一种防治鱼病的饲料添加剂及其制备、使用方法.pdf

本发明的目的是提供一种防治鱼病的饲料添加剂及其制备、使用方法。该防治鱼病的饲料添加剂是基于有效的防治鱼疾病作用效果，以茶茎和/或茶梗作为原料，粉碎成粉末或制备提取物而制成。本发明利用冬季修剪茶树获得的茶茎、茶梗等为质量稳定、易获得的原料来制备防治鱼病的饲料添加剂，利用了茶茎、茶梗富含茶多酚等抗菌、抗病毒、防霉和抗氧化活性成分，且咖啡因等生物碱含量明显减少而不具备中枢兴奋作用等特点，避免了抗生素药物的使用，具有成本低、无药物残留、无耐药性、无毒副作用等优点，制备时工艺简单、耗能低、无污染，非常容易实现产业化，为茶农的茶园废料提供了新的用途，具有很好的经济和社会效益。

1.一种防治鱼病的饲料添加剂，其特征在于以茶茎和/或茶梗作为原料，粉碎成粉末或制备提取物而制成。 2.根据权利要求1所述的防治鱼病的饲料添加剂，其特征在于所述粉末的粒径小于0.85mm。 3.根据权利要求1所述的防治鱼病的饲料添加剂，其特征在于所述茶茎、茶梗是在冬季修剪茶树时获得的。 4.根据权利要求1所述的防治鱼病的饲料添加剂的制备方法，其特征在于所述提取物的制备过程如下：将原料粉碎成粉末并投入到溶剂中形成溶液，将溶液通过加热提取、微波提取或者超声提取得到提取物；所述粉末与溶剂的重量比为5:1～50；所述溶剂为水或者乙醇或者含水乙醇。 5.根据权利要求1所述的防治鱼病的饲料添加剂的制备方法，其特征在于所述提取物的制备过程如下：将原料粉碎成粉末并投入到水中形成一次溶液，将一次溶液加热预定时间后，将一次溶液进行过滤得到一次滤渣和一次滤液；将一次滤渣再次投入水中形成二次溶液，将二次溶液加热预定时间后，将二次溶液进行过滤得到二次滤渣和二次滤液，将一次滤液、二次滤液混合后，进行浓缩、冷冻、干燥得到提取物。 6.根据权利要求1所述的防治鱼病的饲料添加剂的使用方法，其特征在于当防治鱼病的饲料添加剂为粉末状时，将防治鱼病的饲料添加剂混合入饲料中并搅拌均匀，所述防治鱼病的饲料添加剂与饲料的重量比为1～5：1000；当防治鱼病的饲料添加剂为液态提取物时，先将防治鱼病的饲料添加剂稀释到体积倍数的40倍后，再洒入饲料中并搅拌均匀，所述防治鱼病的饲料添加剂与饲料的重量比为0.5～2：1000。

技术领域

本发明属于水产养殖技术领域，具体涉及到一种防治鱼病的饲料添加剂及其制备、使用方法。

背景技术

近年来，随着人民生活水平的提高，鱼的消费量也逐年增加，进而带动了国内水产集约化程度的不断发展。然而在水产养殖中，由于水质的富营养化、高密度饲养及多种病原菌引起的水产动物疾病日益严重，危害水产养殖业。引起鱼类细菌性疾病的有嗜水气单胞菌，弧菌，爱德华氏菌及肠球菌等，引起鱼类病毒感染的有口白症病毒等。

目前对鱼病的防治主要采用抗生素药物。由于长期使用或滥用抗生素，其负面效应也日益显露，不仅影响生产，同时引起细菌产生耐药性和抗生素残留等问题，造成环境污染，人们长期食用有抗生素残留的制品，容易引起过敏反应、毒性反应等，危害人们的健康。尽管疫苗具有一定的作用，但预防单一，且效果并不稳定，难以对应病毒的快速变异。因此，一种安全、高效、无残留、无耐药、抗菌、抗病毒及抗感染作用的防治水产养殖动物疾病的新对策，无论是对于养殖业自身的可持续发展，还是对消费者的健康，都是至关重要，且具有着巨大的市场空间。

