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1、(10)申请公布号 CN 102524241 A (43)申请公布日 2012.07.04 CN 102524241 A *CN102524241A* (21)申请号 201010610947.6 (22)申请日 2010.12.16 A01N 1/02(2006.01) (71)申请人 宁波大学 地址 315211 浙江省宁波市风华路 818 号 (72)发明人 严小军 马建 陈海敏 竺俊全 徐善良 (74)专利代理机构 宁波诚源专利事务所有限公 司 33102 代理人 袁忠卫 (54) 发明名称 一种鱼类精细胞冻存保护液的添加剂 (57) 摘要 本发明涉及一种鱼类精细胞冻存保护液 的添加剂。
2、， 其特征在于具有下述结构式的虾青 素， 其 添 加 浓 度 为 1.4310-6-1.4310-4mol/ L， 它可以保证精子在低温保存的过程中减 轻冷冻损伤， 营养精子， 并延长其活力， 对鱼 的 人 工 养 殖 和 种 质 资 源 保 护 有 重 要 意 义 ； 其中 R1 和 R2 为 H 或任意的脂肪酸。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 4 页 附图 1 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 4 页 附图 1 页 1/1 页 2 1. 一种鱼类精细胞冻存保护液的添加剂， 其特征在于具有下述结构式的虾青素， 其。
3、添 加浓度为 1.4310-6-1.4310-4mol/L， 其中 R1 和 R2 为 H 或任意的脂肪酸。 2. 根据权利要求 1 所述的添加剂， 其特征在于所述虾青素为合成虾青素或天然虾青 素。 3.根据权利要求2所述的添加剂， 其特征在于所述合成虾青素浓度为9599(质 量 )， 天然虾青素浓度为 1 7 ( 质量 )。 4. 根据权利要求 3 所述的添加剂， 其特征在于所述天然虾青素是从微藻、 微生物或水 产品废弃物中提取。 权 利 要 求 书 CN 102524241 A 2 1/4 页 3 一种鱼类精细胞冻存保护液的添加剂 技术领域 0001 本发明涉及冻存保护液， 具体涉及一种鱼。
4、类精细胞冻存保护液的添加剂。 背景技术 0002 近年来， 由于人类和自然的综合影响， 鱼类物种数量和质量呈现明显的下降趋势， 种质发生退化现象， 影响鱼类资源产业的可持续发展。鱼类精子超低温冻存是种质保存的 有效途径之一， 将名贵、 濒危鱼类的优质精子超低温冷冻起来， 建立精子库长期保存， 对其 遗传育种研究、 生产养殖和种质资源的保护具有重要意义。 0003 精细胞对低温敏感， 冷冻解冻使精子结构和功能极易受到损伤， 精细胞结构和功 能成分的破坏是影响其活力下降的一个重要因素。冷冻 - 解冻过程中会产生大量活性氧 (reactive oxygen species ROS)， 过量的活性氧会。
5、过度氧化胞膜脂质、 断裂DNA链、 破坏染 色质、 诱发凋亡和坏死。保护精细胞免受氧化损伤是解决这一问题的有效途径之一。一些 活性物质如维生素 C 和 E、 海藻糖、 抗冻蛋白等仅集中于人类和畜牧业动物精子的超低温保 存中， 并取得了可喜的成果。 国内曾有人研究将海藻多糖、 中药成分添加到猪精冷冻保护液 中， 在一定程度上提高了精子的活力。目前鱼类精子超低温保存的研究大多集中于筛选渗 透性保护剂如 DMSO， 甘油， 甲醇等使用浓度的研究， 而筛选一种有效的冷冻液添加剂应用于 鱼类精子的超低温保存中未见报道。 0004 虾青素是目前发现的抗氧化能力最强的 - 胡萝卜素类物质， 其抗氧化能力是维。
