一种获得结球甘蓝与甘蓝型油菜远缘杂交后代的方法.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201810300364.X (22)申请日 2018.04.04 (71)申请人 西北农林科技大学 地址 712100 陕西省咸阳市杨凌示范区邰 城路3号 (72)发明人 许忠民 张恩慧 王杏利 姜娇 李升娟 郭佳 马青山 石汶汶 吴晓凤 董艺 (74)专利代理机构 北京高沃律师事务所 11569 代理人 刘奇 (51)Int.Cl. A01H 1/02(2006.01) A01H 4/00(2006.01) (54)发明名称 一种获得结球甘蓝与甘蓝型油菜远缘杂交 后代的方法 。

2、(57)摘要 本发明提供了一种获得结球甘蓝与甘蓝型 油菜远缘杂交后代的方法， 属于生物技术育种领 域， 本发明包括1)选择结球甘蓝胞质雄性不育系 为母本， 以甘蓝型油菜恢复系为父本， 人工授粉 后进行隔离； 2)剪取授粉后915d的子房消毒； 3)离体培养1825d； 4)剥离离体培养1825d子 房里的胚珠， 诱导培养至萌发； 5)分化培养， 得F1 代幼苗； 6)分离F1代幼苗的侧芽， 接种于生根培 养基上， 得完整杂交苗。 本发明利用胚挽救技术 克服了结球甘蓝与甘蓝型油菜栽培种远缘杂交 时容易发生幼胚败育而无法获得杂种植株的问 题， 将油菜的优良恢复基因转入结球甘蓝胞质雄 性不育栽培种中。

3、， 恢复甘蓝的育性， 为甘蓝的种 质资源的创新与应用提供技术依据。 权利要求书1页 说明书8页 附图3页 CN 108308020 A 2018.07.24 CN 108308020 A 1.一种获得结球甘蓝与甘蓝型油菜远缘杂交后代的方法， 包括以下步骤： 1)选择结球甘蓝胞质雄性不育系栽培种为母本， 以甘蓝型油菜恢复系栽培种为父本， 人工授粉后进行隔离； 2)剪取步骤1)所述人工授粉后915d的子房， 消毒后得消毒子房； 3)将步骤2)得到的所述消毒子房接种于子房诱导培养基上， 子房诱导培养1825d； 所 述子房诱导培养基以B5为基本培养基， 还包括0.51.5mg/L的6-BA、 0.1。

4、0.5mg/L的NAA、 2535g/L的蔗糖、 610g/L的琼脂、 0.21的活性炭和最终质量浓度为0.31.2的水 解酪蛋白， pH值为5.56.5； 4)剥离步骤3)所述离体培养1825d子房里的胚珠接种于胚珠诱导培养基上诱导培养 812d， 得萌发的胚珠； 所述胚珠诱导培养基以MS为基本培养基， 还包括0.10.5mg/L的 GA、 0.10.5mg/L的NAA、 2535g/L的蔗糖、 610g/L的琼脂、 0.21的活性炭和最终质 量浓度为0.31.2的水解酪蛋白， pH值为5.56.5； 5)将步骤4)所述萌发的胚珠接种于分化培养基上分化培养714d， 得F1代幼苗； 所述分 。

5、化培养基以MS为基本培养基， 还包括0.20.8mg/L的6-BA、 2035g/L的蔗糖和610g/L的 琼脂， pH值为5.56.0； 6)分离步骤5)所述F1代幼苗的侧芽， 接种于生根培养基上生根培养614d， 得完整杂交 苗； 所述生根培养基以MS为基本培养基， 还包括0.050.15mg/L的NAA、 2035g/L的蔗糖和 68g/L的琼脂， pH值为5.56.0。 2.根据权利要求1所述的方法， 其特征在于， 步骤1)所述母本为秦甘58或秦甘68， 父本 为RFO-46。 3.根据权利要求1所述的方法， 其特征在于， 步骤2)所述消毒， 包括乙醇浸泡1050s后 升汞消毒1030。

6、min。 4.根据权利要求1所述的方法， 其特征在于， 步骤3)所述子房诱导培养的条件包括： 温 度2226， 光照强度11002000lux， 光照1014h/d。 5.根据权利要求1所述的方法， 其特征在于， 步骤4)所述胚珠诱导培养的条件包括： 温 度2226， 光照强度11002000lux， 光照1014h/d。 6.根据权利要求1所述的方法， 其特征在于， 步骤5)所述分化培养的条件包括： 2630 ， 光照强度11002000lux， 光照1014h/d。 7.根据权利要求1所述的方法， 其特征在于， 步骤6)所述生根培养的条件包括： 2527 ， 光照强度15002000lux。

