粕、菜粕等作为原料，由于原料本身不能提供抗生素，为了提高畜禽防病、抗病的能力，往往需要往饲料中添加抗生素；众所同知，抗生素对动物还有促进生长的作用，所以，抗生素在传统饲料的生产中得到了广泛的应用。
抗生素在饲料中的应用，因其存在残留和病原菌株的耐药性问题，将会给人类健康带来巨大的灾难。因此，无抗生物发酵饲料在国内外的研究一直不断。
据报道，目前国内主要用于生产菌体蛋白的微生物有曲霉菌、根霉菌、假丝酵母菌、乳酸杆菌、乳酸链球菌、枯草杆菌、赖氨酸产生菌、拟内孢霉、白地霉等。目前选育出的菌种有：
（1）酵母菌：酵母耐酸能力强，个体大，易回收，常用的酵母菌有热带假丝酵母菌、产朊假丝酵母菌、皮状丝孢酵母菌、树状酵母。
（2）放线菌：放线菌具有很强的分解纤维素的能力，可直接利用纤维原料生产单细胞蛋白，常用的放线菌有诺卡氏菌、高温放线菌。
（3）霉菌：霉菌可产生高活性的纤维素酶，降解饲料原料中的 纤维素，常用的霉菌有白地霉、黑曲霉、康宁木霉、绿色木霉。
（4）担子真菌等。主要用于生产食用真菌等。
发明内容
为解决现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种无抗生素添加，但具有以菌治菌、以菌治病、促进畜禽生长和抗病作用的无抗生物发酵饲料,以及该无抗生物发酵饲料的制备方法。
为了实现上述目标，本发明采用如下的技术方案：
一种无抗生物发酵饲料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
一、制备混合种液的步骤：
（1）、将发酵乳酸短杆菌（Brevibacterium lactofermentum-QF-1），保藏编号为CCTCC NO:M2013453，保藏日期为2013年9月28日，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏单位地址：中国.武汉.武汉大学，置于乳酸菌液体培养基中，在37℃条件下进行三级种子培养，培养至细胞浓度>109CFU/mL，得发酵乳酸短杆菌的三级种子培养液；
（2）、将产朊假丝酵母（Candida utilis QF-2），保藏编号为CCTCC NO:M2013454，保藏日期为2013年9月28日，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏单位地址：中国.武汉.武汉大学,置于麦芽汁液体培养基中，在28℃条件下进行三级种子培养，培养至细胞浓度>109CFU/mL，得产朊假丝酵母的三级种子培养液；
（3）、将发酵乳酸短杆菌的三级种子培养液与产朊假丝酵母的三级种子培养液按照体积比1：0.01～1的比例混合，得混合种子培养 液；
（4）、将混合种子培养液按照体积比1：10的比例接种于混合种子培养基中，在28～30℃条件下进行培养，培养至细胞浓度>109CFU/mL，得到混合种液；
二、制备混合发酵培养基的步骤：
（1）、将饲料原料烘干或压榨至含水量为25～35%，得到混合发酵培养基；
前述饲料原料包括：麸皮、玉米、小麦、米糠、豆粕、棉粕、菜粕、豆腐渣等，既可以对单一原料进行发酵，也可以对若干原料的混合物进行发酵，根据具体情况而定；
（2）、向混合发酵培养基中添加CaCO3；
（3）、加水调节混合发酵培养基的湿度至50～60%；
（4）、自然pH值，灭菌后待用；
三、分段发酵步骤：
（1）、将混合种液按照体积比1:10的比例接种于混合发酵培养基中；
（2）、先在30～32℃条件下好氧发酵12h，然后在35～37℃条件下厌氧发酵48～72h，当混合物pH下降至3.5～4.0的稳定状态，且菌体数目达到107～108CFU/g时，停止发酵；