发明内容

本发明的目的是提出一种具有抗菌、抗病毒和抗感染作用的防治鱼病的饲料添加剂及其制备、使用方法，以促进集约化鱼养殖业的发展。

在本发明中，所述的鱼病是寄生虫症、细菌及病毒感染症, 本发明的应用对象为鲑鱼类、鲀鱼类、鲷鱼、鰤鱼类、鲽鱼类及鲤鱼类等，当然本发明也适用于虾和其他水产养殖过程中的疾病防治。

本发明的防治鱼病的饲料添加剂以茶茎和/或茶梗作为原料，粉碎成粉末或制备提取物而制成。

在本发明中，上述粉末的粒径小于0.85 mm，以便于鱼消化吸收，并减少对鱼消化系统的损害。

进一步地，为降低成本，所述茶茎、茶梗是在冬季修剪茶树时获得的。目前冬季修剪茶树时，所修剪下来的茶茎、茶梗均当做废物处理，将其用于防治鱼病的饲料添加剂，属于废物利用，成本接近于零，大大提高了市场竞争力。

本发明的防治鱼病的饲料添加剂的机理如下：

近年来，随着机械化采茶和制茶的广泛普及，使得茶叶的采集和生产过程中产生大量茶茎、茶梗等茶叶废弃物。至今为止的研究证明，茶茎、茶梗等富含茶多酚类化合物，其中表儿茶素（EC）、表儿茶素没食子酸酯（ECG）、表没食子儿茶素（EGC）和表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）占儿茶素总量的70%左右，具有显著的抗菌、抗病毒、抗炎、抗氧化及抗突变等多种生物活性。此外，茶叶中的咖啡因等嘌呤类生物碱虽然具有促进消化等作用，但由于该类化合物具有较强的中枢神经兴奋作用而不适合用于饲料添加剂。与茶叶相比茶梗和茶茎中的咖啡因等生物碱含有少，而富含茶多酚和纤维，因此有益于制备用于防治鱼病的饲料添加剂。

下面为茶茎、茶梗及茶树叶提取物的制备与成分分析：

茶茎、茶梗及芽茶由贵州宏鑫茶业开发有限公司提供。实验准确称取干燥茶茎、茶梗及芽茶各500g，经粉碎机粉碎后回收细粉，加入10倍量的水溶液，加热提取30分钟，提取液经纱布过滤后，滤饼再用相同条件提取1次，纱布过滤，合并两次滤液。滤液浓缩后，经冷冻干燥得提取物用于本研究。鉴于茶茎、茶梗及茶提取物是以饲料添加剂作为最终产品开发，故从安全性角度考虑提取溶剂尽量选择水、乙醇或含水乙醇为宜。提取时茶茎、茶梗及茶与溶剂的比率没有特定限制，但一般茶茎、茶梗及茶与溶剂的比例5:1～50范围为宜。本发明对提取温度没有特定限制，从室温到溶剂沸点范围都可适用。当然室温、常压及在溶剂沸点范围内提取最为理想。提取方法可以采用加热提取、超声提取、微波提取等，也可多种方法结合起来应用。提取时间从30分钟到24小时范围均可以。

本实验采用的分析方法为高效液相色谱法。DIONEX液相分析仪为Ultimate 3000型，电子天平为Sartorius BP211D十万分之一型，恒温干燥箱为德国Memmert型，超纯水仪为Merck millipore公司，小型粉碎机为杭州熊火科技有限公司，乙腈为Fisher（色谱纯），甲酸为广州化学试剂厂（分析纯）。对照品咖啡因（Caffeine， Caff），可可碱（Theobromine， Tb），没食子儿茶素没食子酸酯（（-）-Gallocatechin gallate， GCG），表没食子儿茶素没食子酸酯（（-）-Epigallocatechin gallate， EGCG）购自日本和光纯药株式会社；没食子酸（Gallic acid， GA），儿茶素（（+）-Catechin， C）购自美国Sigma公司；没食子儿茶素（（-）- Gallocatechin， GC），表没食子儿茶素（Epigallocatechin， EGC），表儿茶素（Epicatechin， EC）购自日本栗田工业株式会社；表儿茶素没食子酸酯 （（-）- Epicatechin-3-gallate， ECG）购自上海晶纯生化科技股份有限公司。

