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1、(10)申请公布号 CN 103609444 A (43)申请公布日 2014.03.05 CN 103609444 A (21)申请号 201310576929.4 (22)申请日 2013.11.17 A01H 4/00(2006.01) (71)申请人 浙江大学 地址 310058 浙江省杭州市西湖区余杭塘路 866 号 (72)发明人 毛碧增 刘辉辉 (74)专利代理机构 杭州中成专利事务所有限公 司 33212 代理人 金祺 (54) 发明名称 常绿萱草的组织培养法 (57) 摘要 本发明公开了一种常绿萱草的组织培养法， 包括以下步骤 ： 1）取常绿萱草植株茎段流水冲 洗 ； 2） 。
2、茎段经消毒后， 剥取茎尖接种到诱导无菌 苗培养基上进行培养 ； 3） 待步骤 2） 所得的无菌 苗长至 1.0 2.0cm 高时， 进行割取， 得小苗 ； 将小苗接种到诱导不定芽培养基上进行培养 ； 4）待上述小苗上诱导出的不定芽长到 1.0 3.0cm 高时， 以 2 5 株为一丛进行割取， 得丛 生小苗 ； 将上述丛生小苗接种到增殖培养基上进 行培养 ； 5）待上述丛生小苗长出的不定芽长到 3.06.0cm时， 进行割取， 得小苗 ； 将此小苗 接种到生根培养基中培养 ； 6） 待上述小苗长出 大于 2cm 的至少 5 条根时， 得可出瓶种植的种苗。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1。
3、 页 说明书 4 页 附图 1 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书4页 附图1页 (10)申请公布号 CN 103609444 A CN 103609444 A 1/1 页 2 1. 常绿萱草的组织培养法， 其特征是依次包括以下步骤 ： 1） 、 取生长健壮且无病虫害的常绿萱草植株， 剥去外面 1 2 层老叶， 取茎尖部位 1 2cm 长的茎段， 放入纱袋中进行流水冲洗 ； 2） 、 将步骤 1） 所得的流水冲洗后的茎段经消毒后， 剥取长度为 3 5 毫米的茎尖， 接 种到诱导无菌苗培养基上进行培养， 得无菌苗 ； 培养条件为 ： 16 小时。
4、光照， 光照强度 30 40mol m-2s-1， 温度为 271 ； 8 小时暗培养， 温度为 211 ； 上述光照和暗培养交替 进行 ； 3） 、 待步骤 2） 所得的无菌苗长至 1.0 2.0cm 高时， 进行割取， 得小苗 ； 将所述小苗 接种到诱导不定芽培养基上进行培养， 从而使小苗上诱导出不定芽 ； 培养条件为 ： 16 小时光照， 光照强度 30 40mol m-2 s-1， 温度为 271； 8 小时暗培养， 温度为 211； 上述光照和暗培养交替进行 ； 4） 、 待上述小苗上诱导出的不定芽长到 1.0 3.0cm 高时， 以 2 5 株为一丛进行 割取， 得丛生小苗 ； 将。
5、上述丛生小苗接种到增殖培养基上进行培养 ； 培养条件为 ： 16 小时光 照， 光照强度 30 40mol m-2s-1， 温度为 26 28 ； 8 小时暗培养， 温度为 20 22 ； 上述光照和暗培养交替进行 ； 5） 、 待上述丛生小苗长出的不定芽长到3.06.0cm时， 进行割取， 得小苗 ； 将此小苗 接种到生根培养基中培养 ； 培养条件为 ： 16 小时光照， 光照强度 40 50mol m-2s-1， 温度为 26 28 ； 8 小时暗培养， 温度为 20 22 ； 上述光照和暗培养交替进行 ； 6） 、 待上述小苗长出大于 2cm 的至少 5 条根时， 得可出瓶种植的种苗。 。