（3）、发酵物在40～62℃条件下烘干，包装得到成品。
前述的无抗生物发酵饲料的制备方法，其特征在于，前述乳酸菌液体培养基的配制如下：
666.4KPa压力下灭菌30min。
前述的无抗生物发酵饲料的制备方法，其特征在于，前述麦芽汁液体培养基的配制如下：
将未加酒花的发酵啤酒的原料，稀释至12白利度，666.4KPa压力下灭菌30min。
前述的无抗生物发酵饲料的制备方法，其特征在于，前述混合种子培养基的配制如下：
玉米淀粉 5g 尿素 1g
CaHPO4 0.5g 蒸馏水稀释至100mL
自然pH值 666.4KPa压力下灭菌30min。
前述的无抗生物发酵饲料的制备方法，其特征在于，前述三级种子培养的步骤为：
（1）、将发酵乳酸短杆菌/产朊假丝酵母接种于5mL乳酸菌液体培养基/麦芽汁液体培养基中，培养16h，得一级种子培养液；
（2）、将5mL一级种子培养液接种于100mL乳酸菌液体培养基/麦芽汁液体培养基中，培养16h，培养至细胞浓度>109CFU/mL，得二级种子培养液；
（3）、将100mL二级种子培养液接种于10L乳酸菌液体培养基/麦 芽汁液体培养基中，培养16h，培养至细胞浓度>109CFU/mL，得发酵乳酸短杆菌/产朊假丝酵母的三级种子培养液。
前述的无抗生物发酵饲料的制备方法，其特征在于，前述发酵乳酸短杆菌的三级种子培养液与产朊假丝酵母的三级种子培养液按照体积比1：0.1的比例混合。
前述的无抗生物发酵饲料的制备方法，其特征在于，前述混合发酵培养基中还添加有CaHPO4、饲用矿物添加剂和饲用维生素中的任意一种，或任意两种的混合物，或三种同时添加。
前述的无抗生物发酵饲料的制备方法，其特征在于，前述饲用矿物添加剂的原料组成及重量配比如下：
前述的无抗生物发酵饲料的制备方法，其特征在于，前述混合发酵培养基的灭菌方法为：105℃蒸汽间歇式灭菌2～3次，每次1h，每次间歇3～4h。
一种无抗生物发酵饲料，其特征在于，由前述的方法制备而来。
本发明的有益之处在于：
1、本发明采用发酵乳酸短杆菌与产朊假丝酵母两种微生物混合发酵处理麸皮、玉米、小麦、米糠、豆粕、棉粕、菜粕、豆腐渣等，不仅增加了饲料中总的蛋白含量，粗蛋白的含量由发酵前的13%提高到了24%以上，而且氨基酸的含量也提高至16%以上，同时分解了纤维素等非淀粉类物质，饲料成品的纤维素含量下降至2.4%左右，大大提高了无抗生物发酵饲料的生物效价；
2、多菌种混合发酵，不但使饲料内在的营养价值得到了充分发挥，而且实现了以菌治菌、以菌治病、促进畜禽生长和抗病的目标，有效解决了饲料中抗生素残留和病原菌株耐药性问题；
3、在发酵过程中，采用先好氧、后厌氧的分段发酵方式，从而有效地脱去了菜粕、棉粕等蛋白性原料中的硫代葡萄糖甙，在最终获得的饲料成品中，硫代葡萄糖甙的含量低于0.01%，异硫氰酸含量小于0.045%，噁唑烷硫酮含量小于0.025%，符合饲料安全要求；
4、通过先好氧、后厌氧发酵的共同作用，从而有效地脱去了棉粕等蛋白性原料中的棉酚，在最终获得的饲料成品中，棉酚的含量低于0.01%，符合饲料安全要求：即棉酚的含量小于0.02%；
5、生产条件比较简单，既可防止污染，又能最大程度地利用资源；
6、由该方法制备的饲料其适口性好，无抗生素和有毒物质，饲养效果好，食用安全。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明作具体的介绍。
实施例1
一、准备培养基：
