技术领域
本发明属于食品生物工程领域，具体地说涉及一种乳清蛋白水解物及其制 备方法。
背景技术
牛乳过敏是一种过敏性疾病。可分为速发型超敏反应和迟发型超敏反应两 种类型；其临床症状表现为：皮肤为过敏性皮炎，呼吸系统为鼻炎、哮喘，消 化器官为下痢、呕吐。这些症状可能单独或合并发生，严重时也可能表现为全 身性过敏，甚至过敏性休克。研究表明，在婴幼儿中乳蛋白过敏的发生率大约 是2～6％(Hill D J等.Pediatr Allergy and Immunology，1997，8(supl.8)， 21-26。Hosking C S等.Allergy and Clinical Immunology International， 2000，12(5)，198-205)；此外，约3％的成年人经历过对乳制品过敏(Bennett L.等.Austral ian Journal of Dairy Technology，2001(56)：126)。在中国， 牛乳过敏问题一直没有引起足够的重视，有关牛乳过敏的统计资料报道较少。 在我国，治疗婴幼儿牛乳过敏常采取的方法为：停用牛乳制品、改用代乳品、 服用特定的药物。但是这些治疗手段都是暂时性的，而且容易造成婴幼儿的营 养不良。众所周知，牛乳是优质的营养食品，几乎含有人体所必需的全部氨基 酸，而且是钙和磷的良好来源。因此，开发低敏性或无过敏性的牛乳制品是解 决牛乳过敏问题的有效途径。
牛乳过敏主要是由牛乳中存在的乳清蛋白引起的，其中β-乳球蛋白(β-lg) 和α-乳白蛋白(α-la)是牛乳中最主要的过敏原(Van Berestei jn E C H等， Journal of Food Protection，1994，57(7)，619-625.Ena J M等.Journal of Food Science，1995，60(1)，104-116.Hattori M等.Journal of Agricutural and Food Chemistry，2000，48(6)，2050-2056)。这两种蛋白存在许多过敏 表位，可以通过破坏或降解过敏表位来降低乳清蛋白的抗原性(Selo I等. Clinical and Experimental Allergy，1999，29(8)，1055-1063.Adams S L 等.Immunology Cell Biology，1991，69，191-197.Maynard F等.Int Archives of Allergy and Immunology，1997，113，478-488.Jarvinen K M等. International Archives of Allergy and Immunology，2001，126，111-118)。 目前，破坏或降解乳清蛋白过敏表位的主要有热处理和蛋白酶降解两种方法： (1)热处理方法，加热能引起乳清蛋白的变性，生成聚合物，从而掩盖了抗原 表位，降低了牛乳的过敏性(Svenning C.等，International Dairy Journal， 2000，10(10)，699-711)。但是热处理会影响牛乳的营养和感官特性，并产生 一定的蒸煮味。(2)蛋白酶降解方法，利用蛋白酶解破坏过敏表位，可以降低 乳清蛋白引起的过敏性(Nakamura T等，Animal Science and Technology，1992， 63(8)，814-817。Maynard F.等，Int Archives of Allergy and Immunology， 1997，113，478-488；Wroblewska B.等，International Journal of Food Science and Technology，2004，39：839-850)。此外，酶解方法还可产生具 有调节免疫功能、抗凝血、降血压等其他生理功能的活性肽，并且水解后的小 分子物质更有利于婴儿肠道吸收。国外现有一些低敏性的牛乳水解产品，如雀 巢公司生产的三种分别名为Beba HA，Good Start和NAN HA的部分水解配方 奶粉、日本明治乳业株式会社生产的乳清蛋白水解配方奶粉Nobiyaka。但是它 们都是用单一的酶生产的。
