技术领域
本发明涉及牛大力组织培养技术领域。更具体地说，本发明涉及一种促进牛大力毛状根多糖积累的方法。
背景技术
牛大力为豆科崖豆藤属植物美丽崖豆藤(Millettia speciosa Champ.)，现代研究发现，牛大力含有多糖、生物碱、香豆素和多种微量元素等成分，其中牛大力多糖是其主要活性成分，具有调节免疫系统、抗氧化、抗炎、抗肿瘤活性，尤其是抗肿瘤方面疗效明确，目前临床研究显示其对鼻咽癌、卵巢癌、肺癌、以及结肠癌具有良好的治疗效果，同时牛大力多糖也是理想的免疫增强剂，在药物制备中需求量日渐增加。
然而随着牛大力需求量的不断增加，野生资源已经枯竭，原材料严重供不应求。为了解决供需矛盾，人们尝试采用人工栽培的方法扩大药源，目前已发现有一些成功的研究报道，但仍存在着许多问题制约其规模化生产，具体表现在种子苗不结薯或薯块产量很不稳定，扦插苗成活率低，组培苗生根非常困难等方面。而且牛大力生长周期长(一般5年才形成产量)，以常规方法育种或育苗，需要花费很长时间，因繁殖系数小、耗种量大，导致发展速度很慢且生产成本增加，并且因病虫害危害严重导致退化，严重影响了产量和品质。于是，如何利用高新技术研究获得大量牛大力多糖等有效成分满足临床所需，并实现资源的可持续利用已迫在眉睫。我们针对牛大力开发后出现的资源可持续发展问题，在成功突破牛大力组培快繁技术的基础上开展牛大力毛状根培养体系的研究，以期探索出利用牛大力毛状根直接生产有效成分的新途径，有利于牛大力有效成分的开发和利用，同时为进一步通过扩大培养牛大力毛状根以生产多糖成分提供了新的途径和方法。
发明内容
本发明的一个目的是解决至少上述问题，并提供至少后面将说明的优点。
本发明还有一个目的是提供一种促进牛大力毛状根多糖积累的方法，通过对牛大力毛状根进行特定条件下的扩大培养，从而提高牛大力毛状根中牛大力多糖的含量，为牛大力多糖的获得提供新途径。
为了实现根据本发明的这些目的和其它优点，提供了一种促进牛大力毛状根多糖积累的方法，以牛大力毛状根接种至液体培养基中置于恒温摇床上进行增殖培养至少30天，所述液体培养基中含有100-300μmol/L茉莉酸甲酯。
优选的是，所述的促进牛大力毛状根多糖积累的方法，所述液体培养基的配方为：1/2MS+0.5-1.0mg/L吲哚丁酸+100-300μmol/L茉莉酸甲酯+30g/L蔗糖。
优选的是，所述的促进牛大力毛状根多糖积累的方法，所述增殖培养的条件为：光照强度1500～2000Lx、光照时间10h/d。
优选的是，所述的促进牛大力毛状根多糖积累的方法，恒温摇床的转速为90-150rmp。
优选的是，所述的促进牛大力毛状根多糖积累的方法，所述增殖培养进行全程的变温培养，分别为15～18℃下恒温培养8h与30～35℃恒温培养16h的两个阶段交替变温处理。
优选的是，所述的促进牛大力毛状根多糖积累的方法，增殖培养过程中，每间隔10天将装载有牛大力毛状根的液体培养基在波长为280-320nm的中波紫外线下辐射处理8h。
优选的是，所述的促进牛大力毛状根多糖积累的方法，所述液体培养基中茉莉酸甲酯浓度为220-250μmol/L。
优选的是，所述的促进牛大力毛状根多糖积累的方法，牛大力毛状根接种至液体培养基之前，先经如下前处理：将牛大力毛状根置入装有前处理溶液的玻璃容器中，置于200-300高斯磁场中磁化处理2h，且在磁化处理的同时，播放轻音乐，且每播放30min之后暂停10min，播放音量控制在30-90db之间，磁化处理之后取出牛大力毛状根，备用；