6、2. 根据权利要求 1 所述的常绿萱草的组织培养法， 其特征是 ： 所述步骤 1） 为 ： 将常绿 萱草的茎段放入纱袋中， 无菌水冲洗 0.5 1 小时。 3. 根据权利要求 1 或 2 所述的常绿萱草的组织培养法， 其特征是 ： 步骤 2） 中的诱导无 菌苗培养基为 ： 1/4MS 基本培养基 + 白砂糖 20 30g/L+ 琼脂 4 9g/L， pH 为 5.5 6.0。 4. 根据权利要求 3 所述的常绿萱草的组织培养法， 其特征是 ： 步骤 3） 中的诱导不定芽 培养基为 ： MS 基本培养基 +TDZ0.05 0.5mg/L+ 白砂糖 20 30g/L+ 琼脂 4 9g/L， pH 。
7、为 5.5 6.0。 5. 根据权利要求 4 所述的常绿萱草的组织培养法， 其特征是 ： 步骤 4） 中的增殖培养基 为 ： MS 基本培养基 +TDZ0.05 0.5mg/L+ 白砂糖 20 30g/L+ 琼脂 4 9g/L， pH 为 5.5 6.0。 6. 根据权利要求 5 所述的常绿萱草的组织培养法， 其特征是 ： 步骤 5） 中的生根培养基 为 ： 1/2MS 基本培养基 + 白砂糖 15 20g/L+ 琼脂 4 10g/L， pH 为 5.5 6.0。 7. 根据权利要求 6 所述的常绿萱草的组织培养法， 其特征是 ： 诱导不定芽培养基为 ： MS 基本培养基 +TDZ0.05mg。
8、/L+ 白砂糖 30g/L+ 琼脂 8g/L， pH 为 5.8 ； 增殖培养基为 ： MS 基本培养基 +TDZ0.05mg/L+ 白砂糖 30g/L+ 琼脂 8g/L， pH 为 5.8。 权 利 要 求 书 CN 103609444 A 2 1/4 页 3 常绿萱草的组织培养法 技术领域 0001 本发明涉及常绿萱草的组织培养法。 背景技术 0002 常绿萱草具有四季常绿、 花期长、 抗病性强、 耐寒、 耐半阴等特点， 是一种广受欢 迎的绿化园林栽培植物。此外， 常绿萱草的根可以入药， 具利尿、 凉血功效， 用于治疗水 肿、 小便不利、 淋浊、 带下、 黄疸、 便血、 崩漏等症。从常绿萱。
9、草分离出来的蒽醌类、 二氢呋 喃 - 内酰胺类等化合物具有抗菌、 抗癌、 杀虫等活性。据生产调查， 常绿萱草在自然条件 下生长很少能够结籽繁殖， 一般采用 “分株法” 进行繁殖， 年繁殖系数一般为 4 5 倍左右， 严重阻碍了常绿萱草的大规模应用。 发明内容 0003 本发明要解决的技术问题是提供一种常绿萱草的组织培养法， 采用该方法能获得 大量的常绿萱草组培种苗。 0004 为了解决上述技术问题， 本发明提供一种常绿萱草的组织培养法， 依次包括以下 步骤 ： 0005 1） 、 取生长健壮且无病虫害的常绿萱草植株， 剥去外面 1 2 层老叶， 取茎尖部位 1 2cm 长的茎段， 放入纱袋中进。
10、行流水冲洗 ； 0006 2） 、 将步骤 1） 所得的流水冲洗后的茎段经消毒 （为常规消毒） 后， 剥取长度为 3 5 毫米的茎尖， 接种到诱导无菌苗培养基上进行培养， 得无菌苗 ； 培养条件为 ： 16 小时光照， 光照强度 30 40mol m-2s-1， 温度为 271 ； 8 小时暗培养， 温度为 211 ； 上述光 照和暗培养交替进行 ； 0007 3） 、 待步骤2） 所得的无菌苗长至1.02.0cm高时， 进行割取， 得小苗 （为单株小 苗） ； 将所述小苗接种到诱导不定芽培养基上进行培养， 从而使小苗上诱导出不定芽 ； 培养条件为 ： 16 小时光照， 光照强度 30 40m。
11、ol m-2 s-1， 温度为 271； 8 小时暗培养， 温度为 211 ； 上述光照和暗培养交替进行 ； 0008 4） 、 待上述小苗上诱导出的不定芽长到 1.0 3.0cm 高时， 以 2 5 株为一丛进 行割取， 得丛生小苗 ； 将上述丛生小苗接种到增殖培养基上进行培养 ； 培养条件为 ： 16 小时 光照， 光照强度 30 40mol m-2 s-1， 温度为 26 28； 8 小时暗培养， 温度为 20 22； 上述光照和暗培养交替进行 ； 0009 5） 、 待上述丛生小苗长出的不定芽长到3.06.0cm时， 进行割取， 得小苗 （为单 株小苗） ； 将此小苗接种到生根培养基中。
