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1、(10)授权公告号 CN 103315290 B (45)授权公告日 2014.12.17 CN 103315290 B (21)申请号 201310166402.4 (22)申请日 2013.05.08 A23L 1/29(2006.01) A61K 36/535(2006.01) A61P 39/06(2006.01) A61K 127/00(2006.01) (73)专利权人 浙江国曲生物科技有限公司 地址 311700 浙江省杭州市淳安县千岛湖镇 坪山路 206 号 (72)发明人 甘锋 唐建忠 汪排岭 (74)专利代理机构 杭州杭诚专利事务所有限公 司 33109 代理人 尉伟敏 C。
2、N 101760478 A,2010.06.30, 说明书第 0009-0023 段 . KR 1020060044279 A,2006.05.16, 全文 . CN 1272368 A,2000.11.08,说明书第2页第 4 段 - 第 3 页第 10 行 . CN 102925318 A,2013.02.13, 全文 . KR 100884616 B1,2009.02.20, 全文 . 董文宾， 等 . 红曲霉菌固体发酵产 Monaclin K 工艺的优化 .现代食品科技 .2007, 第 23 卷 ( 第 8 期 ), 第 32-35 页 . 鲁佳慧， 等.红曲的生产工艺及Monaco。
3、lin K 和桔霉素的检测 .现代食品科技 .2006, 第 22 卷 ( 第 1 期 ), 第 144-146 页和第 138 页 . 肖翔， 等 . 红曲菌发酵中添加紫苏叶提取物 对其抗氧化活性的影响 .中国酿造 .2011,( 第 7 期 ), 第 50-53 页 . (54) 发明名称 一种抗氧化红曲的制作方法 (57) 摘要 本发明涉及一种发酵方法， 特别涉及一种抗 氧化红曲的制作方法。 （1）紫苏叶提取液及滤 渣基质的制备 ： 将干紫苏叶粉碎至 50-100 目， 按 1:18-22 的重量比例加入去离子水， 超声破碎 35-50min 后抽滤， 得到紫苏叶的滤液和滤渣， 滤 渣烘。
4、干至恒重， 滤液蒸馏后得到紫苏叶提取液 ； （2）配置固态发酵培养基 ： 采用步骤 （1）获得的 紫苏叶提取液及滤渣配置固态发酵培养基， 紫苏 叶提取液及滤渣的加入量占固态发酵培养基总 重量的 10-30%， 调节固态发酵培养基的含水量在 30-50% 范围内后， 装瓶， 灭菌， 趁热打散瓶内固态 发酵培养基物料 ；（3） 红曲菌发酵培养。本发明 制得的抗氧化红曲中含有多种生理活性物质， 其 中 Dimerumic acid 达到 3.1mg/g， 含有紫苏黄酮 2.5mg/g， 具有很好的保健作用。 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 丛文蓉 权利要求书 1 页 说明书 5 页。
5、 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书1页 说明书5页 (10)授权公告号 CN 103315290 B CN 103315290 B 1/1 页 2 1. 一种抗氧化红曲的制作方法， 其特征在于包括如下步骤 ： （1） 紫苏叶提取液及滤渣基质的制备 ： 将干紫苏叶粉碎至 50-100 目， 按 1:18-22 的重量比例加入去离子水， 超声破碎 35-50min 后抽滤， 得到紫苏叶的滤液和滤渣， 滤渣烘干至恒重， 滤液蒸馏后得到紫苏叶提取 液 ； （2） 配置固态发酵培养基 ： 采用步骤 （1） 获得的紫苏叶提取液及滤渣配置固态发酵培 养基， 紫苏叶提取液及滤。