1、乳酸菌液体培养基：酵母膏7.5g、蛋白胨7.5g、葡萄糖10g、KH2PO42g、西红柿汁100mL、吐温-800.5mL、蒸馏水900mL，调节pH值至7.0，于666.4KPa压力下灭菌30min。
2、麦芽汁液体培养基：将未加酒花的发酵啤酒的原料，稀释至12白利度，于666.4KPa压力下灭菌30min。
3、混合种子培养基：玉米淀粉5g、尿素1g、CaHPO40.5g、蒸馏水稀释至100mL，自然pH值，于666.4KPa压力下灭菌30min。
4、混合发酵培养基：将麸皮、玉米、小麦、米糠、豆粕、棉粕、菜粕、豆腐渣于45℃下烘干至含水量为30%后，混合，然后加入0.1%（重量）CaCO3、0.5%CaHPO4，加水调节混合发酵培养基的湿度至50%，自然pH值，105℃蒸汽间歇式灭菌2次，每次1h，中间间歇4h。
二、获得种液：
1、发酵乳酸短杆菌三级种子培养液：将发酵乳酸短杆菌，置于乳酸菌液体培养基中，在37℃条件下进行三级种子培养，培养至细胞浓度>109CFU/mL。具体的，
（1）、挑取2～3接种环的菌体，接种于5mL乳酸菌液体培养基中，220rpm，37℃培养16小时，得一级种子培养液；
（2）、将5mL过夜培养的一级种子培养液接种于100mL乳酸菌液体培养基中，220rpm，37℃培养16小时，培养至细胞浓度>109CFU/mL，得二级种子培养液；
（3）、将100mL二级种子培养液接种于10L乳酸菌液体培养基中， 220rpm，37℃培养16小时，培养至细胞浓度>109CFU/mL，得发酵乳酸短杆菌的三级种子培养液。
2、产朊假丝酵母三级种子培养液：将产朊假丝酵母，置于麦芽汁液体培养基中，在28℃条件下进行三级种子培养，培养至细胞浓度>109CFU/mL，得产朊假丝酵母的三级种子培养液。具体的，
（1）、挑取2～3接种环的菌体，接种于5mL麦芽汁液体培养基中，220rpm，28℃培养16小时，得一级种子培养液；
（2）、将5mL过夜培养的一级种子培养液接种于100mL麦芽汁液体培养基中，220rpm，28℃培养16小时，培养至细胞浓度>109CFU/mL，得二级种子培养液；
（3）、将100mL二级种子培养液接种于10L麦芽汁液体培养基中，220rpm，28℃培养16小时，培养至细胞浓度>109CFU/mL，得产朊假丝酵母的三级种子培养液。
3、混合种子培养液：将发酵乳酸短杆菌的三级种子培养液与产朊假丝酵母的三级种子培养液按照体积比1:0.5的比例混合。
4、混合种液：将混合种子培养液按体积比1：10的比例接种于混合种子培养基中,培养温度30℃，搅拌速度220rpm，培养48h，培养至细胞浓度>109CFU/mL。
三、分段发酵：
1、将混合种液按照体积比1:10的比例接种于混合发酵培养基中。
2、先在30℃条件下好氧发酵12h。
3、然后在35℃条件下厌氧发酵60h，当混合物pH下降至4.0的稳 定状态，且菌体数目达到107～108CFU/g时，停止发酵。
4、发酵物在52℃条件下烘干，包装得到成品。
该产品的主要技术指标如下：
微生物含量107～108CFU/g，pH<4.0，蛋白质含量24％以上，氨基酸的含量16%以上，纤维素含量2.4%左右，硫甙含量小于0.01%。
实施例2
一、准备培养基：
1、乳酸菌液体培养基：酵母膏7.5g、蛋白胨7.5g、葡萄糖10g、KH2PO42g、西红柿汁100mL、吐温-800.5mL、蒸馏水900mL，调节pH值至7.0，于666.4KPa压力下灭菌30min。
2、麦芽汁液体培养基：将未加酒花的发酵啤酒的原料，稀释至12白利度，于666.4KPa压力下灭菌30min。
