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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201710599533.X (22)申请日 2017.07.21 (71)申请人 广西桂平市蒙圩镇柱强种养专业合 作社 地址 537222 广西壮族自治区贵港市桂平 市蒙圩镇流兰村上屯150号 (72)发明人 岑新标 (74)专利代理机构 重庆为信知识产权代理事务 所(普通合伙) 50216 代理人 刘旭章 (51)Int.Cl. A01H 4/00(2006.01) (54)发明名称 一种树莓的组织培养方法 (57)摘要 本发明公开了一种树莓的组织培养方法， 包 括外植体选取。
2、和消毒、 诱导培养、 增值培养、 生根 培养、 炼苗与移栽等步骤。 本发明提供树莓离体 组培快繁的成套技术， 每个阶段采用不同的激素 调节， 达到提高增殖率和减少变异的目的， 成活 种苗便于运输， 且对母本材料要求低、 成本低、 时 间短、 成活率高、 产品质量好， 实现了树莓种苗的 规模化、 标准化生产。 权利要求书1页 说明书5页 CN 107242136 A 2017.10.13 CN 107242136 A 1.一种树莓的组织培养方法， 其特征在于， 包括以下步骤： （1） 外植体选取和消毒： 选取树莓苗的2.53cm茎尖或带芽茎段作为树莓外植体， 去掉 叶片后， 用流水冲洗2535m。
3、in； 若树莓外植体表面带有绒毛， 用皂液或吐温洗涤后再用流 水冲洗3040min， 然后再进行消毒处理； （2） 诱导培养： 将经过消毒灭菌处理过的树莓外植体， 在无菌的条件下接种于诱导培养 基中， 于2226温度下培养2030d， 光周期为1012h/d,进行诱导培养， 培养至外植体 萌发叶分化成芽丛， 切下芽丛， 而外植体继续在诱导培养基中， 反复诱导培养至长出新芽 丛， 以2030d为周期转接继代一次； （3） 增殖培养： 将步骤 （2） 切下的芽丛转接至增殖培养基中， 于2530温度下培养40 50d， 光周期为1012h/d， 进行增殖培养， 每3035d继代一次， 得增殖倍数为2。
4、.53的芽 丛， 如此反复进行增殖培养至所需数量的芽丛， 并使芽丛长成23节、 高23cm的芽苗， 切 下； （4） 生根培养： 将步骤 （3） 切下的芽苗分成单株， 接种到生根培养基中诱导生根， 培养20 30d至每株生根46条， 根长23cm； （5） 炼苗与移栽： 将生根苗移到大棚79d后， 用温清水将苗上培养基洗净， 放入质量浓 度为0.1的多菌灵溶液中消毒23min后再移栽。 2.根据权利要求1所述的一种树莓的组织培养方法， 其特征在于： 在步骤 （1） ， 所述外植 体消毒为： 在无菌超净台中， 将清洗过的外植体依次在体积浓度为75的酒精中消毒处理 2535s、 在质量浓度为0.1。
5、0.15的氯化汞中灭菌处理79min、 在体积浓度为1.52 的次氯酸钠溶液中消毒处理2025min， 再用无菌水冲洗56次， 即可。 3.根据权利要求1所述的一种树莓的组织培养方法， 其特征在于： 在步骤 （2） ， 所述诱导 培养基为： 以MS培养基为基本培养基， 每升基本培养基中加入6-苄基嘌呤0.30.6mg、 萘乙 酸0.20.4mg、 白砂糖3035g和琼脂粉67g， pH=5.86.0。 4.根据权利要求1所述的一种树莓的组织培养方法， 其特征在于： 在步骤 （3） ， 所述增殖 培养基为： 以MS培养基为基本培养基， 每升基本培养基中加入6-苄基嘌呤0.61.0mg、 吲哚 乙。