色谱条件，色谱柱为COSMOSIL 5C18-AR-II （4.6*250 mm， 5 μm， Nacalai tesque. Inc.， Japan），流速为1 ml / min，定量检测波长为231 nm，柱温为35 ℃，进样量为20 μl。流动相A：H2O（含0.1%甲酸）；流动相B：CH3CN（含0.1%甲酸）。供试样品经蒸馏水溶解后离心，经0.45µm水膜过滤后进HPLC分析，样品中各成分含量见表1。

表 1. 茶茎、茶梗及芽茶提取物中生物碱及多酚类化合物含量（%）

提取物成分 芽茶 茶茎 茶梗 GA 0.14 0.15 0.19 Tb 0.28 0.08 0.04 GC 0.74 0.16 0.04 EGC 2.56 0.51 ― C 0.26 0.23 0.14 Caff 3.27 0.93 0.28 EC 0.87 0.56 0.14 EGCG 4.53 1.22 ― GCG 1.52 0.06 ― ECG 1.78 1.02 0.04

―: 未检测出。

表1为茶茎、茶梗及茶叶提取物中的儿茶素和咖啡因的含量，茶茎、茶梗提取物中的咖啡因含量显著低于茶叶提取物，能够明显减少对鱼的中枢兴奋作用，同时其富含的儿茶素等多酚类抗菌、抗病毒活性成分，有利于饲料在饲料添加剂上的应用。

下面继续测试及分析茶茎及茶梗提取物的抗病原菌作用：

实验使用JG101，TPS-30，CCH201，IB101和4lns301等五种最常见的鱼类致病嗜水气单胞菌，LB 培养基是由酵母膏 5. 0 g/L，蛋白胨 10. 0 g/L，氯化钠 10. 0 g/L，固体培养基加 2%的琼脂制备而成。实验将菌株活化后用接种于固体培养基上37℃条件下培养 24 小时后，接种到液体培养基中震荡培养15小时。采用麦氏比浊法将菌液用液体培养基稀释到106 CFU/mL浓度用于本实验。活性评价采用琼脂扩散法，即将6 mm滤纸片经灭菌后，分别浸入50%乙醇配成 0.5 g/mL浓度的茶茎及茶梗提取物，无菌条件下贴在涂有菌液的 LB 固体培养基上，并用EGCG和 50%乙醇为对照，37℃条件下培养24 小时后检测抑菌圈直径，每种提取物 5次重复。抑菌圈≥20 mm为显效；10-19 mm为有效；10 mm 以下为无抑菌活性。实验结果如表2所示，茶茎及茶梗提取物和微粉都具有显著的抑菌活性。

表 2. 茶茎及茶梗提取物对嗜水气单胞菌的抑菌圈的测定结果（n=5/抑菌圈直径mm） ：

实验组别 JG101 TPS-30 CCH201 IB101 4lns301 EDCG 21.4±0.8 22.0±1.7 20.8±0.6 20.4±0.9 21.5±1.1 茶茎/茶梗提取物 19.1±0.5 18.7±0.6 19.8±0.8 18.2±0.7 19.5±1.2 茶茎/茶梗微粉 18.4±0.8 16.8±0.8 17.9±1.1 16.8±0.7 18.6±1.2 50%乙醇 5.1±0.4 5.2±0.6 4.8±0.9 5.0±0.5 4.8±1.0