6、渣的加入量占固态发酵培养基总重量的 10-30%， 调节固态发酵培 养基的含水量在 30-50% 范围内后， 装瓶， 灭菌， 趁热打散瓶内固态发酵培养基物料 ； 所述的固态发酵培养基的组分按重量比是 ： 紫苏叶提取液及滤渣 10-30%、 大米 0-35%， 米糠 15-20%、 黄豆粉 15-20%， 余量为营养液和水 ； 其中， 紫苏叶提取液与滤渣的重量比为 1:1-2， 加入营养液后调整含水量为 30-50% ； 所述的营养液中大豆蛋白胨含量为 20-50 g/ L、 蔗糖含量为 20-50 g/L、 酵母膏 20g/L ； （3） 红曲菌发酵培养 ： 接入已经培养 72h 以上的红曲液。
7、体菌种， 接种量为 7%-20%， 混合 均匀后在 30-32温度下培养 3-5 天， 然后在 22-24温度下培养 3-15 天， 将瓶中物料倒出 置于 60-80烘干处理得到具有抗氧化作用的紫苏红曲 ； 液体菌种采用的液体培养基组分 按重量比是 ： 葡萄糖3-7%， Na2SeO3 0.1-0.2%， 蛋白胨 2-4%， 土豆汁 2-3%， NaNO3 0.2-0.4%， MgSO4 0.1-0.2%， 余量为水。 2. 根据权利要求 1 所述的抗氧化红曲的制作方法， 其特征在于 ： 所述的红曲菌种选自 红色红曲菌、 紫色红曲菌、 丛毛红曲菌、 红曲红曲菌。 3.根据权利要求1所述的抗氧化。
8、红曲的制作方法， 其特征在于 ： 步骤 （1） 紫苏叶提取液 及滤渣基质的制备具体如下 ： 将干紫苏叶粉碎至 60-80 目， 按 1:20 的重量比例加入去离子 水， 超声破碎 40min 后抽滤， 得到紫苏叶的滤液和滤渣， 滤渣 60下烘干至恒重， 滤液用旋 转蒸发仪蒸馏后得到紫苏叶提取液。 权 利 要 求 书 CN 103315290 B 2 1/5 页 3 一种抗氧化红曲的制作方法 技术领域 0001 本发明涉及一种发酵方法， 特别涉及一种抗氧化红曲的制作方法。 背景技术 0002 红曲就是将红曲菌接种在大米 （或淀粉质物品） 上培养所得到的红曲菌菌丝体与 培养基质 （一般是大米） 组。
9、成的混合物。红曲既是中药材， 又是食品， 在中国古往今来一直被 广泛用作食品着色剂、 调味剂、 红腐乳制造原料、 肉类保存剂和药物。 0003 自从 1979 年日本学者在红曲中发现降脂活性物质莫纳可林 K（Monacolin K） 以 后， 国内外众多学者专家开始对红曲的活性成分进行了广泛而深入的研究， 并将研究成果 应用到了诸如食品、 医药等各领域， 逐渐形成了功能性红曲这一领域， 取得了巨大的经济和 社会效益。 功能红曲就是一种含有丰富的生物活性酶和多种生理活性物质， Monacolin K 、 麦角固醇、 - 氨基丁酸、 天然植物色素等红曲霉菌的代谢产物， 具有极高的营养保健、 药用 。
10、价值， 无任何毒副作用， 天然、 安全、 有效的保健食品、 药品原料。 0004 紫 苏 叶 为 唇 形 科 植 物 紫 苏 Perillae frutescens(L.) Britt. 的 干 燥 叶， 该植物主产于江苏、 湖北、 广东、 广西、 河南等地。紫苏含有多种化学成分， 如 紫 苏 醛 (perillaldehyde)、紫 苏 酮 (perillaketone)、榄 香 素 (elemicin)、石 竹 烯 (caryophellene)、 迷迭香酸 (rosmarinic acid)、 木犀草素 (luteolin)、 木犀草素的 7- 葡 萄糖苷等。迷迭香酸 (Rosmarin。
