技术领域
本发明涉及常绿萱草的组织培养法。
背景技术
常绿萱草具有四季常绿、花期长、抗病性强、耐寒、耐半阴等特点，是一种广受欢迎的 绿化园林栽培植物。此外，常绿萱草的根可以入药，具利尿、凉血功效，用于治疗水肿、小 便不利、淋浊、带下、黄疸、便血、崩漏等症。从常绿萱草分离出来的蒽醌类、二氢呋喃-γ- 内酰胺类等化合物具有抗菌、抗癌、杀虫等活性。据生产调查，常绿萱草在自然条件下生长 很少能够结籽繁殖，一般采用“分株法”进行繁殖，年繁殖系数一般为4～5倍左右，严重阻 碍了常绿萱草的大规模应用。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种常绿萱草的组织培养法，采用该方法能获得大量的 常绿萱草组培种苗。
为了解决上述技术问题，本发明提供一种常绿萱草的组织培养法，依次包括以下步骤：
1）、取生长健壮且无病虫害的常绿萱草植株，剥去外面1～2层老叶，取茎尖部位1～2cm 长的茎段，放入纱袋中进行流水冲洗；
2）、将步骤1）所得的流水冲洗后的茎段经消毒（为常规消毒）后，剥取长度为3～5毫米 的茎尖，接种到诱导无菌苗培养基上进行培养，得无菌苗；培养条件为：16小时光照，光照 强度30～40μmol m-2·s-1，温度为27±1℃；8小时暗培养，温度为21±1℃；上述光照和暗培 养交替进行；
3）、待步骤2）所得的无菌苗长至1.0～2.0cm高时，进行割取，得小苗Ⅰ（为单株小苗）； 将所述小苗Ⅰ接种到诱导不定芽培养基上进行培养，从而使小苗Ⅰ上诱导出不定芽；培养条 件为：16小时光照，光照强度30～40μmol m-2·s-1，温度为27±1℃；8小时暗培养，温度为21 ±1℃；上述光照和暗培养交替进行；
4）、待上述小苗Ⅰ上诱导出的不定芽长到1.0～3.0cm高时，以2～5株为一丛进行割取，得 丛生小苗；将上述丛生小苗接种到增殖培养基上进行培养；培养条件为：16小时光照，光照 强度30～40μmol m-2·s-1，温度为26～28℃；8小时暗培养，温度为20～22℃；上述光照和暗 培养交替进行；
5）、待上述丛生小苗长出的不定芽长到3.0～6.0cm时，进行割取，得小苗Ⅲ（为单株小 苗）；将此小苗Ⅲ接种到生根培养基中培养；培养条件为：16小时光照，光照强度40～50μ mol m-2·s-1，温度为26～28℃；8小时暗培养，温度为20～22℃；上述光照和暗培养交替进 行；
6）、待上述小苗Ⅲ长出大于2cm的至少5条根时，得可出瓶种植的种苗。
作为本发明的常绿萱草的组织培养法的改进：步骤1）为：将常绿萱草的茎段放入纱袋 中，无菌水冲洗0.5～1小时。
作为本发明的常绿萱草的组织培养法的进一步改进：
步骤2）中的诱导无菌苗培养基为：1/4MS基本培养基+白砂糖20～30g/L+琼脂4～9g/L， pH为5.5～6.0。
上述诱导无菌苗培养基的制作方法具体如下：以1/4MS基本培养基（即溶液中大量元素 的含量为MS基本培养基的四分之一）为基础，分别加入白砂糖、琼脂均匀混合，利用1mol/L 的KOH或1mol/L的HCl调节pH为5.5～6.0；每1L的1/4MS基本培养基中加20～30g 糖、4～9g琼脂。
步骤3）中的诱导不定芽培养基为：MS基本培养基+TDZ0.05～0.5mg/L+白砂糖20～30 g/L+琼脂4～9g/L，pH为5.5～6.0。
上述诱导不定芽诱导培养基的制作方法具体如下：以MS基本培养基为基础，分别加入 N-苯基-N′-1,2,3-噻二唑-5脲（TDZ）、白砂糖、琼脂均匀混合，利用1mol/L的KOH或1mol/L 的HCl调节pH为5.5～6.0；每1L的MS基本培养基加入0.05～0.5mg的TDZ、20～30g白砂糖、 4～9g琼脂。
步骤4）中的增殖培养基为：MS基本培养基+TDZ0.05～0.5mg/L+白砂糖20～30g/L+琼 脂4～9g/L，pH为5.5～6.0。