从表2中可以看出，茶茎、茶梗的提取物对五种最常见的鱼类致病嗜水气单胞菌均显示出较强的抑菌活性，因此可用由于上述病菌造成的鱼病的防治。

下面测试及分析茶茎/茶梗饲料添加剂对鲫鱼生产性能的影响：

基础饲料组成为，鱼粉10%、豆粕20% 、麸皮30% 、米糠35%、酵母粉2%、矿物质添加剂 1.5%、维生素添加剂 1%及无机盐0.5% 。 悬浮鱼饲料制备为，以基础饲料为载体，分别添加5%的茶茎/茶梗提取物或微粉，在搅拌机内充分混匀后制粒，以喷油用量控制在0.05%的蜂蜡饱和脂肪酸经喷流床对饲料喷涂色膜后热风干燥，用于本实验。饲料添加剂对鱼生产性能使用效果实验选用平均体重32克左右规格一致的鲫鱼150尾，经统计分析体重无显著差异，用3%食盐水溶液消毒后，随机分组，每组50尾，放入1.0m Χ1.0m Χ 1.0m水槽中放养。每天9：00和16:00投食，投食量为平均体重的5%，每两天排污换水一次，溶解氧保存在5mg/L以上。整个实验期间水温保持25-26°C，实验持续8周。实验结束后，鱼体称重和计算增重率。 实验结果如表3所示，茶茎/茶梗饲料添加剂能够提高鱼增重，降低饲料比分，促进养殖效益。

表3. 茶茎/茶梗饲料添加剂对鲫鱼生产性能的影响

实验组别 始体重（克） 末体重（克） 净增重（克） 增重率（%） 对照组 32.08 ± 0.12 60.41 ± 3.62 28.33 88.31 茶茎/茶梗提取物 32.11 ± 0.22 66.62 ± 5.22 34.51 107.47 茶茎/茶梗微分 32.06 ± 0.16 65.34 ± 4.43 33.28 103.80

下面测试及分析茶茎/茶梗饲料添加剂对鲫鱼病原菌感染的保护作用：

将上述茶茎/茶梗饲料添加剂喂养8周鲫鱼用于病原菌感染实验。实验将致病性嗜水气单胞菌TPS-30株活化后以无菌生理盐水稀释致浓度为2×108CUP/mL。按每100 g鱼重腹腔注射菌液1.0 mL后，放入1.0m Χ1.0m Χ 1.0m水槽中放养。每天9：00和16:00投食，投食量为平均体重的5%，每两天排污换水一次，溶解氧保存在5mg/L以上。整个实验期间水温保持25-26°C，每天观察鱼体死亡情况，观察一周，统计死亡率。实验结果如表4所示，茶茎/茶梗饲料添加剂喂养8周后提高了鲫鱼对嗜水气单胞菌的抗感染能力。显著降低了死亡率，对嗜水气单胞菌感染有较强保护作用。

表4. 茶茎/茶梗饲料添加剂对鲫鱼病原菌感染的保护作用

实验组别 感染鱼尾数 死亡数 死亡率（%） 保护率（%） 对照组 50 50 100 - 茶茎/茶梗提取物 50 26 52 48 茶茎/茶梗微分 50 28 56 44

本发明中提到的茶茎、茶梗提取物的制备方法有以下两种：

1、将原料粉碎成粉末并投入到溶剂中形成溶液，将溶液通过加热提取、微波提取或者超声提取得到提取物；所述粉末与溶剂的重量比为5:1～50；所述溶剂为水或者乙醇或者含水乙醇。

2、将原料粉碎成粉末并投入到水中形成一次溶液，将一次溶液加热预定时间后，将一次溶液进行过滤得到一次滤渣和一次滤液；将一次滤渣再次投入水中形成二次溶液，将二次溶液加热预定时间后，将二次溶液进行过滤得到二次滤渣和二次滤液，将一次滤液、二次滤液混合后，进行浓缩、冷冻、干燥得到提取物。

