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1、10申请公布号CN104212747A43申请公布日20141217CN104212747A21申请号201410474834622申请日20140917CGMCCNO928720140609C12N1/20200601B09C1/10200601C12R1/0120060171申请人黑龙江省科学院微生物研究所地址150010黑龙江省哈尔滨市道里区兆麟街68号72发明人牛彦波吴皓琼曹亚彬殷博安琦郭立姝甄涛74专利代理机构哈尔滨市伟晨专利代理事务所普通合伙23209代理人张金珠54发明名称一株具有解磷功能用于咪草烟降解的阴沟肠杆菌57摘要一株具有解磷功能用于咪草烟降解的阴沟肠杆菌，涉及一株阴沟肠。
2、杆菌。具有降解咪草烟和将难溶态的磷降解为可溶态磷的功能，为利用微生物降解解决除草剂咪草烟残留土壤污染的问题奠定了基础。本发明阴沟肠杆菌T02，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2014年6月9日，保藏编号为CGMCCNO9287。本发明阴沟肠杆菌T02不仅具有降解咪草烟的功能，该菌株还具有将难溶态的磷降解为可溶态磷的功能。用于降解土壤中残留除草剂咪草烟。83生物保藏信息51INTCL权利要求书1页说明书6页序列表2页附图2页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书6页序列表2页附图2页10申请公布号。
3、CN104212747ACN104212747A1/1页21一株具有解磷功能用于咪草烟降解的阴沟肠杆菌，其特征在于该阴沟肠杆菌为阴沟肠杆菌ENTEROBACTERCLOACAET02，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2014年6月9日，保藏编号为CGMCCNO9287。权利要求书CN104212747A1/6页3一株具有解磷功能用于咪草烟降解的阴沟肠杆菌技术领域0001本发明涉及一株阴沟肠杆菌。背景技术0002化学除草是目前应对农田杂草的最主要手段，其对农业丰产丰收、提高农业集约化程度、改善农民生活质量、降低劳动强度等起着非。
4、常重要的作用。从黑龙江省来说，由于农田耕地分布相对连片集中，土地肥沃，地势平坦等特点。特别适于集约化、机械化经营生产，所以化学除草剂的使用量非常大。但随着长残留性除草剂多年大量的使用，除草剂在农田土壤中残留累积，引起作物药害、造成作物减产，且使作物很难轮作倒茬，已成为很多地区的疑难问题。同时，也使农田生态环境破坏和农产品农药残留超标问题日益突出。随着农业由产量型向质量效益型的转变，长残留性除草剂已经成为绿色食品生产、种植业结构调整、食品安全、生态恢复以及农业可持续发展的重要障碍。如何解决这一问题，恢复土壤自身的生态系统，保证农业的可持续发展，成为了农业生产中的重中之重。0003目前在黑龙江省应。
5、用的长残留性除草剂主要有氯嘧磺隆、莠去津、咪草烟、异恶草酮、氟磺胺草醚等。涉及到的作物有大豆、玉米、小麦、亚麻等。其中大豆田长残留性除草剂覆盖面积最大，每年大约有75以上的大豆田在应用长残留性除草剂，最主要的是咪草烟又称咪唑乙烟酸。保守估计，咪草烟5水剂单剂年销售约3500T左右，使用面积为1331062106/HM2，几乎占到大豆田除草剂面积的70以上。所以因咪草烟造成的土壤残留污染也更加的严重。而利用微生物降解是解决除草剂咪草烟残留土壤污染最有效可行的方法，也是研究热点。发明内容0004本发明提供一株阴沟肠杆菌ENTEROBACTERCLOACAE菌株，具有降解咪草烟和将难溶态的磷降解为可。
6、溶态磷的的功能，为利用微生物降解解决除草剂咪草烟残留土壤污染的问题奠定了基础。0005本发明具有解磷功能用于咪草烟降解的阴沟肠杆菌为阴沟肠杆菌ENTEROBACTERCLOACAET02，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2014年6月9日，保藏编号为CGMCCNO9287。0006本发明阴沟肠杆菌T02为革兰氏阴性菌，短杆状，无芽孢，菌体宽约0611M，长约1230M。阴沟肠杆菌T02在牛肉膏蛋白胨培养基上生长菌落湿润、扁平、边缘整齐、直径0205CM，微黄色。阴沟肠杆菌T02为中温菌，最适生长温度为30，最适PH。
7、为70。0007本发明阴沟肠杆菌T02明胶液化缓慢，不水解七叶灵；赖氨酸不脱羧，有精氨酸双水解酶，甘油或肌醇发酵不产气，可利用丙二酸盐作为碳源。其余具体生化反应采用梅里埃VITEK2COMPACT全自动细菌鉴定及药敏分析系统对菌株的生化反应进行了鉴定，分析结果说明书CN104212747A2/6页4如表1表1中数字表示编号。0008表100092APPA3ADO4PYRA10H2S11BNAG12AGLTP17BGLU18DMAL19DMAN23PROA26LIP27PLE33SAC34DTAG35DTRE40ILATK41AGLU42SUCT46GLYA47ODC48LDC58O129R59。