3、混合种子培养基：玉米淀粉5g、尿素1g、CaHPO40.5g、蒸馏水稀释至100mL，自然pH值，于666.4KPa压力下灭菌30min。
4、混合发酵培养基：将麸皮、玉米、小麦、米糠、豆粕、棉粕、菜粕、豆腐渣于45℃下烘干至含水量为35%后，混合，然后加入0.1%（重量）CaCO3、0.1%饲用矿物添加剂，加水调节混合发酵培养基的湿度至60%，自然pH值，105℃蒸汽间歇式灭菌3次，每次1h，中间间歇4h。其中，
饲用矿物添加剂的原料组成及重量配比如下：
CuSO4·5H2O24份、FeSO4·7H2O250份、ZnSO4·H2O200份、MnSO4200份、质量百分比浓度为5%的KI5份、质量百分比浓度为 1%的Na2SeO318份、沸石粉（载体）303份；
配制方法为：先将212.1份沸石粉加入到混合器中，然后再加入CuSO4·5H2O、FeSO4·7H2O、ZnSO4·H2O、MnSO4、KI、Na2SeO3，最后再加入剩余的沸石粉，混合均匀即得。
二、获得种液：
1、发酵乳酸短杆菌三级种子培养液：将发酵乳酸短杆菌，置于乳酸菌液体培养基中，在37℃条件下进行三级种子培养，培养至细胞浓度>109CFU/mL。具体的，
（1）、挑取2～3接种环的菌体，接种于5mL乳酸菌液体培养基中，220rpm，37℃培养16小时，得一级种子培养液；
（2）、将5mL过夜培养的一级种子培养液接种于100mL乳酸菌液体培养基中，220rpm，37℃培养16小时，培养至细胞浓度>109CFU/mL，得二级种子培养液；
（3）、将100mL二级种子培养液接种于10L乳酸菌液体培养基中，220rpm，37℃培养16小时，培养至细胞浓度>109CFU/mL，得发酵乳酸短杆菌的三级种子培养液。
2、产朊假丝酵母三级种子培养液：将产朊假丝酵母，置于麦芽汁液体培养基中，在28℃条件下进行三级种子培养，培养至细胞浓度>109CFU/mL，得产朊假丝酵母的三级种子培养液。具体的，
（1）、挑取2～3接种环的菌体，接种于5mL麦芽汁液体培养基中，220rpm，28℃培养16小时，得一级种子培养液；
（2）、将5mL过夜培养的一级种子培养液接种于100mL麦芽汁液体 培养基中，220rpm，28℃培养16小时，培养至细胞浓度>109CFU/mL，得二级种子培养液；
（3）、将100mL二级种子培养液接种于10L麦芽汁液体培养基中，220rpm，28℃培养16小时，培养至细胞浓度>109CFU/mL，得产朊假丝酵母的三级种子培养液。
3、混合种子培养液：将发酵乳酸短杆菌的三级种子培养液与产朊假丝酵母的三级种子培养液按照体积比1:1的比例混合。
4、混合种液：将混合种子培养液按体积比1：10的比例接种于混合种子培养基中,培养温度28℃，搅拌速度220rpm，培养50h，培养至细胞浓度>109CFU/mL。
三、分段发酵：
1、将混合种液按照体积比1:10的比例接种于混合发酵培养基中。
2、先在30℃条件下好氧发酵12h。
3、然后在35℃条件下厌氧发酵60h，当混合物pH下降至4.0的稳定状态，且菌体数目达到107～108CFU/g时，停止发酵。
4、发酵物在40℃条件下烘干，包装得到成品。
该产品的主要技术指标如下：
微生物含量107～108CFU/g，pH<4.0，蛋白质含量24％以上，氨基酸的含量16%以上，纤维素含量2.4%左右，硫甙含量小于0.01%。
实施例3
一、准备培养基：
1、乳酸菌液体培养基：酵母膏7.5g、蛋白胨7.5g、葡萄糖10g、 KH2PO42g、西红柿汁100mL、吐温-800.5mL、蒸馏水900mL，调节pH值至7.0，于666.4KPa压力下灭菌30min。