6、酸0.10.5mg和白砂糖3540g， pH=5.86.0。 5.根据权利要求1所述的一种树莓的组织培养方法， 其特征在于： 在步骤 （4） ， 所述生根 培养基为： 以1/2MS培养基为基本培养基， 每升基本培养基中加入吲哚乙酸0.20.3mg、 康 基腺嘌呤0.10.3mg、 萘乙酸0.10.3mg和琼脂粉46g， pH=5.86.0。 6.根据权利要求1所述的一种树莓的组织培养方法， 其特征在于： 在步骤 （5） ， 所述炼苗 与移栽为： 将生根苗直接移栽到由栽培土与腐殖土按重量比1： 1.52组成的基质中， 上覆 盖塑料拱棚， 温度保持在2228， 湿度为7585%； 或者将生根苗直接。
7、移栽到由细河沙和 腐殖土按重量比1： 1.52.5组成的苗床中， 上覆盖塑料拱棚， 温度保持在2228， 湿度为 7585%。 7.根据权利要求1-6任一项所述的一种树莓的组织培养方法， 其特征在于： 在步骤 （2） 、 （3） 及 （4） ， 所述诱导培养、 增殖培养和生根培养的光照强度均为15002000lx。 权 利 要 求 书 1/1 页 2 CN 107242136 A 2 一种树莓的组织培养方法 技术领域 0001 本发明属于植物栽培技术领域， 具体涉及一种树莓的组织培养方法。 背景技术 0002 树莓， 又称覆盆子， 属蔷薇科悬钩子属， 是一种多年生小灌木类落叶果树。 树莓的 适。
8、应性广， 长势强。 在我国北方地区分布广泛， 树莓是当今世界发展最为迅速、 集营养与保 健于一身的第三代黄金水果。 目前对树莓的研究和开发主要集中于树莓引种和果实的加工 利用。 树莓常规的繁殖方法有分根法、 分株法、 扦插法和压条法等， 但上述繁殖方法繁殖速 度慢， 培养出的苗木繁育能力差、 果实小、 易脱落、 产量低， 且对母本材料要求高， 用量大， 还 受到季节的限制， 难以进行规模化、 标准化生产和优良品种的大面积推广。 此外， 目前运用 组织培养方法繁殖生产种苗的方法成本较高、 培养周期较长。 0003 因此， 需要寻找一套新的成本低、 时间短、 成活率高的无性繁殖体系来扩大树莓繁 殖。
9、量， 可以较好的提高种苗的繁育能力， 且种苗栽种后， 成果率高， 质量好， 进行树莓苗木的 产业化生产， 以满足市场需求。 发明内容 0004 本发明的目的在于： 针对上述存在的不足， 本发明提供了一种树莓的组织培养方 法， 提供树莓离体组培快繁的成套技术， 每个阶段采用不同的激素调节， 达到提高增殖率和 减少变异的目的， 成活种苗便于运输， 且对母本材料要求低、 成本低、 时间短、 成活率高、 产 品质量好， 实现了树莓种苗的规模化、 标准化生产， 得到优质种苗。 0005 为了达到上述目的， 本发明采用了以下技术方案： 一种树莓的组织培养方法， 包括以下步骤： （1） 外植体选取和消毒： 。
10、选取树莓苗的2.53cm茎尖或带芽茎段作为树莓外植体， 去掉 叶片后， 用流水冲洗2535min； 若树莓外植体表面带有绒毛， 用皂液或吐温洗涤后再用流 水冲洗3040min， 然后再进行消毒处理； （2） 诱导培养： 将经过消毒灭菌处理过的树莓外植体， 在无菌的条件下接种于诱导培养 基中， 于2226温度下培养2030d， 光周期为1012h/d,进行诱导培养， 培养至外植体 萌发叶分化成芽丛， 切下芽丛， 而外植体继续在诱导培养基中， 反复诱导培养至长出新芽 丛， 以2030d为周期转接继代一次； （3） 增殖培养： 将步骤 （2） 切下的芽丛转接至增殖培养基中， 于2530温度下培养40。