7、， 光照1012h/d。 8.根据权利要求1所述的方法， 其特征在于， 步骤6)得到所述完整杂交苗后， 还包括炼 苗、 移栽。 9.根据权利要求8所述的方法， 其特征在于， 所述炼苗的方法包括将所述完整杂交苗置 于室内自然光下培养14d。 10.根据权利要求8所述的方法， 其特征在于， 所述移栽用基质包括体积比为(48):1: (15)的泥炭、 珍珠岩和蛭石。 权 利 要 求 书 1/1 页 2 CN 108308020 A 2 一种获得结球甘蓝与甘蓝型油菜远缘杂交后代的方法 技术领域 0001 本发明属于生物技术育种领域， 具体涉及一种获得结球甘蓝与甘蓝型油菜远缘杂 交后代的方法。 背景技术。

8、 0002 结球甘蓝(Brassica oleracea L.var.capitata L.， 2n18)简称甘蓝， 属十字花 科芸薹属甘蓝种， 是我国重要的蔬菜作物， 在全国各地均有栽培， 年栽培面积达到9105hm2 左右。 甘蓝的杂种优势比较明显。 Ogura细胞质雄性不育系的材料表现为母体遗传、 花粉败 育和雌蕊正常， 容易被恢复系材料的显性核恢复基因恢复育性， 但无法进行正常的自交分 离和进一步种质资源的创新。 0003 结球甘蓝和甘蓝型油菜都是十字花科中的重要栽培作物， 该油菜材料又为恢复系 材料， 结球甘蓝和甘蓝型油菜远缘杂交， 大大促进两种作物间的优异基因交流， 将油菜的恢 复。

9、系基因转到结球甘蓝雄性不育系材料上， 恢复甘蓝的育性， 为甘蓝的遗传育种与种质资 源的创新奠定了基础。 但两者由于受精后杂种胚、 胚乳和子房之间缺乏协调性， 导致幼胚不 发育或中途停止发育， 是远缘杂交育种工作的瓶颈。 0004 在十字花科蔬菜育种过程中胚挽救技术虽有一些报道。 例如： Diederichsen采用 远缘杂交结合胚挽救技术获得了西兰花与大白菜杂交的F1代， 连续回交之后将A基因组CR 基因转移到C基因组中； Snowdon等将抗黑胫病基因从白芥转移到了甘蓝型油菜； 胡大为等 以黑芥为母本、 诸葛菜为父本的正交组合获得了1株真杂种； 李俊等以白菜和芥蓝进行正反 杂交， 研究结果显。

10、示， 白菜芥蓝的平均杂种获得率(2.32)； 但到目前为止， 国内外几乎 没有利用幼胚挽救离体培养技术实现亲缘关系相对较远的十字花科结球甘蓝与甘蓝型油 菜种间杂交并获得杂交后代植株的案例， 而且培养周期长、 技术复杂。 发明内容 0005 有鉴于此， 本发明的目的在于提供一种获得结球甘蓝与甘蓝型油菜远缘杂交后代 的方法， 克服甘蓝与甘蓝型油菜栽培种远缘杂交时容易发生幼胚败育而无法获得杂种植株 的问题， 将油菜的优良恢复基因转入结球甘蓝胞质雄性不育栽培种中， 恢复甘蓝的育性。 0006 为了实现上述发明目的， 本发明提供以下技术方案： 0007 本发明提供了一种获得结球甘蓝与甘蓝型油菜远缘杂交后。

11、代的方法， 包括以下步 骤： 0008 1)选择结球甘蓝胞质雄性不育系栽培种为母本， 以甘蓝型油菜恢复系栽培种为父 本， 人工授粉后进行隔离； 0009 2)剪取步骤1)所述人工授粉后915d的子房， 消毒后得消毒子房； 0010 3)将步骤2)得到的所述消毒子房接种于子房诱导培养基上， 子房诱导培养18 25d； 所述子房诱导培养基以B5为基本培养基， 还包括0.51.5mg/L的6-BA、 0.10.5mg/L 的NAA、 2535g/L的蔗糖、 610g/L的琼脂、 0.21的活性炭和最终质量浓度为0.3 说 明 书 1/8 页 3 CN 108308020 A 3 1.2的水解酪蛋白，。