12、培养 ； 培养条件为 ： 16 小时光照， 光照强度 40 50mol m-2s-1， 温度为 26 28 ； 8 小时暗培养， 温度为 20 22 ； 上述光照和暗培养 交替进行 ； 0010 6） 、 待上述小苗长出大于 2cm 的至少 5 条根时， 得可出瓶种植的种苗。 0011 作为本发明的常绿萱草的组织培养法的改进 ： 步骤 1） 为 ： 将常绿萱草的茎段放入 说 明 书 CN 103609444 A 3 2/4 页 4 纱袋中， 无菌水冲洗 0.5 1 小时。 0012 作为本发明的常绿萱草的组织培养法的进一步改进 ： 0013 步骤 2） 中的诱导无菌苗培养基为 ： 1/4MS 。
13、基本培养基 + 白砂糖 20 30g/L+ 琼脂 4 9g/L， pH 为 5.5 6.0。 0014 上述诱导无菌苗培养基的制作方法具体如下 ： 以 1/4MS 基本培养基 （即溶液中大 量元素的含量为 MS 基本培养基的四分之一） 为基础， 分别加入白砂糖、 琼脂均匀混合， 利用 1mol/L 的 KOH 或 1mol/L 的 HCl 调节 pH 为 5.5 6.0 ； 每 1L 的 1/4MS 基本培养基中加 20 30g 糖、 4 9g 琼脂。 0015 步骤 3） 中的诱导不定芽培养基为 ： MS 基本培养基 +TDZ0.05 0.5mg/L+ 白砂糖 20 30g/L+ 琼脂 4 。
14、9g/L， pH 为 5.5 6.0。 0016 上述诱导不定芽诱导培养基的制作方法具体如下 ： 以 MS 基本培养基为基础， 分别 加入 N- 苯基 -N -1,2,3- 噻二唑 -5 脲 （TDZ） 、 白砂糖、 琼脂均匀混合， 利用 1mol/L 的 KOH 或 1mol/L 的 HCl 调节 pH 为 5.5 6.0 ； 每 1L 的 MS 基本培养基加入 0.05 0.5mg 的 TDZ、 20 30g 白砂糖、 4 9g 琼脂。 0017 步骤 4）中的增殖培养基为 ： MS 基本培养基 +TDZ0.05 0.5mg/L+ 白砂糖 20 30g/L+ 琼脂 4 9g/L， pH 为。
15、 5.5 6.0。 0018 上述增殖培养基的制作方法具体如下 ： 以 MS 基本培养基为基础， 分别加入 N- 苯 基 -N -1,2,3- 噻二唑 -5 脲 （TDZ） 、 白砂糖、 琼脂均匀混合， 利用 1mol/L 的 KOH 或 1mol/L 的 HCl 调节 pH 为 5.5 6.0 ； 每 1L 的 MS 基本培养基加入 0.05 0.5mg 的 TDZ、 20 30g 白砂糖、 4 9g 琼脂。 0019 步骤 5） 中的生根培养基为 ： 1/2MS 基本培养基 + 白砂糖 15 20g/L+ 琼脂 4 10g/L， pH 为 5.5 6.0。 0020 上述生根培养基的制作方。
16、法具体如下 ： 以 1/2MS 基本培养基 （即溶液中大量元素 的含量为 MS 基本培养基的一半） 为基础， 分别加入白砂糖、 琼脂均匀混合， 利用 1mol/L 的 KOH 或 1mol/L 的 HCl 调节 pH 为 5.5 6.0 ； 每 1L1/2MS 基本培养基中加 15 20g 糖、 4 10g 琼脂。 0021 依照本发明的方法， 只需6090天即可获得试管苗 ； 因此采用本发明的方法可以 长期得到大量的试管苗。 0022 在本发明中， 步骤 3） 中的诱导不定芽培养基的配方同步骤 4） 中的增殖培养基的 配方。 0023 本发明的特点在于 ： 0024 1、 本发明使用了植物激。
17、素 TDZ， 使用效果优于使用激素 6-BA ； 0025 本发明采用 “1/4MS 基本培养基” 作为无菌苗培养基， 1/4MS 基本培养基中无机盐 浓度相对较低， 植株长的较快， 更有利于诱导无菌苗。 0026 2） 、 本发明以 2 5 株为一丛进行割取， 转接该丛生小苗进行继代， 丛生小苗有看 护作用， 利于植株的增殖 ； 单株转接容易损伤不利于植株的增殖。 0027 3） 、 本发明对继代增殖次数进行了比较 , 发现继代周期为 2-3 次时增殖的倍数和 苗的质量为最佳。 0028 本发明的常绿萱草组织培养法， 属于一种离体快速繁殖的组织培养方法。依照植 说 明 书 CN 103609。