经检索，没有发现采用复合酶生产低敏性的乳清蛋白制品的报道。
发明内容
本发明的第一个目的是提供一种低敏性的乳清蛋白水解物。
本发明的另一目的是提供上述低敏性的乳清蛋白水解物的制备方法。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
本发明一种低敏性的乳清蛋白水解物，按照如下方法制备：
(1)按照5～8％的重量比将浓缩乳清蛋白溶于水中，然后在85℃～90℃ 加热10～15min，再降温至45℃～50℃，得乳清蛋白溶液；
(2)将乳清蛋白溶液的pH值调至7.5～8.0；按照0.08～0.1％的重量比加 入复合蛋白酶，然后在温度为50～55℃、pH值为7.5～8.0条件下水解2～3h， 再在90℃～100℃保持10～15min，得乳清蛋白水解溶液；
(3)通过阴阳离子交换树脂将乳清蛋白水解溶液进行脱盐，干燥，得到本 发明低敏性的乳清蛋白水解物。
上述乳清蛋白水解物步骤(1)中所述的浓缩乳清蛋白可从市场上购买， 如美国产的浓缩乳清蛋白WPC-8000等。
上述乳清蛋白水解物步骤(1)中所述的将浓缩乳清蛋白溶于水中，可在 磁力搅拌器上搅拌均匀，使之充分溶解。
上述乳清蛋白水解物步骤(2)中所述的复合蛋白酶由碱性蛋白酶、木瓜 蛋白酶和风味蛋白酶组成，它们之间的组成比例为1∶1～1.5∶1～1.5。
上述乳清蛋白水解物步骤(2)中pH值的调节可用1mol/L NaOH或HCl 进行调解。
上述乳清蛋白水解物步骤(2)中所述的水解可在水浴振荡器上进行。
上述低敏性的乳清蛋白水解物的制备方法，包括如下步骤：
(1)按照5～8％的重量比将浓缩乳清蛋白溶于水中，然后在85℃～90℃ 加热10～15min，再降温至45℃～50℃，得乳清蛋白溶液；
(2)将乳清蛋白溶液的pH值调至7.5～8.0；按照0.08～0.1％的重量比加 入复合蛋白酶，然后在温度为50～55℃、pH值为7.5～8.0条件下水解2～3h， 再在90℃～100℃保持10～15min，得乳清蛋白水解溶液；
(3)通过阴阳离子交换树脂将乳清蛋白水解溶液进行脱盐，干燥，即得本 发明低敏性的乳清蛋白水解物。
上述制备方法步骤(1)中所述的浓缩乳清蛋白可从市场上购买，如美国 产的浓缩乳清蛋白WPC-8000。
上述制备方法步骤(1)中所述的将浓缩乳清蛋白溶于水中，可在磁力搅 拌器上搅拌均匀，使之充分溶解。
上述制备方法步骤(2)中所述的复合蛋白酶由碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶 和风味蛋白酶组成，它们之间的组成比例为1∶1～1.5∶1～1.5。
上述制备方法步骤(2)中pH值的调节可用1mol/L NaOH或HCl进行调 解。
上述制备方法步骤(2)中所述的水解可在水浴振荡器上进行。
本发明具有的优点和有益效果：(1)、本发明乳清蛋白水解物的β-乳球蛋 白和α-乳白蛋白的抑制率高，所得乳清蛋白的水解产物的β-lg抑制率可达 84％，α-la抑制率可达95％；(2)、本发明乳清蛋白水解物能够明显降低或消 除牛乳过敏反应；(3)、本发明产物还能产生其他生物活性物质，除降低过敏性 外，同时还具有免疫促进、易消化吸收及降血压等功能；(4)、本发明乳清蛋白 水解物其安全性高、无副作用；(5)、本发明乳清蛋白水解物无苦味和其它不良 风味。
附图说明
图1乳清蛋白水解物电泳图
1为α-乳白蛋白和β-乳球蛋白的混合标样；
2为低分子量标准蛋白；
3为本发明乳清蛋白水解物。
图2.乳清蛋白及乳清蛋白复合酶解物HPLC色谱图