上述增殖培养基的制作方法具体如下：以MS基本培养基为基础，分别加入N-苯基 -N′-1,2,3-噻二唑-5脲（TDZ）、白砂糖、琼脂均匀混合，利用1mol/L的KOH或1mol/L的HCl 调节pH为5.5～6.0；每1L的MS基本培养基加入0.05～0.5mg的TDZ、20～30g白砂糖、4～9g 琼脂。
步骤5）中的生根培养基为：1/2MS基本培养基+白砂糖15～20g/L+琼脂4～10g/L，pH 为5.5～6.0。
上述生根培养基的制作方法具体如下：以1/2MS基本培养基（即溶液中大量元素的含量 为MS基本培养基的一半）为基础，分别加入白砂糖、琼脂均匀混合，利用1mol/L的KOH或1 mol/L的HCl调节pH为5.5～6.0；每1L1/2MS基本培养基中加15～20g糖、4～10g琼脂。
依照本发明的方法，只需60～90天即可获得试管苗；因此采用本发明的方法可以长期得 到大量的试管苗。
在本发明中，步骤3）中的诱导不定芽培养基的配方同步骤4）中的增殖培养基的配方。
本发明的特点在于：
1、本发明使用了植物激素TDZ，使用效果优于使用激素6-BA；
本发明采用“1/4MS基本培养基”作为无菌苗培养基，1/4MS基本培养基中无机盐浓 度相对较低，植株长的较快，更有利于诱导无菌苗。
2）、本发明以2～5株为一丛进行割取，转接该丛生小苗进行继代，丛生小苗有看护作用， 利于植株的增殖；单株转接容易损伤不利于植株的增殖。
3）、本发明对继代增殖次数进行了比较,发现继代周期为2-3次时增殖的倍数和苗的质量 为最佳。
本发明的常绿萱草组织培养法，属于一种离体快速繁殖的组织培养方法。依照植物组织 培养中细胞全能性的原理，可以在短时间内生产大量遗传背景相同、长势一致的优质种苗（种 子），而且依靠实验室可以实现周年的长期提供优质种苗。在本发明的方法中，将长势健壮且 无病虫害的常绿萱草植株上取得的茎尖进行消毒；再通过合适的诱导培养基进行诱导不定芽 以及增殖不定芽，可以获得大量的无菌苗。采用本发明的方法，一般仅需60～90天即可得到 可出瓶种植的种苗；因此常绿萱草组培苗一周年内的繁殖系数理论上为810倍以上。所以，本 发明的常绿萱草的组织培养法，是一种不受季节等因素影响，高效、快速提供优质常绿萱草 种苗的方法，可以加速良种推广速度，提高田间品种种植产量。
综上所述，本发明建立的常绿萱草组织培养体系将为良种（常绿萱草）工厂化育苗提供 理论依据和技术支撑。
本发明所得的种苗可采用以下方法进行种植：待种苗高4～8cm、具有至少3条长于2cm 的根时，进行炼苗驯化，在室温下（25℃左右）放置2～3d后开瓶，然后在自然光下放置2～ 3d后取出小苗，用温水（30℃左右）洗净根部琼脂，并晾干，移栽入营养土中，（泥炭：珍 珠岩：蛭石=4：3：3的体积比），于人工气候箱室培养，培养条件：温度20～25℃，湿度 85％～90％，光照强度15～25μmol m-2·s-1；3～5周后光照强度30～40μmol m-2·s-1；2个月 后，存活率达到95%以上。
附图说明
图1为实施例1中激素浓度是TDZ0.05mg/L时所诱导出来的常绿萱草芽；
图2为激素浓度是TDZ0.1mg/L时所诱导出来的常绿萱草芽；
图3为激素为6-BA时所诱导出来的常绿萱草芽；
图4为实施例1所得的常绿萱草的生根苗（即，可出瓶种植的种苗）；
具体实施方式
实施例1、一种常绿萱草的组织培养法，依次进行以下步骤：
1）、取生长健壮且无病虫害的常绿萱草植株，剥去外面1～2层老叶，取茎尖部位1～2cm 长的茎段，放入纱袋中无菌水流水冲洗0.5～1小时。
2）、将上述流水冲洗后的茎段经常规消毒后（即0.1%w/v HgCl2处理6～10分钟后，无 菌水冲洗5～8遍，然后用无菌滤纸吸干），剥取长度为3～5毫米的茎尖，接种到诱导无菌苗培 养基上进行培养；培养条件为：16小时光照，光照强度30～40μmol m-2·s-1，温度为27±1℃； 8小时暗培养，温度为21±1℃；上述光照和暗培养交替进行；