11、 50d， 光周期为1012h/d， 进行增殖培养， 每3035d继代一次， 得增殖倍数为2.53的芽 丛， 如此反复进行增殖培养至所需数量的芽丛， 并使芽丛长成23节、 高23cm的芽苗， 切 下； （4） 生根培养： 将步骤 （3） 切下的芽苗分成单株， 接种到生根培养基中诱导生根， 培养20 30d至每株生根46条， 根长23cm； （5） 炼苗与移栽： 将生根苗移到大棚79d后， 用温清水将苗上培养基洗净， 放入质量浓 说 明 书 1/5 页 3 CN 107242136 A 3 度为0.1的多菌灵溶液中消毒23min后再移栽。 0006 进一步地， 在步骤 （1） ， 所述外植体消毒。
12、为： 在无菌超净台中， 将清洗过的外植体依 次在体积浓度为75的酒精中消毒处理2535s、 在质量浓度为0.10.15的氯化汞中灭 菌处理79min、 在体积浓度为1.52的次氯酸钠溶液中消毒处理2025min， 再用无菌 水冲洗56次， 即可。 0007 进一步地， 在步骤 （2） ， 所述诱导培养基为： 以MS培养基为基本培养基， 每升基本培 养基中加入6-苄基嘌呤0.30.6mg、 萘乙酸0.20.4mg、 白砂糖3035g和琼脂粉67g， pH =5.86.0。 0008 进一步地， 在步骤 （3） ， 所述增殖培养基为： 以MS培养基为基本培养基， 每升基本培 养基中加入6-苄基嘌呤。
13、0.61.0mg、 吲哚乙酸0.10.5mg和白砂糖3540g， pH=5.86.0。 0009 进一步地， 在步骤 （4） ， 所述生根培养基为： 以1/2MS培养基为基本培养基， 每升基 本培养基中加入吲哚乙酸0.20.3mg、 康基腺嘌呤0.10.3mg、 萘乙酸0.10.3mg和琼脂 粉46g， pH=5.86.0。 0010 进一步地， 在步骤 （5） ， 所述炼苗与移栽为： 将生根苗直接移栽到由栽培土与腐殖 土按重量比1： 1.52组成的基质中， 上覆盖塑料拱棚， 温度保持在2228， 湿度为75 85%； 或者将生根苗直接移栽到由细河沙和腐殖土按重量比1： 1.52.5组成的苗床。
14、中， 上覆 盖塑料拱棚， 温度保持在2228， 湿度为7585%。 0011 进一步地， 在步骤 （2） 、（3） 及 （4） ， 所述诱导培养、 增殖培养和生根培养的光照强度 均为15002000lx。 0012 本发明中， 所述酒精、 氯化汞溶液、 次氯酸钠溶液、 无菌水、 6-苄基嘌呤、 萘乙酸、 吲 哚乙酸、 康基腺嘌呤、 白砂糖、 琼脂粉、 细河沙和腐殖土均为市面上销售的常规产品。 0013 综上所述， 本发明由于采用了上述方案， 具有以下积极效果： （1） 本发明用带芽茎段和茎尖作为外植体， 对外植体消毒杀菌处理后， 并对该外植体进 行反复多次诱导， 获得大量芽丛， 然后经过增殖培。
15、养和生根培养， 增殖系数为1316， 生根 率高达98%， 再经炼苗与移栽， 采用特殊的基质及合理的栽培条件， 获得大量种苗， 无需通过 采集大量外植体来获得无菌苗， 移栽成活率可达95%以上。 0014 （2） 本发明提供树莓离体组培快繁的成套技术， 每个阶段采用不同的激素调节， 达 到提高增殖率和减少变异的目的， 成活种苗便于运输， 且对母本材料要求低、 成本低、 时间 短、 成活率高、 产品质量好， 实现了树莓种苗的规模化、 标准化生产。 具体实施方式 0015 下面结合实施例对本发明一种树莓的组织培养方法， 作进一步说明。 0016 实施例1 一种树莓的组织培养方法， 包括以下步骤： 。
16、（1） 外植体选取和消毒： 选取树莓苗的2.5cm茎尖或带芽茎段作为树莓外植体， 去掉叶 片后， 用流水冲洗25min； 若树莓外植体表面带有绒毛， 用皂液或吐温洗涤后再用流水冲洗 30min， 然后再进行消毒处理； 所述外植体消毒为： 在无菌超净台中， 将清洗过的外植体依次 在体积浓度为75的酒精中消毒处理25s、 在质量浓度为0.1的氯化汞中灭菌处理7min、 在体积浓度为1.5的次氯酸钠溶液中消毒处理20min， 再用无菌水冲洗5次， 即可； 说 明 书 2/5 页 4 CN 107242136 A 4 （2） 诱导培养： 将经过消毒灭菌处理过的树莓外植体， 在无菌的条件下接种于诱导培养。