图2A乳清蛋白
图2B乳清蛋白水解物
具体实施方式
实施例1：
低敏性的乳清蛋白水解物的制备
称取8g浓缩乳清蛋白(WPC-8000)溶于100ml水中，于磁力搅拌器上使 其充分溶解，在85℃加热15min使蛋白变性，降温至45℃；用1mol/L NaOH 或HCl将乳清蛋白溶液的pH值调至7.5，接着加入0.1g复合蛋白酶(复合蛋白 酶的组成成分及其比例为：碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶、风味蛋白酶比例为1∶1∶ 1)，并在恒温水浴振荡器中55℃、pH7.5条件下水解3h；然后在90℃保持15min 使酶失活。然后将乳清蛋白水解物以50r/min的流速过阳离子交换树脂柱脱盐， 流速用衡流泵控制，收集流出液，干燥后得到低敏性的乳清蛋白水解物6.5g。
实施例2
低敏性的乳清蛋白水解物的制备
称取6g浓缩乳清蛋白(WPC-8000)溶于120ml水中，于磁力搅拌器上使 其充分溶解，在90℃加热10min使蛋白变性，降温至48℃；用1mol/L NaOH 或HCl将乳清蛋白溶液的pH值调至7.6，接着加入0.096g复合蛋白酶(复合蛋 白酶的组成成分及其比例为：碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶、风味蛋白酶比例为1∶ 1.2∶1)，并在恒温水浴振荡器中52℃、pH7.6条件下水解2h；然后在90℃保持 15min使酶失活。然后将乳清蛋白水解物以50r/min的流速过阳离子交换树脂柱 脱盐，流速用衡流泵控制，收集流出液，干燥后得到低敏性的乳清蛋白水解物 5.0g。
实施例3
低敏性的乳清蛋白水解物的制备
称取3g浓缩乳清蛋白(WPC-8000)溶于50ml水中，于磁力搅拌器上使其 充分溶解，在85℃加热15min使蛋白变性，降温至45℃；用1mol/L NaOH或 HCl将乳清蛋白溶液的pH值调至7.8，接着加入0.045g复合蛋白酶(复合蛋白 酶的组成成分及其比例为：碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶、风味蛋白酶比例为1∶1∶ 1.5)，并在恒温水浴振荡器中50℃、pH7.8条件下水解3h；然后在100℃保持 10min使酶失活。然后将乳清蛋白水解物以50r/min的流速过阳离子交换树脂柱 脱盐，流速用衡流泵控制，收集流出液，干燥后得到低敏性的乳清蛋白水解物 2.5g。
试验实施例1
本发明乳清蛋白水解物抗原抑制率的测定
利用间接竞争ELISA法测定水解物抗原抑制率，具体步骤如下：
(1)抗原包被：以α-LA(或β-LG)作为抗原，用包被液稀释，加入到96(8×12) 孔酶标板，每孔100μL，4℃包被过夜。
(2)抗原和一抗反应：在反应管中加入实施例1所得乳清蛋白水解物样品 和等体积一定稀释度的抗血清。另设不加抗原或样品的反应管作为无竞争体系， 4℃冰箱过夜。
(3)洗涤：次日倾去孔内的液体，PBST洗涤4次，每孔250μL，每次3min， 并间歇摇动，于干净吸水纸上拍干。
(4)封闭：用1％BSA封闭液进行封闭，每孔100μL，37℃1h，PBST洗 涤4次，拍干。
(5)加样：将步骤(2)中样品和一抗的混合物加入到酶标板中，每孔100μL， 保鲜膜覆盖37℃孵育1h。PBST洗涤4次，拍干。
(6)加酶标二抗：加入封闭液稀释的羊抗兔IgG-辣根过氧化物酶(HRP)标 记物，每孔100μL，37℃反应1h，PBST洗涤4次，拍干。
(7)显色：加新鲜配制的TMB底物溶液100μl/孔，37℃暗处反应10min， 显示蓝色。
(8)终止反应：每孔加入2mol/L H2SO4 50μL以中止反应，颜色变为黄色。
(9)比色：用酶标检测仪双波长测定各孔的OD450和OD630值，OD＝ OD450-OD630。