11、ic acid， RosA) 是有一定生理活性的酚酸类化合物 , 具有 极强的清除体内自由基的活性 , 其抗氧化活性强于咖啡酸、 绿原酸、 叶酸等。它对 H2O2 引 起的大鼠红细胞溶血和脂质过氧化有显著的抑制作用， 对由维生素 C-NADPH 或 Fe2+/O 半 胱氨酸诱发的大鼠脑、 肝、 肾微粒体的脂质过氧化亦都有很强的抑制作用， 可能是紫苏中存 在的主要非酶抗氧化物质。 发明内容 0005 本发明提供一种抗氧化红曲的制作方法， 该方法以紫苏叶为原料， 经适宜的处理 后使其作为固态发酵培养基的组分进行红曲的生产， 得到具有抗氧化物质的红曲产品。 0006 本发明解决其技术问题所采用的技术。
12、方案是 ： 0007 一种抗氧化红曲的制作方法， 该方法具体包括如下步骤 ： 0008 （1） 紫苏叶提取液及滤渣基质的制备 ： 0009 将干紫苏叶粉碎至 50-100 目， 按 1:18-22 的重量比例加入去离子水， 超声破碎 35-50min 后抽滤， 得到紫苏叶的滤液和滤渣， 滤渣烘干至恒重， 滤液蒸馏后得到紫苏叶提取 液 ； 0010 （2） 配置固态发酵培养基 ： 采用步骤 （1） 获得的紫苏叶提取液及滤渣配置固态发 酵培养基， 紫苏叶提取液及滤渣的加入量占固态发酵培养基总重量的 10-30%， 调节固态发 酵培养基的含水量在 30-50% 范围内后， 装瓶， 灭菌， 趁热打散瓶。
13、内固态发酵培养基物料 ； 0011 （3） 红曲菌发酵培养 ： 接入已经培养 72h 以上的红曲液体菌种， 接种量为 7%-20%， 说 明 书 CN 103315290 B 3 2/5 页 4 混合均匀后在 30-32温度下培养 3-5 天， 然后在 22-24温度下培养 3-15 天， 将瓶中物料 倒出置于 60-80烘干处理得到具有抗氧化作用的紫苏红曲。 0012 红曲菌菌种是经过液态菌种扩培后获得的红曲液体菌种。 这样既可获得足够的红 曲菌种， 有利于缩短发酵时间， 又可以给固态培养基补充水分。 本领域技术人员根据现有技 术可以选择适宜的液态培养基。 0013 作为优选， 所述的红曲菌。
14、种选自红色红曲菌、 紫色红曲菌、 丛毛红曲菌、 红曲红曲 菌。 0014 作为优选， 步骤 （2） 中， 所述的固态发酵培养基主要是以大米、 麸皮、 大豆或米糠中 的一种或几种以任意比例混合的组合物与步骤 （1） 制得的紫苏叶提取液及滤渣一起作为 基质， 其中， 紫苏叶提取液与滤渣的重量比为 1:1-2， 加入营养液后调整含水量为 30-50%。 作为优选， 所述的营养液中大豆蛋白胨含量为 20-50 g/L、 蔗糖含量为 20-50 g/L、 酵母膏 20g/L。进一步的， 固态发酵培养基的组分按重量比是 ： 紫苏叶提取液及滤渣 10-30%、 大米 0-35%， 米糠 15-20%、 黄豆。
15、粉 15-20%， 余量为营养液和水。本发明中， 所述的固态发酵培养基 除紫苏叶提取液与滤渣基质之外的其他组分均为常规组分， 本领域技术人员根据常识可以 选择合适组分和配比。固态发酵培养基的干物质组分一般需要粉碎处理后过 20 目筛再进 行使用。 0015 作为优选， 步骤 （3）中， 液体菌种采用的液体培养基组分按重量比是 ： 葡萄糖 3-7%， Na2SeO3 0.1-0.2%， 蛋白胨 2-4%， 土豆汁 2-3%， NaNO3 0.2-0.4%， MgSO4 0.1-0.2%， 余 量为水。 0016 作为优选， 步骤 （1） 紫苏叶提取液及滤渣基质的制备具体如下 ： 将干紫苏叶粉碎 。
16、至 60-80 目， 按 1:20 的重量比例加入去离子水， 超声破碎 40min 后抽滤， 得到紫苏叶的滤液 和滤渣， 滤渣60下烘干至恒重， 滤液用旋转蒸发仪蒸馏后得到紫苏叶提取液。 紫苏叶的滤 渣中仍含有较多的活性物质， 本发明利用其配置固态发酵培养基， 增加了红曲产品中抗氧 化物质的含量， 增大了原料物质的利用率。 0017 紫苏叶提取物中含有多种具有抗氧化活性的成分， 而红曲菌的代谢产物中同样含 有多种有效的抗氧化物质， 两者共同发酵可以使其中的各种成分通过一定途径相互转换， 使其中的抗氧化活性物质在发酵过程中得到提高。通过研究发现， 添加了紫苏提取物对红 曲中Dimerumic a。