18、444 A 4 3/4 页 5 物组织培养中细胞全能性的原理， 可以在短时间内生产大量遗传背景相同、 长势一致的优 质种苗 （种子） ， 而且依靠实验室可以实现周年的长期提供优质种苗。在本发明的方法中， 将长势健壮且无病虫害的常绿萱草植株上取得的茎尖进行消毒 ； 再通过合适的诱导培养基 进行诱导不定芽以及增殖不定芽， 可以获得大量的无菌苗。采用本发明的方法， 一般仅需 60 90 天即可得到可出瓶种植的种苗 ； 因此常绿萱草组培苗一周年内的繁殖系数理论上 为 810倍以上。所以， 本发明的常绿萱草的组织培养法， 是一种不受季节等因素影响， 高效、 快速提供优质常绿萱草种苗的方法， 可以加速良种。
19、推广速度， 提高田间品种种植产量。 0029 综上所述， 本发明建立的常绿萱草组织培养体系将为良种 （常绿萱草） 工厂化育苗 提供理论依据和技术支撑。 0030 本发明所得的种苗可采用以下方法进行种植 ： 待种苗高 4 8cm、 具有至少 3 条长 于 2cm 的根时， 进行炼苗驯化， 在室温下 （25左右） 放置 2 3d 后开瓶， 然后在自然光下 放置 2 3d 后取出小苗， 用温水 （30左右） 洗净根部琼脂， 并晾干， 移栽入营养土中，（泥 炭 ： 珍珠岩 ： 蛭石=4 ： 3 ： 3的体积比） ， 于人工气候箱室培养， 培养条件 ： 温度2025， 湿度 85 90， 光照强度 15。
20、 25mol m-2 s-1； 3 5 周后光照强度 30 40mol m-2 s-1； 2 个月后， 存活率达到 95% 以上。 附图说明 0031 图 1 为实施例 1 中激素浓度是 TDZ0.05mg/L 时所诱导出来的常绿萱草芽 ； 0032 图 2 为激素浓度是 TDZ0.1mg/L 时所诱导出来的常绿萱草芽 ； 0033 图 3 为激素为 6-BA 时所诱导出来的常绿萱草芽 ； 0034 图 4 为实施例 1 所得的常绿萱草的生根苗 （即， 可出瓶种植的种苗） ； 具体实施方式 0035 实施例 1、 一种常绿萱草的组织培养法， 依次进行以下步骤 ： 0036 1） 、 取生长健壮。
21、且无病虫害的常绿萱草植株， 剥去外面 1 2 层老叶， 取茎尖部位 1 2cm 长的茎段， 放入纱袋中无菌水流水冲洗 0.5 1 小时。 0037 2） 、 将上述流水冲洗后的茎段经常规消毒后 （即 0.1%w/v HgCl2处理 6 10 分钟 后， 无菌水冲洗 5 8 遍， 然后用无菌滤纸吸干） ， 剥取长度为 3 5 毫米的茎尖， 接种到诱 导无菌苗培养基上进行培养 ； 培养条件为 ： 16 小时光照， 光照强度 30 40mol m-2s-1， 温度为 271 ； 8 小时暗培养， 温度为 211 ； 上述光照和暗培养交替进行 ； 0038 诱导无菌苗培养基为 ： 1/4MS 基本培养。
22、基 + 白砂糖 30g/L+ 琼脂 8g/L， pH 为 5.8。 0039 3） 、 待上述无菌苗长至 1.0 2.0cm 高时 （约 25 天） ， 割取单株小苗， 得小苗 ； 将 上述小苗接种到诱导不定芽培养基上进行培养， 从而使小苗上诱导出不定芽 ； 培养条 件为 ： 16 小时光照， 光照强度 30 40mol m-2s-1， 温度为 271 ； 8 小时暗培养， 温度 为 211 ； 上述光照和暗培养交替进行 ； 0040 诱导不定芽诱导培养基为 ： MS基本培养基+TDZ0.05mg/L+白砂糖30g/L+琼脂8g/ L， pH 为 5.8。 0041 4） 、 待上述小苗上诱导。