12、 pH值为5.56.5； 0011 4)剥离步骤3)所述离体培养1825d子房里胚珠接种于胚珠诱导培养基上诱导培 养812d， 得萌发的胚珠； 所述胚珠诱导培养基以MS为基本培养基， 还包括0.10.5mg/L的 GA、 0.10.5mg/L的NAA、 2535g/L的蔗糖、 610g/L的琼脂、 0.21的活性炭和最终质 量浓度为0.31.2的水解酪蛋白， pH值为5.56.5； 0012 5)将步骤4)所述萌发的胚珠接种于分化培养基上分化培养714d， 得F1代幼苗； 所述分化培养基以MS为基本培养基， 还包括0.20.8mg/L的6-BA、 2035g/L的蔗糖和6 10g/L的琼脂， 。

13、pH值为5.56.0； 0013 6)分离步骤5)所述F1代幼苗的侧芽， 接种于生根培养基上生根培养614d， 得完 整杂交苗； 所述生根培养基以MS为基本培养基， 还包括0.050.15mg/L的NAA、 2035g/L的 蔗糖和68g/L的琼脂， pH值为5.56.0。 0014 优选的， 步骤1)所述母本为秦甘58或秦甘68， 父本为RFO-46。 0015 优选的， 步骤2)所述消毒， 包括乙醇浸泡1050s后升汞消毒1030min。 0016 优选的， 步骤3)所述子房诱导培养的条件包括： 温度2226， 光照强度1100 2000lux， 光照1014h/d。 0017 优选的， 。

14、步骤4)所述胚珠诱导培养的条件包括： 温度2226， 光照强度1100 2000lux， 光照1014h/d。 0018 优选的， 步骤5)所述分化培养的条件包括： 2630， 光照强度11002000lux， 光 照1014h/d。 0019 优选的， 步骤6)所述生根培养的条件包括： 2527， 光照强度15002000lux， 光 照1012h/d。 0020 优选的， 步骤6)得到所述完整杂交苗后， 还包括炼苗、 移栽。 0021 优选的， 所述炼苗的方法包括将所述完整杂交苗置于室内自然光下培养14d。 0022 优选的， 所述移栽的基质包括体积比为(48):1:(15)的泥炭、 珍珠。

15、岩和蛭石。 0023 本发明提供了一种获得结球甘蓝与甘蓝型油菜远缘杂交后代的方法， 利用胚挽救 的方式克服了结球甘蓝和甘蓝型油菜远缘杂交时由于染色体数目、 结构不对等， 受精后杂 种胚、 胚乳和子房之间缺乏协调性， 导致幼胚不发育或中途停止发育无法获得杂一代植株 的问题， 同时甘蓝型油菜含有恢复系基因， 将其转到结球甘蓝雄性不育材料上， 恢复结球甘 蓝的育性； 选择授粉915d的幼胚培养， 可大大提高出胚率， 获得80的杂种后代， 获得杂 交后代的周期为35d， 相比于现有技术， 大大缩短胚挽救诱导时间。 附图说明 0024 图1为添加杂交授粉套袋隔离图； 0025 图2为子房诱导成愈伤组织图。

16、； 0026 图3为胚珠萌发后分化成苗图； 0027 图4为亲本与杂交种F1代植株叶型对比图， 其中4-1-1、 4-1-2为甘蓝型油菜， 4-2- 1、 4-2-2为杂交种F1代， 4-3-1、 4-3-2为结球甘蓝； 0028 图5为亲本与杂交种F1代植株的流式细胞仪检测结果图， 其中A为结球甘蓝， B为甘 蓝型油菜， C为杂交种F1代； 说 明 书 2/8 页 4 CN 108308020 A 4 0029 图6为亲本与杂种植物的SSR标记鉴定电泳图， 其中M1、 M2为DNAMarker， 14为结 球甘蓝， 57为甘蓝型油菜， 2734为真杂交种F1代。 具体实施方式 0030 本发。

17、明提供了一种结球甘蓝与甘蓝型油菜的远缘杂交方法， 包括以下步骤： 0031 1)选择结球甘蓝胞质雄性不育系栽培种为母本， 以甘蓝型油菜恢复系栽培种为父 本， 人工授粉后进行隔离； 0032 2)剪取步骤1)所述人工授粉后915d的子房， 消毒后得消毒子房； 0033 3)将步骤2)得到的所述消毒子房接种于子房诱导培养基上， 子房诱导培养18 25d； 所述子房诱导培养基以B5为基本培养基， 还包括0.51.5mg/L的6-BA、 0.10.5mg/L 的NAA、 2535g/L的蔗糖、 610g/L的琼脂、 0.21的活性炭和最终质量浓度为0.3 1.2的水解酪蛋白， pH值为5.56.5； 。