17、cid含量的提高与红曲的抗氧化活性的增加呈正相关， 且紫苏叶中含有的 挥发性成分中可能包含能抑制红曲发酵产抗氧化活性物质的组分， 而这些组分能在超声破 碎法提取紫苏叶的过程中被除去， 提高了红曲发酵物中 Dimerumic acid 的产量。采用超声 破碎法可以将紫苏中的有效成分尽可能的提取出来， 加入到红曲的发酵物中， 增强红曲中 抗氧化成分 Dimerumic acid 的代谢。以前的研究紫苏是经过简单的提取其中的活性成分 而制备成各种物质或保健食品， 采用细胞破碎提取与红曲菌发酵增强代谢途径， 有效成分 提高。 0018 本发明的有益效果是 ： 本发明制得的抗氧化红曲中含有多种生理活性物。
18、质， 其中 Dimerumic acid 达到 3.1mg/g， 含有紫苏黄酮 2.5mg/g， Monacolin K 能达到 4-30mg/g， 还 含有红曲色素， 麦角甾醇， - 氨基丁酸， 不饱和脂肪酸 ； 具有很好的保健作用。 具体实施方式 说 明 书 CN 103315290 B 4 3/5 页 5 0019 下面通过具体实施例， 对本发明的技术方案作进一步的具体说明。 应当理解， 本发 明的实施并不局限于下面的实施例， 对本发明所做的任何形式上的变通和 / 或改变都将落 入本发明保护范围。 0020 在本发明中， 若非特指， 所有的份、 百分比均为重量单位， 所有的设备和原料等均。
19、 可从市场购得或是本行业常用的。 0021 实施例 1 0022 （1） 紫苏叶提取液及滤渣基质的制备 ： 0023 将干紫苏叶粉碎至 60-80 目， 按 1:20 的重量比例加入去离子水， 超声破碎 40min 后抽滤， 得到紫苏叶的滤液和滤渣， 滤渣 60下烘干至恒重， 备用 ； 滤液用旋转蒸发仪蒸馏 后得到紫苏叶提取液。 0024 （2） 配置固态发酵培养基 ： 0025 步骤 （1） 获得的紫苏叶提取液及滤渣 200g （紫苏叶提取液及滤渣的重量比为 1:2） 与大米粉 350g、 米糠 150 g、 黄豆粉 150 g 混合均匀后， 加入营养液 （含大豆蛋白胨 20 g/L、 蔗糖。
20、 20 g/L、 酵母膏 20g/L） ， 调节含水量至 50%， 拌匀分装入 500mL 三角瓶中， 每瓶 120g， 蒸 汽灭菌， 121灭菌 50min 后趁热打散瓶内固态发酵培养基物料 ； 0026 （3） 红曲菌发酵培养 ： 采用紫色红曲菌 （Monascus purpureus） 进行发酵生产红曲。 接入已经培养 72h 的液体菌种 （液体培养基 ： 葡萄糖 7%， Na2SeO3 0.1%， 蛋白胨 2%， 土豆汁 2%， NaNO30.2%， MgSO40.1%， 余量为水） ， 接种量 15%， 混合均匀之后进行发酵培养。在 30-32 温度下培养 5 天， 然后在 22-2。
21、4温度下培养 8 天， 将三角瓶中物料倒出置于 60烘干处理 得到紫苏红曲产品。 0027 经测定， 紫苏红曲产品中 Dimerumic acid 含量为 3.1mg/g， 紫苏黄酮 2.5mg/g， Monacolin K 含量为 16.88mg/g。测定方法参考 ： QB/T 2847-2007 功能红曲中莫拉可林 K （Monacolin K） 含量的测定方法。 0028 红曲发酵物中 Dimerumic acid 含量检测方法 ： 法， 具体如下 ： 反向色谱柱 Shim-pack VP-ODS C18（4.6150 mm ； 5m） ， 流动相 （A ： 水磷酸盐 =1000 1， 。