8、GGAA61IMLTA5IARL7DCEL9BGAL13DGLU14GGT15OFF20DMNE21BXYL22BALAP29TYRA31URE32DSOR36CIT37MNT395KG43NAGA44AGAL45PHOS53IHISA56CMT57BGUR62ELLM64ILATA0010本发明阴沟肠杆菌T02通过16SRRNA序列比对分析，与肠杆菌属ENTEROBACTER内各种之间有极高的同源性，同源性为99。通过结合菌体形态特征、生长条件、生理生化鉴定结果确定阴沟肠杆菌T02属于肠杆菌属ENTEROBACTER。0011本发明阴沟肠杆菌T02不仅具有降解咪草烟的功能，该菌株还具有将难溶。
9、态的磷降解为可溶态磷的功能。0012本发明阴沟肠杆菌ENTEROBACTERCLOACAET02，属于肠杆菌属ENTEROBACTER，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2014年6月9日，保藏编号为CGMCCNO9287。附图说明说明书CN104212747A3/6页50013图1为本发明阴沟肠杆菌T02与GENBANK中收录的相近菌株的16SRRNA序列进行同源性比对所构建的系统发育树；图2为阴沟肠杆菌T02划线培养照片；图3是阴沟肠杆菌T02的菌体革兰氏染色照片；图4为阴沟肠杆菌T02在有机磷与无机磷培养基上生。
10、长形成的透明圈；图5为阴沟肠杆菌T02的生长曲线。具体实施方式0014本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。0015具体实施方式一本实施方式具有解磷功能用于咪草烟降解的阴沟肠杆菌为阴沟肠杆菌ENTEROBACTERCLOACAET02，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2014年6月9日，保藏编号为CGMCCNO9287。0016本实施方式阴沟肠杆菌T02为革兰氏阴性菌，短杆状，无芽孢，菌体宽约0611M，长约1230M。阴沟肠杆菌T02在牛肉膏蛋白胨培养基上生长菌落湿润、扁。
11、平、边缘整齐、直径0205CM，微黄色。阴沟肠杆菌T02为中温菌，最适生长温度为30，最适PH为70。0017参照伯杰细菌鉴定手册第八版和常见细菌系统鉴定手册对阴沟肠杆菌T02进行生理生化鉴定本实施方式阴沟肠杆菌T02明胶液化缓慢，不水解七叶灵；赖氨酸不脱羧，有精氨酸双水解酶，甘油或肌醇发酵不产气，可利用丙二酸盐作为碳源。0018具体实施方式二本实施方式阴沟肠杆菌ENTEROBACTERCLOACAET02由黑龙江省讷河市大豆田间土壤中分离得到。分离方法按以下步骤进行0019一、初筛将土样经过风干、粉碎、过筛处理后，称取50G土样加入到以咪草烟为唯一碳源和能源的基础盐培养基中，经过57天的液体。
12、摇床培养，培养温度30，转数160R/MIN；0020基础盐培养基由01GK2HPO4、004GCACO3、02GMGSO47H2O、01GNACL、0001GFESO47H2O、01GNH42SO4和1000MLH2O组成，PH7072，121，灭菌20MIN。临用时在100ML基础盐培养基中加入10咪草烟3ML，即每百毫升基础盐培养基中含咪草烟的净含量为03G；0021二、复筛将10ML初筛培养物在复筛培养基中经过连续2次的复筛培养，2次复筛的温度与转数同初筛；0022第一次复筛培养所用的复筛培养基为在100ML基础盐培养基中加入10咪草烟5ML，即每百毫升基础盐培养基中含咪草烟的净含量为。
13、05G。第二次复筛培养所用的复筛培养基为在100ML基础盐培养基中加入10咪草烟10ML，即每百毫升基础盐培养基中含咪草烟的净含量为10G。0023三、菌株分离纯化0024用1ML无菌吸管吸取1ML最后一次复筛的培养物，加入到9ML无菌水中进行10倍稀释，用1ML无菌吸管吸取01ML各梯度稀释液，加入每百毫升含10咪草烟05G固体基础盐培养平板中，用玻璃刮扒涂匀，在30的恒温培养箱中培养，13D后观察。挑取长得快的菌落进行划线分离培养，直至获得单菌落为止；划线培养的照片如图2所示。说明书CN104212747A4/6页60025四、菌株功能验证0026将分离得到的单菌落再转入每百毫升含10咪草。
14、烟5ML的基础盐培养基中培养，观察培养液的生长情况，将生长快、菌密度高的培养物的再进行划线分离反复纯化与培养，获得稳定的目标菌株，即为本实施方式的阴沟肠杆菌T02。0027阴沟肠杆菌ENTEROBACTERCLOACAET02的16SRRNA序列长度为1454BP，其序列提交至GENBANK获得的序列号为KM538690，16SRRNA序列如SEQIDNO1所示，将测序结果与GENBANK中的16SRRNA序列进行同源性比对，构建的系统发育树如图1所示，以确定菌株的种属关系。同源性分析结果表明，该序列与肠杆菌属ENTEROBACTER内各种之间有极高的同源性，同源性为99。通过结合菌体形态特征。