18、0034 4)剥离步骤3)所述离体培养1825d子房里的胚珠接种于胚珠诱导培养基上诱导 培养812d， 得萌发的胚珠； 所述胚珠诱导培养基以MS为基本培养基， 还包括0.10.5mg/L 的GA、 0.10.5mg/L的NAA、 2535g/L的蔗糖、 610g/L的琼脂、 0.21的活性炭和最终 质量浓度为0.31.2的水解酪蛋白， pH值为5.56.5； 0035 5)将步骤4)所述萌发的胚珠接种于分化培养基上分化培养714d， 得F1代幼苗； 所述分化培养基以MS为基本培养基， 还包括0.20.8mg/L的6-BA、 2035g/L的蔗糖和6 10g/L的琼脂， pH值为5.56.0； 。

19、0036 6)分离步骤5)所述F1代幼苗的侧芽， 接种于生根培养基上生根培养614d， 得完 整杂交苗； 所述生根培养基以MS为基本培养基， 还包括0.050.15mg/L的NAA、 2035g/L的 蔗糖和68g/L的琼脂， pH值为5.56.0。 0037 本发明选择结球甘蓝胞质雄性不育系栽培种为母本， 以甘蓝型油菜恢复系栽培种 为父本， 人工授粉后进行隔离。 在本发明中， 所述结球甘蓝胞质雄性不育系栽培种优选的为 结球甘蓝Ogura胞质雄性不育系栽培种， 更优选的为秦甘58或秦甘68(2n2x18)。 本发明 对母本甘蓝雄性不育系材料的来源没有特殊限定， 优选来源于西北农林科技大学园艺学。

20、院 种子库， 公众均可以得到。 本发明所述父本甘蓝型油菜恢复系栽培种优选的包括RFO-46(2n 4x38)， 本发明对父本甘蓝型油菜恢复系栽培种的来源没有特殊限定， 优选来源于陕西 省杂交油菜研究中心种子库， 公众均可以得到。 0038 本发明所述人工授粉， 优选的包括： 杂交前23d摘除母本已开放的花朵， 对未开 放母本花朵套袋隔离； 取套袋父本开花当天花药， 对母本花蕾进行剥蕾授粉， 授粉后套袋隔 离。 本发明所述杂交优选的在初花期进行， 摘除母本已开放的花朵， 可最大限度隔绝授粉对 杂交的影响。 本发明所述授粉时优选的对母本4mm左右的花蕾进行剥蕾授粉， 授粉后套袋隔 离， 可严格控制。

21、父本以外的花粉污染， 本发明对所述套袋的方法没有特殊限定， 授粉套袋后 效果如图1所示。 0039 授粉完成后， 本发明剪取所述人工授粉后915d的子房， 消毒后得消毒子房。 在本 发明中， 所述子房的获取时间优选的为人工授粉后1014d， 更优选的为1113d， 最优选的 为12d。 本发明选取915d的子房离体培养20d的目的是减少母株自体对杂交后子房内胚珠 发育的影响， 同时防止胚珠退化。 在本发明中， 所述消毒优选的包括乙醇浸泡1050s后升 说 明 书 3/8 页 5 CN 108308020 A 5 汞消毒1030min。 在本发明中， 所述乙醇优选的为体积浓度为6075的乙醇， 。

22、更优选的 为6572， 最优选的为70。 在本发明中， 所述乙醇浸泡的时间优选的为1540s， 更优选 的为2035s， 最优选的为30s。 本发明所述升汞优选的为质量浓度0.020.5的HgCl2， 更 优选的为0.060.2的HgCl2， 最优选的为0.1的HgCl2。 在本发明中， 所述升汞消毒的时 间优选的为1225min， 更优选的为1420min， 最优选的为15min。 本发明所述浓度乙醇浸 泡可保护幼胚不被伤害， 所述升汞消毒可大大减少接种幼胚后期免受细菌侵染， 提高幼胚 成活率。 0040 本发明所述消毒后优选的还包括用无菌水冲洗子房， 所述冲洗的次数优选为35 次， 更优选。