2、麦芽汁液体培养基：将未加酒花的发酵啤酒的原料，稀释至12白利度，于666.4KPa压力下灭菌30min。
3、混合种子培养基：玉米淀粉5g、尿素1g、CaHPO40.5g、蒸馏水稀释至100mL，自然pH值，于666.4KPa压力下灭菌30min。
4、混合发酵培养基：将麸皮、玉米、小麦、米糠、豆粕、棉粕、菜粕、豆腐渣于55℃下烘干至含水量为25%后，混合，然后加入0.1%（重量）CaCO3、0.1%饲用维生素（购自北京君德同创公司，商品名称为“猪通用多种维生素”），加水调节混合发酵培养基的湿度至55%，自然pH值，105℃蒸汽间歇式灭菌3次，每次1h，中间间歇4h。
二、获得种液：
1、发酵乳酸短杆菌三级种子培养液：将发酵乳酸短杆菌，置于乳酸菌液体培养基中，在37℃条件下进行三级种子培养，培养至细胞浓度>109CFU/mL。具体的，
（1）、挑取2～3接种环的菌体，接种于5mL乳酸菌液体培养基中，220rpm，37℃培养16小时，得一级种子培养液；
（2）、将5mL过夜培养的一级种子培养液接种于100mL乳酸菌液体培养基中，220rpm，37℃培养16小时，培养至细胞浓度>109CFU/mL，得二级种子培养液；
（3）、将100mL二级种子培养液接种于10L乳酸菌液体培养基中，220rpm，37℃培养16小时，培养至细胞浓度>109CFU/mL，得发酵乳 酸短杆菌的三级种子培养液。
2、产朊假丝酵母三级种子培养液：将产朊假丝酵母，置于麦芽汁液体培养基中，在28℃条件下进行三级种子培养，培养至细胞浓度>109CFU/mL，得产朊假丝酵母的三级种子培养液。具体的，
（1）、挑取2～3接种环的菌体，接种于5mL麦芽汁液体培养基中，220rpm，28℃培养16小时，得一级种子培养液；
（2）、将5mL过夜培养的一级种子培养液接种于100mL麦芽汁液体培养基中，220rpm，28℃培养16小时，培养至细胞浓度>109CFU/mL，得二级种子培养液；
（3）、将100mL二级种子培养液接种于10L麦芽汁液体培养基中，220rpm，28℃培养16小时，培养至细胞浓度>109CFU/mL，得产朊假丝酵母的三级种子培养液。
3、混合种子培养液：将发酵乳酸短杆菌的三级种子培养液与产朊假丝酵母的三级种子培养液按照体积比1:0.01的比例混合。
4、混合种液：将混合种子培养液按体积比1：10的比例接种于混合种子培养基中,培养温度30℃，搅拌速度300rpm，培养72h，培养至细胞浓度>109CFU/mL。
三、分段发酵：
1、将混合种液按照体积比1:10的比例接种于混合发酵培养基中。
2、先在30℃条件下好氧发酵12h。
3、然后在35℃条件下厌氧发酵60h，当混合物pH下降至4.0的稳定状态，且菌体数目达到107～108CFU/g时，停止发酵。
4、发酵物在60℃条件下烘干，包装得到成品。
该产品的主要技术指标如下：
微生物含量107～108CFU/g，pH<4.0，蛋白质含量24％以上，氨基酸的含量16%以上，纤维素含量2.4%左右，硫甙含量小于0.01%。
实施例4
一、准备培养基：
1、乳酸菌液体培养基：酵母膏7.5g、蛋白胨7.5g、葡萄糖10g、KH2PO42g、西红柿汁100mL、吐温-800.5mL、蒸馏水900mL，调节pH值至7.0，于666.4KPa压力下灭菌30min。
2、麦芽汁液体培养基：将未加酒花的发酵啤酒的原料，稀释至12白利度，于666.4KPa压力下灭菌30min。