22、B ： 水乙 腈磷酸盐 =500 500 1） ， 流速 1.0ml/min， 常温检测波长 260nm。 0029 红曲发酵物中黄酮的检测方法 ： 亚硝酸钠 - 硝酸铝 - 氢氧化钠比色法 510nm 处测 定。下同。 0030 实施例 2 0031 （1） 紫苏叶提取液及滤渣基质的制备 ： 0032 将干紫苏叶粉碎至 60-80 目， 按 1:20 的重量比例加入去离子水， 超声破碎 40min 后抽滤， 得到紫苏叶的滤液和滤渣， 滤渣 60下烘干至恒重 ； 滤液用旋转蒸发仪蒸馏后得 到紫苏叶提取液 ； 将上述制得的紫苏叶提取液和滤渣混合后备用。 0033 （2） 配置固态发酵培养基 ： 。
23、0034 步骤 （1） 获得的紫苏叶提取液和滤渣混合物 300g 与大米粉 350g、 米糠 200 g、 黄 豆粉200 g混合均匀后， 加入营养液 （含大豆蛋白胨50 g/L、 蔗糖50 g/L、 酵母膏20g/L） ， 调 节含水量至 40%， 拌匀分装入 500mL 三角瓶中， 每瓶 120g， 蒸汽灭菌， 121灭菌 50min 后趁 热打散瓶内固态发酵培养基物料 ； 0035 （3） 红曲菌发酵培养 ： 采用红色红曲菌 （Monascus ruber） 进行发酵生产红曲。接 说 明 书 CN 103315290 B 5 4/5 页 6 入已经培养 72h 的液体菌种 （液体培养基 。
24、： 葡萄糖 3%， Na2SeO3 0.1%， 蛋白胨 4%， 土豆汁 2%， NaNO30.2%， MgSO40.1%， 余量为水） ， 接种量 15%， 混合均匀之后进行发酵培养。在 30-32温 度下培养 3 天， 然后在 22-24温度下培养 10 天， 将三角瓶中物料倒出置于 80烘干处理 得到紫苏红曲。 0036 经测定， 紫苏红曲产品中 Dimerumic acid 含量为 3.4mg/g， 紫苏黄酮 2.8mg/g， Monacolin K 含量为 25.35mg/g。 0037 实施例 3 0038 （1） 紫苏叶提取液及滤渣基质的制备 ： 0039 将干紫苏叶粉碎至 60-。
25、80 目， 按 1:20 的重量比例加入去离子水， 超声破碎 35min 后抽滤， 得到紫苏叶的滤液和滤渣， 滤渣 60下烘干至恒重， 备用 ； 滤液用旋转蒸发仪蒸馏 后得到紫苏叶提取液。 0040 （2） 配置固态发酵培养基 ： 0041 步骤 （1） 获得的紫苏叶提取液及滤渣 200g （紫苏叶提取液及滤渣的重量比为 1:1） 与大米粉 100g、 米糠 150 g、 黄豆粉 150 g 混合均匀后， 加入营养液 （含大豆蛋白胨 40 g/L、 蔗糖 40 g/L、 酵母膏 20g/L） ， 调节含水量至 35%， 拌匀分装入 500mL 三角瓶中， 每瓶 120g， 蒸 汽灭菌， 121。
26、灭菌 50min 后趁热打散瓶内固态发酵培养基物料 ； 0042 （3） 红曲菌发酵培养 ： 采用丛毛红曲菌 (Monascus pilosus) 进行发酵生产红曲。 接入已经培养 72h 的液体菌种 （液体培养基 ： 葡萄糖 3%， Na2SeO3 0.1%， 蛋白胨 4%， 土豆汁 2%， NaNO30.2%， MgSO40.1%， 余量为水） ， 接种量 20%， 混合均匀之后进行发酵培养。在 30-32 温度下培养 4 天， 然后在 22-24温度下培养 15 天， 将三角瓶中物料倒出置于 80烘干处 理得到紫苏红曲。 0043 经测定， 紫苏红曲产品中 Dimerumic acid 。