所述前处理溶液以玉米须浸煮水为溶剂，其配方为：0.5mg/L纳米氧化锌+0.1mg/L油菜素内酯+3g/L麦芽糊精+1.0g/Lβ-葡聚糖+10mg/L柚皮苷，所述前处理溶液在使用前，先经过振荡频率为20KHz的超声振荡处理5min，所述玉米须浸煮水由玉米须和磁化水按照重量比为1:100混合，经武火煮沸后文火熬煮2h后过滤取滤液冷却后得到。
本发明至少包括以下有益效果：
1)本发明提供的整套方法操作简便，生产成本低，有利于牛大力有效成分的开发和利用，同时为进一步通过扩大培养牛大力毛状根以生产多糖成分提供了新的途径和方法；
2)通过采用含有适宜浓度的茉莉酸甲酯的培养基对牛大力毛状根进行刺激，促进牛大力毛状根在培养过程的增殖，从而提高其含有的牛大力多糖含量；
3)通过在对牛大力毛状根进行变温式的增殖培养，进一步提高牛大力毛状根的增殖倍数，从而提高牛大力多糖的含量；
4)通过在增殖培养中采用波长为280-320nm的中波紫外线辐射处理牛大力毛状根，进一步提高牛大力毛状根的增殖能力，从而进一步提高牛大力多糖的含量；
5)通过在增殖培养前，对牛大力毛状根进行前处理，采用前处理溶液浸泡处理，其中，前处理溶液中的纳米氧化锌和麦芽糊精在牛大力毛状根的表层形成一层膜，承载并促进油菜素内酯、β-葡聚糖和柚皮苷对牛大力毛状根进行诱导，并结合磁化和轻音乐刺激的协调作用，促使牛大力毛状根的生长速度加快，合成能力增强，牛大力多糖活性物质大大增加。
本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
需要说明的是，下述实施方案中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
优选的是，所述的促进牛大力毛状根多糖积累的方法，所述液体培养基中茉莉酸甲酯浓度为220-250μmol/L。
实施例1：
一种促进牛大力毛状根多糖积累的方法，以牛大力毛状根接种至液体培养基中置于恒温摇床上进行增殖培养至少30天，所述液体培养基中含有100μmol/L茉莉酸甲酯。
其中，所述液体培养基的配方还含有：1/2MS、0.5mg/L吲哚丁酸和30g/L蔗糖。
其中，所述增殖培养的条件为：光照强度1500Lx、光照时间10h/d。
其中，恒温摇床的转速为90rmp，增殖培养温度设定为24℃。
实施例2：
一种促进牛大力毛状根多糖积累的方法，以牛大力毛状根接种至液体培养基中置于恒温摇床上进行增殖培养至少30天，所述液体培养基中含有300μmol/L茉莉酸甲酯。
其中，所述液体培养基的配方还含有：1/2MS、1.0mg/L吲哚丁酸和30g/L蔗糖。
其中，所述增殖培养的条件为：光照强度2000Lx、光照时间10h/d。
其中，恒温摇床的转速为150rmp，增殖培养温度设定为28℃。
实施例3：
一种促进牛大力毛状根多糖积累的方法，以牛大力毛状根接种至液体培养基中置于恒温摇床上进行增殖培养30天，所述液体培养基中含有220μmol/L茉莉酸甲酯。
其中，所述液体培养基的配方还含有：1/2MS、0.8mg/L吲哚丁酸和30g/L蔗糖。
其中，所述增殖培养的条件为：光照强度18000Lx、光照时间10h/d。
其中，恒温摇床的转速为120rmp，增殖培养温度设定为26℃。
实施例4：
在实施例3的基础上，所述的促进牛大力毛状根多糖积累的方法，所述增殖培养进行全程的变温培养，分别为15℃下恒温培养8h与30℃恒温培养16h的两个阶段交替变温处理，其他同实施例3。
实施例5：
在实施例3的基础上，所述的促进牛大力毛状根多糖积累的方法，所述增殖培养进行全程的变温培养，分别为18℃下恒温培养8h与35℃恒温培养16h的两个阶段交替变温处理，其他同实施例3。
实施例6：