23、的为4次， 所述冲洗的时间优选的为每次38min， 更优选的为每次46min， 最优 选的为每次5min。 0041 得消毒子房后， 本发明将所述消毒子房接种于子房诱导培养基上， 子房诱导培养 2535d， 得愈伤组织。 本发明所述子房诱导培养基以B5为基本培养基， 还包括0.51.5mg/ L的6-BA、 0.10.5mg/L的NAA、 2535g/L的蔗糖、 610g/L的琼脂、 0.21的活性炭和最 终质量浓度为0.31.2的水解酪蛋白， pH值为5.56.5。 在本发明中， 添加适宜浓度6-BA 促进子房膨大和幼胚分化的作用； 所述6-BA的含量优选的为0.51.5mg/L， 更优选的。

24、为0.7 1.2mg/L， 最优选的为1mg/L； 低浓度的NAA促进子房膨大、 刺激细胞分裂和组织分化的同 时还促进植物生根； 所述NAA的含量优选的为0.10.5mg/L， 更优选的为0.20.4mg/L， 最 优选的为0.3mg/L。 本发明所述蔗糖的含量优选的为2632g/L， 更优选的为30g/L。 本发明 所述琼脂的含量优选的为79g/L， 更优选的为8g/L。 添加合适的活性炭和水解酪蛋白对子 房膨大、 胚珠萌发过程中释放的化学抑制物质有良好的吸附作用； 所述活性炭的质量浓度 优选的为0.30.8， 更优选的为0.40.6， 最优选的为0.5； 所述水解酪蛋白的质量 浓度优选的为。

25、0.41， 更优选的为0.450.6， 更优选的为0.5。 本发明对所述子房诱 导培养基的各组分来源没有特殊限定。 0042 本发明所述子房诱导培养的温度优选的为2226， 更优选的为2325， 最优 选的为24。 在本发明中， 所述子房诱导培养优选在光暗交替环境中培养， 所述子房诱导培 养的光照强度优选的为11002000lux， 更优选的为12001800lux， 最优选的为1500lux。 在本发明中， 所述子房诱导培养的光照时间优选的为1014h/d， 更优选的为1113h/d， 最 优选的为12h/d； 所述诱导培养的时间优选的为911d， 最优选的为10d， 得到的愈伤组织如 图2。

26、所示。 0043 本发明剥离所述愈伤组织的胚珠接种于胚珠诱导培养基上诱导培养812d， 得萌 发的胚珠。 本发明对所述剥离的方法没有特殊限定， 优选的将所述愈伤组织置于无菌滤纸 上剥离。 本发明所述胚珠诱导培养基以MS为基本培养基， 还包括0.10.5mg/L的GA、 0.1 0.5mg/L的NAA、 2535g/L的蔗糖、 610g/L的琼脂、 0.21的活性炭和质量浓度为0.3 1.2的水解酪蛋白， pH值为5.56.5； 在本发明中， 添加适宜浓度GA解除了细胞核中淀粉 酶的抑制剂， 促进幼胚萌发； 所述GA的含量优选的为0.10.5mg/L， 更优选的为0.1 0.3mg/L， 最优选。

27、的为0.1mg/L； 低浓度的NAA促进子房膨大、 刺激细胞分裂和组织分化的同 时还促进植物生根； 所述NAA的含量优选的为0.10.5mg/L， 更优选的为0.10.3mg/L， 最 优选的为0.1mg/L。 离体组织培养中种胚缺乏自养能力， 需要外源碳源蔗糖提供其生长发育 所需的碳骨架和能量， 同时维持培养基的渗透压； 所述蔗糖的含量优选的为2632g/L， 更 说 明 书 4/8 页 6 CN 108308020 A 6 优选的为30g/L； 添加适宜浓度的琼脂促进培养基在常温下固化形成固体培养基； 所述琼脂 的含量优选的为79g/L， 更优选的为8g/L。 添加合适的活性炭和水解酪蛋白。

28、对种胚萌发过 程中释放的抑制剂等有吸附作用， 促进幼胚萌发； 所述活性炭的质量浓度优选的为0.3 0.8， 更优选的为0.40.6， 最优选的为0.5； 所述水解酪蛋白的质量浓度优选的为 0.41， 更优选的为0.450.6， 更优选的为0.5。 本发明对所述诱导培养基的各组分 来源没有特殊限定。 0044 本发明所述诱导培养的温度优选的为2226， 更优选的为2325， 最优选的 为24。 在本发明中， 所述诱导培养优选在光暗交替环境中培养， 所述诱导培养的光照强度 优选的为11002000lux， 更优选的为12001800lux， 最优选的为1500lux。 在本发明中， 所 述诱导培养。