23、出的不定芽长到 2.0cm 高时， 以 2 5 株为一丛进行割 取， 得丛生小苗 ； 将上述丛生小苗接种到增殖培养基上进行培养 ； 培养条件为 ： 16 小时光 说 明 书 CN 103609444 A 5 4/4 页 6 照， 光照强度 30 40mol m-2s-1， 温度为 26 28 ； 8 小时暗培养， 温度为 20 22 ； 上述光照和暗培养交替进行 ； 0042 增殖培养基为 ： MS基本培养基+TDZ0.05mg/L+白砂糖30g/L+琼脂8g/L， pH为5.8。 0043 5） 、 待上述丛生小苗长出的不定芽长到 4.0cm 时， 单株割取， 得小苗 ； 将此小苗 接种到生。
24、根培养基中培养 ； 培养条件为 ： 16 小时光照， 光照强度 50mol m-2s-1， 温度为 26 28 ； 8 小时暗培养， 温度为 20 22 ； 上述光照和暗培养交替进行 ； 0044 生根培养基为 ： 1/2MS 基本培养基 + 白砂糖 20g/L+ 琼脂 8g/L， pH 为 5.8。 0045 6） 待上述小苗长出大于 2cm 的至少 5 条根时， 得可出瓶种植的种苗 （如图 4） 。 0046 依照上述方法， 只需 60 天即可获得试管苗 ； 因此采用本发明的方法可以长期得到 大量的试管苗。 0047 备注说明 ： 图 1 为上述实施例 1 的激素浓度是 TDZ0.05mg。
25、/L 时所诱导出来的常绿 萱草芽 （丛生小苗长出的不定芽） 。增殖倍数为 10 12 倍。 0048 对比例 1、 0049 步骤 1） 同实施例 1 的步骤 1） 。 0050 将实施例 1 的步骤 2） 中的诱导无菌苗培养基改为 ： 1/2MS 基本培养基 + 白砂糖 30g/L+ 琼脂 8g/L， pH 为 5.8。步骤 2） 中的培养条件同实施例 1 的步骤 2） 。 0051 无菌苗长至 1.0 2.0cm 高， 约需 35 天。所得到的无菌苗根比较细， 无菌苗长势 也比较弱。即， 该例得到的无菌苗没有实施例 1 中长的快且好。 0052 原因是 ： 实施例1中的诱导无菌苗培养基选用。
26、的是1/4MS基本培养基， 无机盐浓度 低， 有助于根源基的发育， 从而有助于根从培养基中吸取营养， 加快了无菌苗的生长。 0053 对比例 2、 0054 步骤 1） 2） 同实施例 1 的步骤 1） 2） 。 0055 将步骤 3） 中的诱导不定芽培养基改为 ： MS 基本培养基 +TDZ0.1mg/L+ 白砂糖 30g/ L+ 琼脂 8g/L， pH 为 5.8。 0056 步骤 4） 中的增殖培养基改为 ： MS 基本培养基 +TDZ0.1mg/L+ 白砂糖 30g/L+ 琼脂 8g/L， pH 为 5.8。 0057 步骤 3） 和步骤 4） 的培养条件对应的同实施例 1 的步骤 3。
27、） 和步骤 4） 。 0058 图2为上述激素浓度是TDZ0.1mg/L时所诱导出来的常绿萱草芽 （丛生小苗长出的 不定芽） 。增殖倍数为 5 7 倍。 0059 对比例 3、 0060 步骤 1） 2） 同实施例 1 的步骤 1） 2） 。 0061 仅仅将步骤 3） 的诱导不定芽培养基和步骤 4） 中的增殖培养基中的 TDZ 用 6-BA 进行替代 （浓度不变） ； 0062 步骤 3） 和步骤 4） 的培养条件对应的同实施例 1 的步骤 3） 和步骤 4） 。 0063 图 3 为激素为 6-BA 时所诱导出来的常绿萱草芽 （丛生小苗长出的不定芽） 。增殖 倍数 （仅为 2 3 倍） 及苗的长势均不如实施例 1。 0064 最后， 还需要注意的是， 以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然， 本发 明不限于以上实施例， 还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容 直接导出或联想到的所有变形， 均应认为是本发明的保护范围。 说 明 书 CN 103609444 A 6 1/1 页 7 图 1 图 2 图 3 图 4 说 明 书 附 图 CN 103609444 A 7 。