(10)数据处理：间接竞争ELISA中被测物和包被抗原竞争与抗体结合， 因此包被抗原与抗体生成复合物的量与被测物中抗原量成反比。被测物的抗原 性大小可用抗原抑制率表示，按下式计算：抗原抑制率(％)＝B/B0×100％ 其中B表示各被测样的A值，B0为无竞争体系的A值。抑制率与被测物的抗原量 成反比。
测定结果：首先经方阵滴定法优化出ELISA最佳反应条件：α-LA包被浓度 为2μg/ml，对应抗血清稀释度为1∶128000，酶标二抗的稀释度为1∶10000；β-LG 包被浓度为0.5μg/ml，对应抗血清稀释度为1∶6400，酶标二抗的稀释度为1∶ 10000；两种蛋白的抗原抗体反应均为37℃1h。利用确定出的最佳反应条件测 定乳清蛋白酶解物的抗原抑制率，结果(见表1)本发明乳清蛋白水解物中α-LA 和β-LG的抑制率高，说明它们明显受到抑制。
表1.乳清蛋白复合酶解物α-LA和β-LG抑制率
所用蛋白酶 pH值 温度 (℃) α-LA抑制率(％) β-LG抑制率(％) 碱性蛋白酶+木瓜蛋白酶+ 风味蛋白酶(1∶1∶1) 7.5 55 95.89±2.38a 84.35±2.00a
试验实施例2
乳清蛋白水解物苦味值的评定
称取奎啉0.1g溶于50mL5％乙醇溶液中，从中取5ml溶液用蒸馏水稀释到 100ml，得到1.0×10-4g/ml奎啉溶液，再进一步稀释成5×10-5、2.5×10-5、1×10-5、 5×10-6g/ml等浓度奎啉溶液，其苦味值分别定为10、5、2.5、1、0.5，将实施 例1制得的乳清蛋白水解物与不同浓度奎啉溶液比较，从而确定乳清蛋白水解 物的苦味值。经品尝可知，实施例1所得乳清蛋白水解物基本没有苦味，因此 确定本发明乳清蛋白水解物苦味值为0。说明利用本发明的酶解方法能够很好 地控制，没有苦味即其他不良风味。
试验实施例3
乳清蛋白水解物电泳检测
电泳条件如下：凝胶浓度分别为致密胶16.5％，夹层胶10％，浓缩胶4％， 灌胶前，各种丙烯酰胺溶液分别加入10μL过硫酸铵和1μL TEMED，随即灌胶， 先灌入致密胶，再覆盖夹层胶，最后铺浓缩胶。凝胶配制方法(见表2)，各 层胶添加量各层胶添加量：浓缩胶1.4mL，夹层胶1.1mL，致密胶2.2mL；电流 强度为恒流20mA，电泳时间为3h左右，当溴酚蓝前沿距离玻璃板底部0.5cm 时结束电泳。电泳结束后，用0.1％的考马斯亮蓝R250染色30min，然后脱色 至背景透明无色，用去离子水漂洗、保存电泳凝胶版。
表2.16.5％致密胶10％夹层胶和4％浓缩胶配制表
结果(见图1)乳清蛋白水解物的分子量主要集中在3000～6000Da，酶解 产物中β-乳球蛋白还有少量剩余，而α-乳白蛋白已经基本被水解完全。
试验实施例4
乳清蛋白水解物的高效液相色谱分析
方法如下：色谱条件
色谱柱：Diamonsil RP-C18色谱柱(5μm×250mm×4.6mm)；
流动相：A：0.1％的TFA水溶液，B：0.09％的TFA乙腈溶液；
梯度条件：流动相B保持10％1min，在9min内从10％上升到20％，然后 在5min内从20％上升到25％，在5min内由25％上升到40％，再在5min内由 40％上升到45％，再在3min内从45％上升到51％，在8min内由51％上升到59％， 在2min内由59％上升到70％，在2min内从70％上升到80％，在5min内从80％ 上升到90％，再在5min内从90％下降到30％，在20min内由30％下降到10％；
流速：0.5mL/min；
检测器：二极管阵列检测器；
检测波长：280nm；
柱温：25℃；
样品：乳清蛋白和实施例1乳清蛋白水解物
进样量：10μL。
结果(见图2)α-乳白蛋白和β-乳球蛋白在复合蛋白酶的作用下生成许多多 肽物质，酶解结束时整个水解过程产生了16种主要的多肽物质，这些短肽易消 化吸收，且α-LA和β-LG已经大部分被水解，所以其抗原性降低。