诱导无菌苗培养基为：1/4MS基本培养基+白砂糖30g/L+琼脂8g/L，pH为5.8。
3）、待上述无菌苗长至1.0～2.0cm高时（约25天），割取单株小苗，得小苗Ⅰ；将上述 小苗Ⅰ接种到诱导不定芽培养基上进行培养，从而使小苗Ⅰ上诱导出不定芽；培养条件为： 16小时光照，光照强度30～40μmol m-2·s-1，温度为27±1℃；8小时暗培养，温度为21±1℃； 上述光照和暗培养交替进行；
诱导不定芽诱导培养基为：MS基本培养基+TDZ0.05mg/L+白砂糖30g/L+琼脂8g/L， pH为5.8。
4）、待上述小苗Ⅰ上诱导出的不定芽长到2.0cm高时，以2～5株为一丛进行割取，得丛生 小苗；将上述丛生小苗接种到增殖培养基上进行培养；培养条件为：16小时光照，光照强度 30～40μmol m-2·s-1，温度为26～28℃；8小时暗培养，温度为20～22℃；上述光照和暗培养 交替进行；
增殖培养基为：MS基本培养基+TDZ0.05mg/L+白砂糖30g/L+琼脂8g/L，pH为5.8。
5）、待上述丛生小苗长出的不定芽长到4.0cm时，单株割取，得小苗Ⅲ；将此小苗Ⅲ接 种到生根培养基中培养；培养条件为：16小时光照，光照强度50μmol m-2·s-1，温度为26～28℃； 8小时暗培养，温度为20～22℃；上述光照和暗培养交替进行；
生根培养基为：1/2MS基本培养基+白砂糖20g/L+琼脂8g/L，pH为5.8。
6）待上述小苗Ⅲ长出大于2cm的至少5条根时，得可出瓶种植的种苗（如图4）。
依照上述方法，只需60天即可获得试管苗；因此采用本发明的方法可以长期得到大量的 试管苗。
备注说明：图1为上述实施例1的激素浓度是TDZ0.05mg/L时所诱导出来的常绿萱草芽 （丛生小苗长出的不定芽）。增殖倍数为10～12倍。
对比例1、
步骤1）同实施例1的步骤1）。
将实施例1的步骤2）中的诱导无菌苗培养基改为：1/2MS基本培养基+白砂糖30g/L+ 琼脂8g/L，pH为5.8。步骤2）中的培养条件同实施例1的步骤2）。
无菌苗长至1.0～2.0cm高，约需35天。所得到的无菌苗根比较细，无菌苗长势也比较 弱。即，该例得到的无菌苗没有实施例1中长的快且好。
原因是：实施例1中的诱导无菌苗培养基选用的是1/4MS基本培养基，无机盐浓度低， 有助于根源基的发育，从而有助于根从培养基中吸取营养，加快了无菌苗的生长。
对比例2、
步骤1）～2）同实施例1的步骤1）～2）。
将步骤3）中的诱导不定芽培养基改为：MS基本培养基+TDZ0.1mg/L+白砂糖30g/L+ 琼脂8g/L，pH为5.8。
步骤4）中的增殖培养基改为：MS基本培养基+TDZ0.1mg/L+白砂糖30g/L+琼脂8g/L， pH为5.8。
步骤3）和步骤4）的培养条件对应的同实施例1的步骤3）和步骤4）。
图2为上述激素浓度是TDZ0.1mg/L时所诱导出来的常绿萱草芽（丛生小苗长出的不定 芽）。增殖倍数为5～7倍。
对比例3、
步骤1）～2）同实施例1的步骤1）～2）。
仅仅将步骤3）的诱导不定芽培养基和步骤4）中的增殖培养基中的TDZ用6-BA进行替 代（浓度不变）；
步骤3）和步骤4）的培养条件对应的同实施例1的步骤3）和步骤4）。
图3为激素为6-BA时所诱导出来的常绿萱草芽（丛生小苗长出的不定芽）。增殖倍数 （仅为2～3倍）及苗的长势均不如实施例1。
最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不 限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导 出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。