17、 基中， 于22温度下培养20d， 光周期为10h/d， 光照强度为1500lx， 进行诱导培养， 培养至外 植体萌发叶分化成芽丛， 切下芽丛， 而外植体继续在诱导培养基中， 反复诱导培养至长出新 芽丛， 以20d为周期转接继代一次； 所述诱导培养基为： 以MS培养基为基本培养基， 每升基本 培养基中加入6-苄基嘌呤0.3mg、 萘乙酸0.2mg、 白砂糖30g和琼脂粉6g， pH=5.86.0； （3） 增殖培养： 将步骤 （2） 切下的芽丛转接至增殖培养基中， 于25温度下培养40d， 光 周期为10h/d， 光照强度为1500lx， 进行增殖培养， 每30d继代一次， 得增殖倍数为2.5。
18、的芽 丛， 如此反复进行增殖培养至所需数量的芽丛， 并使芽丛长成23节、 高23cm的芽苗， 切 下； 所述增殖培养基为： 以MS培养基为基本培养基， 每升基本培养基中加入6-苄基嘌呤 0.6mg、 吲哚乙酸0.1mg和白砂糖35g， pH=5.86.0； （4） 生根培养： 将步骤 （3） 切下的芽苗分成单株， 接种到生根培养基中诱导生根， 光照强 度为1500lx， 培养20d至每株生根46条， 根长23cm； 所述生根培养基为： 以1/2MS培养基 为基本培养基， 每升基本培养基中加入吲哚乙酸0.2mg、 康基腺嘌呤0.1mg、 萘乙酸0.1mg和 琼脂粉4g， pH=5.86.0； （。
19、5） 炼苗与移栽： 将生根苗移到大棚7d后， 用温清水将苗上培养基洗净， 放入质量浓度 为0.1的多菌灵溶液中消毒2min后再移栽； 所述炼苗与移栽为： 将生根苗直接移栽到由栽 培土与腐殖土按重量比1： 1.5组成的基质中， 上覆盖塑料拱棚， 温度保持在22， 湿度为 75%； 或者将生根苗直接移栽到由细河沙和腐殖土按重量比1： 1.5组成的苗床中， 上覆盖塑 料拱棚， 温度保持在22， 湿度为75%。 0017 实施例2 一种树莓的组织培养方法， 包括以下步骤： （1） 外植体选取和消毒： 选取树莓苗的3cm茎尖或带芽茎段作为树莓外植体， 去掉叶片 后， 用流水冲洗35min； 若树莓外植体。
20、表面带有绒毛， 用皂液或吐温洗涤后再用流水冲洗 40min， 然后再进行消毒处理； 所述外植体消毒为： 在无菌超净台中， 将清洗过的外植体依次 在体积浓度为75的酒精中消毒处理35s、 在质量浓度为0.15的氯化汞中灭菌处理9min、 在体积浓度为2的次氯酸钠溶液中消毒处理25min， 再用无菌水冲洗6次， 即可； （2） 诱导培养： 将经过消毒灭菌处理过的树莓外植体， 在无菌的条件下接种于诱导培养 基中， 于26温度下培养30d， 光周期为12h/d， 光照强度为2000lx， 进行诱导培养， 培养至外 植体萌发叶分化成芽丛， 切下芽丛， 而外植体继续在诱导培养基中， 反复诱导培养至长出新 。
21、芽丛， 以30d为周期转接继代一次； 所述诱导培养基为： 以MS培养基为基本培养基， 每升基本 培养基中加入6-苄基嘌呤0.6mg、 萘乙酸0.4mg、 白砂糖35g和琼脂粉7g， pH=5.86.0； （3） 增殖培养： 将步骤 （2） 切下的芽丛转接至增殖培养基中， 于30温度下培养50d， 光 周期为12h/d， 光照强度为2000lx， 进行增殖培养， 每35d继代一次， 得增殖倍数为3的芽丛， 如此反复进行增殖培养至所需数量的芽丛， 并使芽丛长成23节、 高23cm的芽苗， 切下； 所述增殖培养基为： 以MS培养基为基本培养基， 每升基本培养基中加入6-苄基嘌呤1.0mg、 吲哚乙酸。