在实施例3的基础上，所述的促进牛大力毛状根多糖积累的方法，所述增殖培养进行全程的变温培养，分别为16℃下恒温培养8h与32℃恒温培养16h的两个阶段交替变温处理，其他同实施例3。
实施例7：
在实施例4的基础上，所述的促进牛大力毛状根多糖积累的方法，增殖培养过程中，每间隔10天将装载有牛大力毛状根的液体培养基在波长为280nm的中波紫外线下辐射处理8h。
实施例8：
在实施例4的基础上，所述的促进牛大力毛状根多糖积累的方法，增殖培养过程中，每间隔10天将装载有牛大力毛状根的液体培养基在波长为320nm的中波紫外线下辐射处理8h。
实施例9：
在实施例4的基础上，所述的促进牛大力毛状根多糖积累的方法，增殖培养过程中，每间隔10天将装载有牛大力毛状根的液体培养基在波长为300nm的中波紫外线下辐射处理8h。
实施例10：
在实施例9的基础上，所述的促进牛大力毛状根多糖积累的方法，牛大力毛状根接种至液体培养基之前，先经如下前处理：将牛大力毛状根置入装有前处理溶液的玻璃容器中，置于200-300高斯磁场中磁化处理2h，且在磁化处理的同时，播放轻音乐，且每播放30min之后暂停10min，播放音量控制在30-90db之间，磁化处理之后取出牛大力毛状根，备用；
所述前处理溶液以玉米须浸煮水为溶剂，其配方为：0.5mg/L纳米氧化锌+0.1mg/L油菜素内酯+3g/L麦芽糊精+1.0g/Lβ-葡聚糖+10mg/L柚皮苷，所述前处理溶液在使用前，先经过振荡频率为20KHz的超声振荡处理5min，所述玉米须浸煮水由玉米须和磁化水按照重量比为1:100混合，经武火煮沸后文火熬煮2h后过滤取滤液冷却后得到。
对比例1：
在实施例3的基础上，去除液体培养基中的茉莉酸甲酯，其他培养条件与实施例3相同。
一种促进牛大力毛状根多糖积累的方法，以牛大力毛状根接种至液体培养基中置于恒温摇床上进行增殖培养30天，所述液体培养基的配方为1/2MS、吲哚丁酸0.8mg/L和蔗糖30g/L。
其中，所述增殖培养的条件为：光照强度18000Lx、光照时间10h/d。
其中，恒温摇床的转速为120rmp，增殖培养温度设定为26℃。
为了说明本发明的方法的技术效果，本申请的发明人针对对比例1、实施例3-10培养的毛状根测量其牛大力多糖含量，得出每克毛状根(干重)含有的牛大力多糖含量，以及以对比例1为基础，得出的牛大力多糖含量的增幅见下表1。
表1不同实施方案下牛大力毛状根中多糖含量
从表1可以看出，以对比例1为参照，结合实施例3、实施例4-6可以看出在液体培养基中加入一定浓度的茉莉酸甲酯和适当的变温培养可以促进毛状根中牛大力多糖含量的增加，而从实施例7-9可以看出，采用波长为280-320nm的中波紫外线下辐射处理可以较大幅度的促进毛状根中牛大力多糖的含量增加；从实施例10可以看出，对牛大力毛状根进行前处理，可以大幅度促进毛状根中多糖的积累。
为了说明本发明的液体培养基中茉莉酸甲酯的浓度对毛状根中牛大力多糖的积累的效果，本申请的发明人在实施例3的基础上，以茉莉酸甲酯浓度依次设定为：100、130、160、190、220、250、280、300μmol/L，进行牛大力毛状根的增殖培养，得出每克毛状根(干重)含有的牛大力多糖含量，见表2。
表2不同浓度的茉莉酸甲酯对牛大力毛状根多糖含量的影响
以对比例1为参照，从表2可以看出，在体液培养基中增加适宜浓度的茉莉酸甲酯可以增强牛大力毛状根多糖的含量，其中以茉莉酸甲酯浓度为220-300μmol/L时效果更佳。
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的实施例。