上述两种提取物的制备方法均可将茶茎、茶梗中的有效成分析出。

上述防治鱼病的饲料添加剂的使用方法如下：当防治鱼病的饲料添加剂为粉末状时，将防治鱼病的饲料添加剂混合入饲料中并搅拌均匀，所述防治鱼病的饲料添加剂与饲料的重量比为1～5：1000；当防治鱼病的饲料添加剂为液态提取物时，先将防治鱼病的饲料添加剂稀释到体积倍数的40倍后，再洒入饲料中并搅拌均匀，所述防治鱼病的饲料添加剂与饲料的重量比为0.5～2：1000。

本发明利用冬季修剪茶树获得的茶茎、茶梗等为质量稳定、易获得的原料来制备防治鱼病的饲料添加剂，利用了茶茎、茶梗富含茶多酚等抗菌抗病毒活性成分，且咖啡因等生物碱含量明显减少的特点，避免了抗生素药物的使用，具有成本低、无药物残留、无耐药性、无毒副作用的优点，制备时工艺简单、耗能低、无污染，非常容易实现产业化，为茶农的茶园废料提供了新的用途，具有很好的经济和社会效益。

具体实施方式

下面通过对实施实例的描述，对本发明的具体实施方式如所涉及的各构件的形状、构造、各部分之间的相互位置及连接关系、各部分的作用及工作原理等作进一步的详细说明。

实施例1：

本实施例的防治鱼病的饲料添加剂以在冬季修剪茶树时获得的茶茎和茶梗作为原料，经过粉碎成粉末而制成，粉末的粒径小于0.85mm（20目），以便于牲畜消化吸收，并减少对牲畜消化系统的损害。

在使用时，将粉末状的防治鱼病的饲料添加剂混合入饲料中并搅拌均匀，所述防治鱼病的饲料添加剂与饲料的重量比为1～5：1000W/W。

实施例2：

本实施例的防治鱼病的饲料添加剂以在冬季修剪茶树时获得的茶茎和茶梗作为原料，制备提取物而制成，具体的制备方法有以下两种：

1、将原料粉碎成粉末并投入到溶剂中形成溶液，将溶液通过加热提取、微波提取或者超声提取得到提取物；所述粉末与溶剂的重量比为5:1～50；所述溶剂为水或者乙醇或者含水乙醇。本专利实施具体例为，将原料粉碎成粗粉，取10kg茶茎和茶梗的粗粉，置提取罐中，加10倍量水回流提取，保持沸腾2小时，过滤，滤渣再加入10倍量水回流提取，保持沸腾1小时，过滤，合并两次滤液。滤液置浓缩罐中60℃减压浓缩至相对密度为1.2左右的流浸膏，流浸膏取出装入托盘，保持1cm左右厚度，置烘箱中60℃减压干燥，制成提取物2.28kg。

2、将原料粉碎成粉末并投入到水或含水乙醇溶液中形成一次溶液，将一次溶液加热预定时间后，将一次溶液进行过滤得到一次滤渣和一次滤液；将一次滤渣再次投入水或含水乙醇溶液中形成二次溶液，将二次溶液加热预定时间后，将二次溶液进行过滤得到二次滤渣和二次滤液，将一次滤液、二次滤液混合后，进行浓缩、干燥得到提取物。本实施具体例为，防治鱼病的饲料添加剂以在冬季修剪茶树时获得的茶茎和茶梗作为原料，将原料粉碎成粗粉，取10kg茶茎和茶梗的粗粉，置提取罐中，加10倍量50%乙醇回流提取，保持沸腾2小时，过滤，滤渣再加入10倍量50%乙醇回流提取，保持沸腾1小时，过滤，合并两次滤液。滤液置浓缩罐中60℃减压浓缩至相对密度为1.0左右的流浸膏，流浸膏直接喷雾干燥，制成提取物2.13kg。

在使用时，先将防治鱼病的饲料添加剂稀释到体积倍数的40倍后，再洒入饲料中并搅拌均匀，所述防治鱼病的饲料添加剂与饲料的重量比为0.5～2：1000 W/W。