29、的光照时间优选的为1014h/d， 更优选的为1113h/d， 最优选的为12h/d； 所 述诱导培养的时间优选的为911d， 最优选的为10d。 0045 得到萌发的胚珠后， 本发明将所述萌发的胚珠接种于分化培养基上分化培养7 14d， 得F1代幼苗； 所述分化培养基优选的以MS为基本培养基， 还包括0.20.8mg/L的6-BA、 2035g/L的蔗糖和610g/L的琼脂， pH值为5.56.0。 在本发明中， 添加适宜浓度的6-BA 促进细胞分离和组织分化， 促进茎、 叶、 根的伸长生长； 所述6-BA的含量优选的为0.3 0.7mg/L， 更优选的为0.40.6mg/L， 最优选的为0。

30、.5mg/L。 离体幼胚缺乏自养能力， 添加蔗 糖为其提供生长所需的能量物质， 维持培养基的渗透压； 所述分化培养基中蔗糖的含量优 选的为优选的为2532g/L， 更优选的为3831g/L， 最优选的为30g/L； 添加一定量的琼脂 促进培养基固化形成固体培养基； 所述分化培养基中琼脂的含量优选的为79g/L， 更优选 的为8g/L。 本发明对所述分化培养基的各组分来源没有特殊限定。 0046 本发明所述分化培养的温度优选的为2630， 更优选的为2729， 最优选的 为28。 在本发明中， 所述分化培养的光照强度优选的为11002000lux， 更优选的为1200 1800lux， 最优选的。

31、为1500lux。 在本发明中， 所述分化培养的光照时间优选的为1014h/ d， 更优选的为1113h/d， 最优选的为12h/d。 在本发明中， 所述分化培养的时间优选的为7 14d， 更优选的为1013d， 最优选的为12d。 本发明实施例得到的F1代幼苗如图3所示。 0047 得到F1代幼苗后， 本发明分离所述F1代幼苗的侧芽， 接种于生根培养基上生根培养 614d， 得完整杂交苗； 所述生根培养基以MS为基本培养基， 还包括0.050.15mg/L的NAA、 2035g/L的蔗糖和68g/L的琼脂， pH值为5.8。 在本发明中， 所述侧芽的分离优选的在无 菌条件下进行， 分离时从分。

32、化培养基中取出F1代幼苗， 把幼苗新生出来的侧芽保留生长点 与母体分开， 将分出的侧芽置于生根培养基中培养614d， 直至形成完整的杂交苗。 0048 在本发明的所述生根培养基中， 所述NAA的含量优选的为0.080.12mg/L， 更优选 的为0.090.11mg/L， 最优选的为0.1mg/L； 所述蔗糖的含量优选的为2234g/L， 更优选的 为2832g/L， 最优选的为30g/L； 所述琼脂的含量优选的为8g/L。 在本发明中， 所述生根培 养基还具有一定的扩繁作用。 0049 本发明所述生根培养的温度2527， 所述生根培养的光照15002000lux， 所述 生根培养的时间优选的。

33、为614d， 更优选的为710d， 最优选的为8d。 0050 得到完整杂交苗后， 本发明优选的还包括炼苗、 移栽。 所述炼苗的方法优选的包 括： 将所述完整杂交苗置于室内自然光下培养14d， 更优选的为培养1.53d， 最优选的为 培养2d。 说 明 书 5/8 页 7 CN 108308020 A 7 0051 炼苗完成后， 本发明在移栽前， 优选的洗净所述炼苗后的杂交苗上的培养基， 再蘸 取多菌灵溶液， 所述多菌灵溶液的浓度优选的为0.3， 所述蘸取的时间优选的为710s， 本发明对所述多菌灵的来源没有特殊限定。 0052 本发明所述移栽用的基质优选的包括体积比为(48):1:(15)的。