6、 生素 E 的 500 倍， 称为 “超级抗氧化剂” ， 相关研究表明， 虾青素在生物膜上有富集作用， 具 备类 “胆固醇” 稳定脂双层及降低膜表面游离水的性质， 增强膜的稳定性、 降低通透性， 还能 高效地清除过多的活性氧 (ROS) 自由基、 保护膜脂和线粒体、 调节信号通路。有美国专利 (US6054491 和 US6410602) 公开了一种虾青素喂食动物以提高精液量、 增强生育能力的方 法， 但直接以虾青素添加到鱼类精子冻存液中作为保护性添加剂的研究国内外都尚无报道 也无相关专利申请。 发明内容 0005 本发明所要解决的技术问题是提供一种使得鱼精子的运动时间与寿命显著增加 的鱼类精。
7、细胞冻存保护液的添加剂。 0006 本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为 ： 一种鱼类精细胞冻存保护液的添 加剂， 其特征在于具有下述结构式的虾青素， 其添加浓度为 1.4310-6-1.4310-4mol/L， 0007 说 明 书 CN 102524241 A 3 2/4 页 4 0008 其中 R1 和 R2 为 H 或任意的脂肪酸。 0009 优选， 所述虾青素为合成虾青素或天然虾青素。 0010 再改进， 所述合成虾青素浓度为 95 99(wt)， 天然虾青素浓度为 1 7(wt)。 0011 最后， 所述天然虾青素是从微藻 ( 雨生红球藻 )、 微生物 ( 红法夫酵母 ) 或水。
8、产品 废弃物 ( 虾蟹壳 ) 中提取。 0012 该鱼类精细胞冻存保护液是在冻存保护液的基础上添加了这种冻存保护液添加 剂， 所述冻存保护液是由 Cortland 稀释液 (NaCl 7.25g/L， KCl 0.38g/L， CaCl2 0.18g/ L， NaHCO3 1.00g/L， MgSO47H2O 0.23g/L， NaH2PO42H2O 0.41g/L， C6H12O6 1.00g/L， pH 7.00)， 和含 10 (v/v) 二甲基亚砜的抗冻剂组成。 0013 与现有技术相比， 本发明的优点在于 ： 在冻存保护液中添加了虾青素， 虾青素可以 清除冷冻解冻时产生的活性氧， 保。
9、护质膜和线粒体膜免受氧化损伤 ； 能够保护线粒体功能， 以提供精子游动和调节渗透压所需的 ATP 能量 ； 在冻存保护液中加入虾青素后， 使得鱼精 子的运动时间与寿命显著增加 ； 并且虾青素极易溶于 DMSO， 配制方便。本发明的鱼类精细 胞冻存保护液的添加剂， 可以保证精子在低温保存的过程中减轻冷冻损伤， 营养精子， 并延 长其活力， 对鱼的人工养殖和种质资源保护有重要意义。 附图说明 0014 图 1 为大黄鱼精细胞的 SCGE 图 ； 0015 图 2 虾青素对大黄鱼精子细胞膜和线粒体的影响， 流失细胞仪分析图。 具体实施方式 0016 以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。 00。
10、17 实施例 1 0018 1、 提取虾青素 ： 将雨生红球藻 (Haematococcus pluvialis) 藻粉 50g 用甲醇 / 氢 氧化钾混合液 (30甲醇中含 5 KOH)50下处理 15min， 以去除叶绿素， 蒸馏水洗 2 两次， 去除上清液后 40烘干。用液氮研磨 0.5min， 重复一次， 以充分破壁。加入适量丙酮， 震荡 提取， 离心取上清液， 直至藻细胞颜色变白， 得到澄清深红色的虾青素类物质提取液。 0019 2、 将提取的虾青素， 溶于含 10二甲基亚砜的基础稀释液中， 配成虾青素浓度为 1.4310-6-1.4310-4mol/L 的鱼类精细胞冻存保护液。 0。