3、混合种子培养基：玉米淀粉5g、尿素1g、CaHPO40.5g、蒸馏水稀释至100mL，自然pH值，于666.4KPa压力下灭菌30min。
4、混合发酵培养基：将麸皮、玉米、小麦、米糠、豆粕、棉粕、菜粕、豆腐渣于45℃下烘干至含水量为32%后，混合，然后加入0.1%（重量）CaCO3、0.1%饲用维生素（购自北京君德同创公司，商品名称为“猪通用多种维生素”），加水调节混合发酵培养基的湿度至50%，自然pH值，105℃蒸汽间歇式灭菌2次，每次1h，中间间歇3h。
二、获得种液：
1、发酵乳酸短杆菌三级种子培养液：将发酵乳酸短杆菌，置于乳酸菌液体培养基中，在37℃条件下进行三级种子培养，培养至细胞浓度>109CFU/mL。具体的，
（1）、挑取2～3接种环的菌体，接种于5mL乳酸菌液体培养基中，220rpm，37℃培养16小时，得一级种子培养液；
（2）、将5mL过夜培养的一级种子培养液接种于100mL乳酸菌液体培养基中，220rpm，37℃培养16小时，培养至细胞浓度>109CFU/mL，得二级种子培养液；
（3）、将100mL二级种子培养液接种于10L乳酸菌液体培养基中，220rpm，37℃培养16小时，培养至细胞浓度>109CFU/mL，得发酵乳酸短杆菌的三级种子培养液。
2、产朊假丝酵母三级种子培养液：将产朊假丝酵母，置于麦芽汁液体培养基中，在28℃条件下进行三级种子培养，培养至细胞浓度>109CFU/mL，得产朊假丝酵母的三级种子培养液。具体的，
（1）、挑取2～3接种环的菌体，接种于5mL麦芽汁液体培养基中，220rpm，28℃培养16小时，得一级种子培养液；
（2）、将5mL过夜培养的一级种子培养液接种于100mL麦芽汁液体培养基中，220rpm，28℃培养16小时，培养至细胞浓度>109CFU/mL，得二级种子培养液；
（3）、将100mL二级种子培养液接种于10L麦芽汁液体培养基中，220rpm，28℃培养16小时，培养至细胞浓度>109CFU/mL，得产朊假丝酵母的三级种子培养液。
3、混合种子培养液：将发酵乳酸短杆菌的三级种子培养液与产朊假丝酵母的三级种子培养液按照体积比1:0.1的比例混合。
4、混合种液：将混合种子培养液按体积比1：10的比例接种于混 合种子培养基中,培养温度30℃，搅拌速度220rpm，培养55h，培养至细胞浓度>109CFU/mL。
三、分段发酵：
1、将混合种液按照体积比1:10的比例接种于混合发酵培养基中。
2、先在30℃条件下好氧发酵12h。
3、然后在35℃条件下厌氧发酵60h，当混合物pH下降至4.0的稳定状态，且菌体数目达到107～108CFU/g时，停止发酵。
4、发酵物在40-50℃条件下烘干，包装得到成品。
该产品的主要技术指标如下：
微生物含量107～108CFU/g，pH<4.0，蛋白质含量24％以上，氨基酸的含量16%以上，纤维素含量2.4%左右，硫甙含量小于0.01%。
综上所述，本发明的方法具有以下优点：
1、生产条件比较简单，既可防止污染，又能最大程度地利用资源；
2、采用发酵乳酸短杆菌与产朊假丝酵母两种微生物混合发酵处理麸皮、玉米、小麦、米糠、豆粕、棉粕、菜粕、豆腐渣等，不仅增加了饲料中总的蛋白含量，粗蛋白的含量由发酵前的13%提高到了24%以上，而且氨基酸的含量也提高至16%以上，同时分解了纤维素等非淀粉类物质，饲料成品的纤维素含量下降至2.4%左右，大大提高了无抗生物发酵饲料的生物效价；
3、由该方法制备的饲料其适口性好，无抗生素和有毒物质，饲养效果好，食用安全。
需要说明的是，上述实施例不以任何形式限制本发明，凡采用等 同替换或等效变换的方式所获得的技术方案，均落在本发明的保护范围内。