34、泥炭、 珍珠岩 和蛭石， 更优选的比为(57)： 1： (24)， 最优选的比为6:1:3。 在本发明中， 所述移栽的培 养温度优选的为2630， 更优选的为2729， 最优选的为28。 在本发明中， 所述移栽 的培养湿度优选的为5090， 更优选的为6080， 最优选的为70。 在本发明中， 所述 移栽的培养时间优选的为1020d， 更优选的为1218d， 最优选的为15d。 0053 本发明所述移栽培养完成后即可大田种植， 所述种植时优选的带基质种植。 0054 下面结合实施例对本发明提供的结球甘蓝与甘蓝型油菜的远缘杂交方法进行详 细的说明， 但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。 。

35、0055 实施例1 0056 母本选用结球甘蓝Ogura胞质雄性不育系栽培种秦甘58(2n2x18)， 父本选用 油菜优良恢复系栽培种RFO-46(2n4x38)； 精选无病饱满的父母本种子以备种植， 常规 管理； 0057 在初花期于杂交前3d摘除母本花序上已开放的花朵， 对未开放花朵挂牌并套袋隔 离， 在套袋父本开花当天取花药， 同时对母本植株上4mm的花蕾进行剥蕾授粉； 0058 剪取授粉后11d的子房， 用70乙醇浸泡30s， 再用0.1HgCl2消毒15min， 然后用 无菌水冲洗4次， 每次5min； 0059 将消毒子房， 在无菌条件下接种于子房诱导培养基上， 培养20d； 00。

36、60 剥离诱导20d子房里的胚珠， 接种至胚珠诱导固体培养基上培养10d； 0061 将萌发的幼胚接种到分化培养基中， 在温度28、 光照强度1500lux、 光照12h/d培 养条件下直至幼胚发育成杂交种F1代幼苗； 0062 无菌条件下， 从分化培养基中取出杂交种F1代幼苗， 把幼苗新生出来的侧芽保留 生长点与母体分开， 将分出来的侧芽置于生根培养基中培养直至形成完整的杂种植株进行 扩繁， 直至诱导生根形成完整的杂种植株； 0063 完整的杂种植株在室内自然光下炼苗， 取出植株并洗净附着在其表面的培养基， 再蘸取配置好的多菌灵溶液， 将其移栽到泥炭： 珍珠岩： 蛭石为6： 1： 3的穴盘中。

37、， 置于温度28 、 相对湿度70的环境下， 培养15d后带土移栽， 下地种植， 种植成活后叶片如图4所示。 0064 实施例2 0065 母本选用结球甘蓝Ogura胞质雄性不育系栽培种秦甘68(2n2x18)， 父本选用 油菜优良恢复系栽培种RFO-46(2n4x38)； 精选无病饱满的父母本种子以备种植， 常规 管理； 0066 在初花期于杂交前2d摘除母本花序上已开放的花朵， 对未开放花朵挂牌并套袋隔 离， 在套袋父本开花当天取花药， 同时对母本植株上4mm的花蕾进行剥蕾授粉； 0067 剪取授粉后13d的子房， 用70乙醇浸泡30s， 再用0.1HgCl2消毒15min， 然后用 无菌。

38、水冲洗4次， 每次5min； 0068 将消毒子房， 在无菌条件下接种于子房诱导培养基上， 培养20d； 0069 剥离诱导20d子房里的胚珠， 接种至胚珠诱导固体培养基上培养10d； 说 明 书 6/8 页 8 CN 108308020 A 8 0070 将萌发的幼胚接种到分化培养基中， 在温度28、 光照强度1500lux、 光照12h/d培 养条件下直至幼胚发育成杂交种F1代幼苗； 0071 无菌条件下， 从分化培养基中取出杂交种F1代幼苗， 把幼苗新生出来的侧芽保留 生长点与母体分开， 将分出来的侧芽置于生根培养基中培养直至形成完整的杂种植株进行 扩繁， 直至诱导生根形成完整的杂种植株。

39、； 0072 完整的杂种植株在室内自然光下炼苗， 取出植株并洗净附着在其表面的培养基， 再蘸取配置好的多菌灵溶液， 将其移栽到泥炭： 珍珠岩： 蛭石为6： 1： 3的穴盘中， 置于温度28 、 相对湿度70的环境下， 培养15d后带土移栽， 下地种植。 0073 实验例 0074 对实施例1及实施例2共得到的10株杂交植株进行杂交真实性验证： 0075 (1)细胞学鉴定： 用Sysmex CyFlow Cube8流式细胞仪对杂交后代进行倍性鉴定。 0076 配置溶液： 溶液I是柠檬酸4.2g， 0.5吐温20， 定容至200mL， 4下保存备用； 溶液 II是磷酸二氢钠28.65g， PI20。