22、0.5mg和白砂糖40g， pH=5.86.0； （4） 生根培养： 将步骤 （3） 切下的芽苗分成单株， 接种到生根培养基中诱导生根， 光照强 度为2000lx， 培养30d至每株生根46条， 根长23cm； 所述生根培养基为： 以1/2MS培养基 为基本培养基， 每升基本培养基中加入吲哚乙酸0.3mg、 康基腺嘌呤0.3mg、 萘乙酸0.3mg和 说 明 书 3/5 页 5 CN 107242136 A 5 琼脂粉6g， pH=5.86.0； （5） 炼苗与移栽： 将生根苗移到大棚9d后， 用温清水将苗上培养基洗净， 放入质量浓度 为0.1的多菌灵溶液中消毒3min后再移栽； 所述炼苗与移。
23、栽为： 将生根苗直接移栽到由栽 培土与腐殖土按重量比1： 2组成的基质中， 上覆盖塑料拱棚， 温度保持在28， 湿度为85%； 或者将生根苗直接移栽到由细河沙和腐殖土按重量比1： 2.5组成的苗床中， 上覆盖塑料拱 棚， 温度保持在28， 湿度为85%。 0018 实施例3 一种树莓的组织培养方法， 包括以下步骤： （1） 外植体选取和消毒： 选取树莓苗的2.62.9cm茎尖或带芽茎段作为树莓外植体， 去 掉叶片后， 用流水冲洗2832min； 若树莓外植体表面带有绒毛， 用皂液或吐温洗涤后再用 流水冲洗3337min， 然后再进行消毒处理； 所述外植体消毒为： 在无菌超净台中， 将清洗过 的。
24、外植体依次在体积浓度为75的酒精中消毒处理2733s、 在质量浓度为0.110.14 的氯化汞中灭菌处理7.58.5min、 在体积浓度为1.61.9的次氯酸钠溶液中消毒处理 2124min， 再用无菌水冲洗56次， 即可； （2） 诱导培养： 将经过消毒灭菌处理过的树莓外植体， 在无菌的条件下接种于诱导培养 基中， 于2325温度下培养2327d， 光周期为10.511.5h/d， 光照强度为1600 1900lx， 进行诱导培养， 培养至外植体萌发叶分化成芽丛， 切下芽丛， 而外植体继续在诱导 培养基中， 反复诱导培养至长出新芽丛， 以2327d为周期转接继代一次； 所述诱导培养基 为： 。
25、以MS培养基为基本培养基， 每升基本培养基中加入6-苄基嘌呤0.40.5mg、 萘乙酸0.25 0.35mg、 白砂糖3134g和琼脂粉6.36.7g， pH=5.86.0； （3） 增殖培养： 将步骤 （2） 切下的芽丛转接至增殖培养基中， 于2629温度下培养43 47d， 光周期为11h/d， 光照强度为17001800lx， 进行增殖培养， 每3234d继代一次， 得 增殖倍数为2.62.9的芽丛， 如此反复进行增殖培养至所需数量的芽丛， 并使芽丛长成2 3节、 高23cm的芽苗， 切下； 所述增殖培养基为： 以MS培养基为基本培养基， 每升基本培养 基中加入6-苄基嘌呤0.70.9m。
26、g、 吲哚乙酸0.20.4mg和白砂糖3639g， pH=5.86.0； （4） 生根培养： 将步骤 （3） 切下的芽苗分成单株， 接种到生根培养基中诱导生根， 光照强 度为16001800lx， 培养2228d至每株生根46条， 根长23cm； 所述生根培养基为： 以1/ 2MS培养基为基本培养基， 每升基本培养基中加入吲哚乙酸0.230.27mg、 康基腺嘌呤0.15 0.25mg、 萘乙酸0.150.25mg和琼脂粉4.55.5g， pH=5.86.0； （5） 炼苗与移栽： 将生根苗移到大棚7.58.5d后， 用温清水将苗上培养基洗净， 放入质 量浓度为0.1的多菌灵溶液中消毒23mi。