15、、生长条件、生理生化鉴定结果确定阴沟肠杆菌T02属于肠杆菌属ENTEROBACTER。0028菌株的功能验证试验0029一、咪草烟降解功能0030用无菌接种环挑取2环阴沟肠杆菌T02的斜面纯培养物，分别接入每百毫升含纯度为985咪草烟03G的无机盐培养液中和每百毫升含纯度为985咪草烟05G的肉汤培养液中，在30、150R/MIN振荡培养23天后，采用液相色谱测定培养液中的咪草烟残留量，以不加菌的各培养液为CK对照，计算咪草烟的降解率，如表2所示。有表中数据可知阴沟肠杆菌T02具有降解咪草烟的功能。0031表2T02菌株咪草烟降解效率00320033二、解磷能力0034采用平板法观察溶磷圈有无。
16、，采用钼锑抗比色法测定发酵液中的可溶态有效磷含量，从定性和定量2个角度确定菌株的解磷能力。如表3所示。0035无机磷与有机磷培养基配方如下0036葡萄糖100G，酵母粉05G，NH42SO405G，NACL03G，KCL03G，MGSO47H2O03G，FESO47H2O003G，MNSO44H2O003G，H2O1000ML，PH7072，121，灭菌20MIN。无机磷培养基在以上配方的基础上每百毫升加入卵磷脂002G、碳酸钙01G，有机磷培养基在以上配方的基础上每百毫升加入磷酸钙05G。固体培养基每百毫升需加琼脂粉18G。0037试验结果表明，T02菌株具有解无机磷和有机磷的能力。0038。
17、表3T02菌株解磷能力0039说明书CN104212747A5/6页70040三、以牛肉膏蛋白胨培养基对菌株进行了最佳生长条件的实验，测定不同PH、不同温度、不同发酵转数条件的菌密度，以及菌株的生长曲线，获得菌株的最佳培养条件。0041牛肉膏蛋白胨培养基配方牛肉膏30G、蛋白胨100G、NACL50G和H2O1000ML，121灭菌。0042种子液的制备采用无菌操作，用接种环挑取1环T02斜面培养物于含100ML牛肉膏蛋白胨培养基该培养基的PH调至70的三角瓶中，于30，150R/MIN，振荡培养16小时，获得T02种子液。00431、PH对菌株生长的影响0044用无菌移液管取01ML的T02。
18、种子液加入到含5ML牛肉膏蛋白胨培养基的试管中，该试管中培养基的PH已按需要调节，分别为30、50、70、90、110，每处理3个重复。于30培养箱中培养24HR，测定各发酵液在600NM的菌密度值。各不同处理以不接菌培养基为CK对照,取各重复的平均OD值。从表4可以看出，T02菌株最适生长的PH条件是70,菌株的最适PH范围是58，说明菌株生长的酸碱度为中性但略偏酸性。0045表4PH对菌株生长的影响0046PH30PH50PH60PH70PH80PH90PH110CK0098006400630063006400430064T020148103810651098098704680089004。
19、72、温度对菌株生长的影响0048用无菌移液管取01ML的T02种子液加入含5ML牛肉膏蛋白胨的培养液的18MM180MM试管中，该培养基基的PH为70，每处理3个重复。于15、20、25、28、30、35、40、45培养条件下培养24HR，测定各发酵液在600NM的菌密度值。各处理以不接菌培养基为CK对照,取各重复的平均OD值。从表5可以看出，菌株T02最适的生长温度的30，菌株的最适生长温度范围是2540。0049表5温度对菌株生长的影响0050152025283032354045CK003400350032003300320034003800320035T0202130432111212。
20、4612871256121311150618说明书CN104212747A6/6页800513、转数对菌株生长的影响0052用无菌移液管取1ML的T02种子液加入含200ML牛肉膏蛋白胨培养基的500ML三角瓶中，该培养基的PH为70，每个处理3个重复。于30条件下，转数分别为静止50R/MIN、100R/MIN、120R/MIN、150R/MIN、180R/MIN、200R/MIN条件下，培养24HR，测定各发酵液在600NM的菌密度值。各不同处理以不接菌培养基为CK对照,取各重复的平均OD值。从表6可以看出，该菌株为需氧菌，在转数为120R/MIN180R/MIN时，菌株的生长最好。005。