40、mg， 定容至200mL。 0077 取20mg洗净去除中脉的亲本及杂交种F1代幼苗的新叶置于塑料培养皿中， 用双面 刀片将叶片切碎， 用1mL移液枪吸取切好的样品经350目尼龙筛网过滤到1.5mL的Eppendorf 管中， 加入新鲜的I溶液400 L悬浮沉淀， 用流式细胞仪测样时再向样品中加入800 L溶液 II， 根据亲本峰值对应的荧光强度横坐标位置来判断杂交种F1代植株的倍性， 结果如图4所 示， 以甘蓝(2C)为标准， G1期荧光强峰值位于180位置， 甘蓝型油菜G1期荧光强峰值位于320 位置， 杂种单株G1期荧光强度峰值对应的位置位于两亲本荧光峰值位置之间， 峰值位置近 双亲峰值。

41、位置的平均值250， 推测8株F1代杂种植株为三倍体植株， 符合AAC染色体组成； 其 余2株假杂种的荧光峰值位置均位于甘蓝亲本位置。 0078 (2)分子鉴定： 分别提取母本结球甘蓝雄性不育系栽培种、 父本油菜优良恢复系栽 培种以及杂交种F1代植株材料的基因组DNA， 将其分别作为模板， SSR引物BoE-134引物序列 为BoE134-F： 5 -CTCTTATTTCTTGTAGGGCTTTTA-3 ， BoE134-R： 5 -CCGTTGGAGATGACTGACTG-3 进行PCR反应： PCR反应体系： 100ng/ L DNA模板1 L， 10Buffer1 L， Mg2+为0.8。

42、 L， DNTP (2.5mmol/L)0.8 L， 上下游引物(10 mol/L)各0.4 L， Taq DNA酶(5U/ L)0.1 L， 加无菌超纯 水5.5 L至反应体积为10 L； 将上述成分混合离心， PCR扩增仪上扩增， 扩增程序为94预变 性5min， 94变性30s， 合适退火温度30s， 72延伸45s， 35个循环， 72延伸7min， 对反应产 物进行6聚丙烯酰胺凝胶电泳分析， 凝胶成像仪上观察照相并标记， 结果如图5所示。 根据 在杂种植株的凝胶电泳带型上有无亲本的特异扩增条带， 在早期鉴定杂种植株是否为真杂 种， 若F1代植株的电泳条带上均有父母本的特异性扩增条带，。

43、 则可判断其为真杂种， 若无则 为假杂种。 0079 结果显示， 杂交种F1代植株有8株带型上均扩增到了父母本的特异性条带， 鉴定结 果表明其为真杂种， 其余2株为假杂种。 与此同时还扩增到了父母本特异性条带以外的条 带， 这正是远缘杂交种同近缘杂交种相比， 除了具有双亲的遗传特性产生基因重组的同时 还会产生新的基因型。 0080 (3)经过细胞学鉴定和分子鉴定的8株杂交种F1代植株， 经过种植后， 形态如图4所 示， 均介于父母本之间， 生长旺盛， 叶基部纵向排列23对翅状小叶， 叶色呈现黄绿色， 叶表 部蜡粉较少， 叶表和叶背都有刺毛， 叶缘有锯齿， 叶脉多且明显， 有叶耳、 叶裂， 后代。

44、出现性 说 明 书 7/8 页 9 CN 108308020 A 9 状分离。 整体叶型偏像父本甘蓝型油菜， 呈超亲优势。 0081 由以上实施例可知， 本发明提供的一种结球甘蓝与甘蓝型油菜的远缘杂交方法， 解决了亲缘关系较远的甘蓝型油菜与甘蓝胞质雄性不育系在进行远缘杂交时的杂种胚败 育， 难以获得杂交种F1代植株等问题， 且杂种率达80， 并且还可以产生新的基因型。 0082 以上所述仅是本发明的优选实施方式， 应当指出， 对于本技术领域的普通技术人 员来说， 在不脱离本发明原理的前提下， 还可以做出若干改进和润饰， 这些改进和润饰也应 视为本发明的保护范围。 说 明 书 8/8 页 10 CN 108308020 A 10 图1 图2 图3 说 明 书 附 图 1/3 页 11 CN 108308020 A 11 图4 说 明 书 附 图 2/3 页 12 CN 108308020 A 12 图5 图6 说 明 书 附 图 3/3 页 13 CN 108308020 A 13 。