27、n后再移栽； 所述炼苗与移栽为： 将生根苗直接 移栽到由栽培土与腐殖土按重量比1： 1.71.8组成的基质中， 上覆盖塑料拱棚， 温度保持 在2426， 湿度为7882%； 或者将生根苗直接移栽到由细河沙和腐殖土按重量比1： 1.8 2.2组成的苗床中， 上覆盖塑料拱棚， 温度保持在2426， 湿度为7882%。 0019 实施例4 一种树莓的组织培养方法， 包括以下步骤： （1） 外植体选取和消毒： 选取树莓苗的2.7cm茎尖或带芽茎段作为树莓外植体， 去掉叶 片后， 用流水冲洗30min； 若树莓外植体表面带有绒毛， 用皂液或吐温洗涤后再用流水冲洗 35min， 然后再进行消毒处理； 所述。
28、外植体消毒为： 在无菌超净台中， 将清洗过的外植体依次 说 明 书 4/5 页 6 CN 107242136 A 6 在体积浓度为75的酒精中消毒处理30s、 在质量浓度为0.13的氯化汞中灭菌处理8min、 在体积浓度为1.8的次氯酸钠溶液中消毒处理22min， 再用无菌水冲洗6次， 即可； （2） 诱导培养： 将经过消毒灭菌处理过的树莓外植体， 在无菌的条件下接种于诱导培养 基中， 于24温度下培养25d， 光周期为11h/d， 光照强度为1800lx， 进行诱导培养， 培养至外 植体萌发叶分化成芽丛， 切下芽丛， 而外植体继续在诱导培养基中， 反复诱导培养至长出新 芽丛， 以25d为周期。
29、转接继代一次； 所述诱导培养基为： 以MS培养基为基本培养基， 每升基本 培养基中加入6-苄基嘌呤0.45mg、 萘乙酸0.3mg、 白砂糖33g和琼脂粉6.5g， pH=5.86.0； （3） 增殖培养： 将步骤 （2） 切下的芽丛转接至增殖培养基中， 于27温度下培养45d， 光 周期为11h/d， 光照强度为1750lx， 进行增殖培养， 每33d继代一次， 得增殖倍数为2.7的芽 丛， 如此反复进行增殖培养至所需数量的芽丛， 并使芽丛长成23节、 高23cm的芽苗， 切 下； 所述增殖培养基为： 以MS培养基为基本培养基， 每升基本培养基中加入6-苄基嘌呤 0.8mg、 吲哚乙酸0.3。
30、mg和白砂糖37g， pH=5.86.0； （4） 生根培养： 将步骤 （3） 切下的芽苗分成单株， 接种到生根培养基中诱导生根， 光照强 度为1700lx， 培养25d至每株生根46条， 根长23cm； 所述生根培养基为： 以1/2MS培养基 为基本培养基， 每升基本培养基中加入吲哚乙酸0.25mg、 康基腺嘌呤0.2mg、 萘乙酸0.2mg和 琼脂粉5g， pH=5.86.0； （5） 炼苗与移栽： 将生根苗移到大棚8d后， 用温清水将苗上培养基洗净， 放入质量浓度 为0.1的多菌灵溶液中消毒3min后再移栽； 所述炼苗与移栽为： 将生根苗直接移栽到由栽 培土与腐殖土按重量比1： 1.75。
31、组成的基质中， 上覆盖塑料拱棚， 温度保持在25， 湿度为 80%； 或者将生根苗直接移栽到由细河沙和腐殖土按重量比1： 2组成的苗床中， 上覆盖塑料 拱棚， 温度保持在25， 湿度为80%。 0020 综上所述， 本发明用带芽茎段和茎尖作为外植体， 对外植体消毒杀菌处理后， 并对 该外植体进行反复多次诱导， 获得大量芽丛， 然后经过增殖培养和生根培养， 增殖系数为13 16， 生根率高达98%， 再经炼苗与移栽， 采用特殊的基质及合理的栽培条件， 获得大量种 苗， 无需通过采集大量外植体来获得无菌苗， 移栽成活率可达95%以上。 本发明提供树莓离 体组培快繁的成套技术， 每个阶段采用不同的激素调节， 达到提高增殖率和减少变异的目 的， 成活种苗便于运输， 且对母本材料要求低、 成本低、 时间短、 成活率高、 产品质量好， 实现 了树莓种苗的规模化、 标准化生产。 0021 以上所述仅为发明的较佳实施例而已， 并不用以限制本发明， 凡在本发明的精神 和原则之内， 所作的任何修改、 等同替换、 改进等， 均应包含在本发明的保护范围之内。 说 明 书 5/5 页 7 CN 107242136 A 7 。