21、3表6转数对T02菌株生长的影响0054静止50100120150180200CK0054006400630063006400630064T02114220082134243229082531238900554、菌株生长曲线测定0056用无菌移液管取05ML的T02种子液加入到已灭菌PH为70的含50ML牛肉膏蛋白胨培养基的150ML三角瓶中，于30，转数150R/MIN，在培养0、2、4、6、8、16、18、20、22、24、26、30、36小时测定，稀释10倍后测定各时间段的菌密度，以不接菌的培养基为对照，绘制菌株的生长曲线，确定菌株的代时及生长进入稳定期的最佳生长时间。从菌株的生长曲线图。
22、可以看出该菌株在4小时就进入了对数快速生长期，在24HR时进入稳定期，超过36小时菌株生长进入后期。说明书CN104212747A1/2页9序列表黑龙江省科学院微生物研究所一株具有解磷功能用于咪草烟降解的阴沟肠杆菌111454RRNA肠杆菌属（ENTEROBACTER）阴沟肠杆菌T0216SRRNA序列1ACGCTGGCGGCAGGCCTAACACATGCAAGTCGAACGGTAGCACAGAGAGCTTGCTCTCGG60GTGACGAGTGGCGGACGGGTGAGTAATGTCTGGGAAACTGCCTGATGGAGGGGGATAACT120ACTGGAAACGGTAGCTAATACC。
23、GCATAACGTCGCAAGACCAAAGAGGGGGACCTTCGGGC180CTCTTGCCATCAGATGTGCCCAGATGGGATTAGCTAGTAGGTGGGGTAACGGCTCACCTA240GGCGACGATCCCTAGCTGGTCTGAGAGGATGACCAGCCACACTGGAACTGAGACACGGTC300CAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGCAAGCCTGATGCAG360CCATGCCGCGTGTATGAAGAAGGCCTTCGGGTTGTAAAGTACTTTCAGCGGGGAGGAAGG420TGTTGAG。
24、GTTAATAACCTCATCAATTGACGTTACCCGCAGAAGAAGCACCGGCTAACTCC480GTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAA540GCGCACGCAGGCGGTCTGTCAAGTCGGATGTGAAATCCCCGGGCTCAACCTGGGAACTGC600ATTCGAAACTGGCAGGCTAGAGTCTTGTAGAGGGGGGTAGAATTCCAGGTGTAGCGGTGA660AATGCGTAGAGATCTGGAGGAATACCGGTGGCGAAGGCGGCCCCCTGGACAAAGA。
25、CTGAC720GCTCAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTA780AACGATGTCGACTTGGAGGTTGTGCCCTTGAGGCGTGGCTTCCGGAGCTAACGCGTTAAG840TCGACCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGC900ACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTACTCTTGA960CATCCAGAGAACTTAGCAGAGATGCTTTGGTGCCTTCGGG。
26、AACTCTGAGACAGGTGCTGC1020ATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTTGTGAAATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCC1080TTATCCTTTGTTGCCAGCGGTTAGGCCGGGAACTCAAAGGAGACTGCCAGTGATAAACTG1140GAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGAGTAGGGCTACACACGTGC1200TACAATGGCGCATACAAAGAGAAGCGACCTCGCGAGAGCAAGCGGACCTCATAAAGTGCG1260序列表CN104212747A2/2页10TCGTAGTCCGGATTGGAGTCTGCAACTCGACTCCATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGT1320GGATCAGAATGCCACGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCAT1380GGGAGTGGGTTGCAAAAGAAGTAGGTAGCTTAACCTTCGGGAGGGCGCTTACCACTTTGT1440GATTCATGACTGGG1454序列表CN104212747A101/2页11图1图2图3说明书附图CN104212747A112/2页12图4图5说明书附图CN104212747A12。