27、含量为 3.1mg/g， 紫苏黄酮 2.5mg/g， Monacolin K 含量为 8.16mg/g。 0044 实施例 4 0045 （1） 紫苏叶提取液及滤渣基质的制备 ： 0046 将干紫苏叶粉碎至 100 目， 按 1:18 的重量比例加入去离子水， 超声破碎 40min 后 抽滤， 得到紫苏叶的滤液和滤渣， 滤渣 60下烘干至恒重， 备用 ； 滤液用旋转蒸发仪蒸馏后 得到紫苏叶提取液。将上述制得的紫苏叶提取液和滤渣混合后备用。 0047 （2） 配置固态发酵培养基 ： 0048 步骤 （1） 获得的紫苏叶提取液和滤渣混合物 300g 与米糠 200 g、 黄豆粉 200 g 混 合。
28、均匀后， 加入营养液 （含大豆蛋白胨 40 g/L、 蔗糖 40 g/L、 酵母膏 20g/L） ， 调节含水量至 40%， 拌匀分装入500mL三角瓶中， 每瓶120g， 蒸汽灭菌， 121灭菌50min后趁热打散瓶内固 态发酵培养基物料 ； 0049 （3） 红曲菌发酵培养 ： 采用红曲红曲菌 (Monascus anka) 进行发酵生产红曲。接 入已经培养 72h 的液体菌种 （液体培养基 ： 葡萄糖 3%， Na2SeO3 0.1%， 蛋白胨 4%， 土豆汁 2%， NaNO30.2%， MgSO40.1%， 余量为水） ， 接种量 10%， 混合均匀之后进行发酵培养。在 30-32温。
29、 度下培养 3 天， 然后在 22-24温度下培养 10 天， 将三角瓶中物料倒出置于 80烘干处理 得到紫苏红曲。 0050 经测定， 紫苏红曲产品中 Dimerumic acid 含量为 3.1mg/g， 紫苏黄酮 2.4mg/g， 说 明 书 CN 103315290 B 6 5/5 页 7 Monacolin K 含量为 4.16mg/g。 0051 实施例 5 0052 （1） 紫苏叶提取液及滤渣基质的制备 ： 0053 将干紫苏叶粉碎至 50 目， 按 1:22 的重量比例加入去离子水， 超声破碎 50min 后抽 滤， 得到紫苏叶的滤液和滤渣， 滤渣 60下烘干至恒重， 备用 ；。
30、 滤液用旋转蒸发仪蒸馏后得 到紫苏叶提取液。将上述制得的紫苏叶提取液和滤渣混合后备用。 0054 （2） 配置固态发酵培养基 ： 0055 步骤 （1） 获得的紫苏叶提取液和滤渣混合物 300g 与大米粉 100g、 米糠 200 g、 黄 豆粉200 g混合均匀后， 加入营养液 （含大豆蛋白胨50 g/L、 蔗糖50 g/L、 酵母膏20g/L） ， 调 节含水量至 50%， 拌匀分装入 500mL 三角瓶中， 每瓶 120g， 蒸汽灭菌， 121灭菌 50min 后趁 热打散瓶内固态发酵培养基物料 ； 0056 （3） 红曲菌发酵培养 ： 采用红色红曲菌 （Monascus ruber） 。
31、进行发酵生产红曲。接 入已经培养 72h 的液体菌种 （液体培养基 ： 葡萄糖 3%， Na2SeO3 0.1%， 蛋白胨 4%， 土豆汁 2%， NaNO30.2%， MgSO40.1%， 余量为水） ， 接种量 15%， 混合均匀之后进行发酵培养。在 30-32温 度下培养 5 天， 然后在 22-24温度下培养 15 天， 将三角瓶中物料倒出置于 80烘干处理 得到紫苏红曲。 0057 经测定， 紫苏红曲产品中 Dimerumic acid 含量为 3.2mg/g， 紫苏黄酮 2.8mg/g， Monacolin K 含量为 4.85mg/g。 0058 本发明发酵得到的紫苏红曲产品中含有多种生理活性物质， 其中 Dimerumic acid 达到 3.1mg/g， 含有紫苏黄酮 2.5mg/g， Monacolin K 能达到 4-30mg/g， 还含有红曲色素， 麦 角甾醇， - 氨基丁酸， 不饱和脂肪酸 ； 具有很好的保健作用。 0059 以上所述的实施例只是本发明的一种较佳的方案， 并非对本发明作任何形式上的 限制， 在不超出权利要求所记载的技术方案的前提下还有其它的变体及改型。 说 明 书 CN 103315290 B 7 。