11、020 实施例 2 0021 1、 提取虾青素 ： 取预先处理的但未破壁的雨生红球藻藻粉装于装置萃取釜中， 萃 取工艺条件为 ： 萃取压力为 35MPa， 萃取温度为 80 ； 分离釜压力 6MPa， 温度 50 ； 分离釜 压力 6MPa， 温度 45 ； 不添加夹带剂 ； 萃取时间 3h， 得到虾青素油剂。 0022 2、 将提取的虾青素， 溶于含 10二甲基亚砜的基础稀释液中， 配成虾青素浓度为 1.4310-6-1.4310-4mol/L 的鱼类精细胞冻存保护液。 0023 实施例 3 0024 直接市售合成虾青素， 溶于含 10二甲基亚砜的基础稀释液中， 配成虾青素浓度 为 1.43。
12、10-6-1.4310-4mol/L 的鱼类精细胞冻存保护液。 说 明 书 CN 102524241 A 4 3/4 页 5 0025 下面通过具体的各项实验来比较说明添加本发明的添加虾青素的鱼类精细胞冻 存保护液对鱼类精细胞的冻存性能的影响 ： 0026 一、 虾青素对大黄鱼精子活力影响 0027 本实验例选择 10 DMSO 作为抗冻剂， 其它组别在此基础上分别添加不同浓 度的虾青素。结果显示 ( 表 1)， 鲜精激活率接近 100， 即基本全部激活 ； 运动时间为 (6.020.10)min， 寿命为 (7.710.29)min。由于受到冷冻损伤， 模型组 (10 DMSO) 运 动时间。
13、和寿命缩短， 分别为 (4.710.11) 和 (7.130.06)min， 与鲜精相比， 差异极其 显著 (P 0.01)， 而随着虾青素浓度的增加， 寿命和运动时间也随之增加， 其中， 浓度为 1.4310-4mol/L 的虾青素作用效果最为明显， 与模型组相比差异极其显著 (P 0.01)。而 各组激活率都在 90以上， 且无显著差异。结果表明， 适当浓度 (1.4310-4mol/L) 的虾青 素能够延长冷冻解冻后精子的运动时间和寿命。 0028 表 1 大黄鱼精子活力指标 n 4， *P 0.01vs 鲜精 (Control group) ；#P 0.05， #P 0.01vs 冷冻。
14、组 (10 DMSO) 0029 0030 二、 虾青素对大黄鱼精子 DNA 损伤的保护 0031 本实验例以精子 DNA 损伤状况来衡量精子质量。损伤的 DNA 其电泳结果会发现， DNA 从细胞核中溢出， 朝阳极泳动， 形成尾状带， 即彗尾， 未损伤的 DNA 部分保持球形， 两者 共同形成 “彗星” 。彗尾的长度代表 DNA 迁移距离， 荧光染色后彗尾的荧光强度与 DNA 损伤 度相关。SCGE 检测结果显示 ( 图 1， 表 2)， 在 10 DMSO 的冷冻剂条件下， 冻精 (B、 C 组 ) 的 彗星全长和尾长都有所增大， 但含有 1.4310-4mol/L 虾青素组增加程度小， 。
15、与鲜精相比， 全长和尾长分别增加 9.76和 69.5， 较只含 10 DMSO 的冻精分别减少 50左右。说明 冷冻解冻后大黄鱼精子细胞在其他条件相同的情况下， 添加虾青素能够保护精细胞的细胞 膜结构， 增加膜的稳定性， 从而减轻了 DNA 冷冻损伤的程度。 0032 表 2 大黄鱼精子活力指标 n 4， *P 0.01vs 鲜精 (Control group) ；#P 0.05， #P 0.01vs 冷冻组 (10 DMSO) 说 明 书 CN 102524241 A 5 4/4 页 6 0033 0034 三、 虾青素对大黄鱼精子细胞膜及线粒体完整性的影响 0035 本实验例采用罗丹明 。
16、123 和碘化丙啶双染法， 流式细胞仪分析精子质量， 十字门 将流式点图分为四个区， 左上区 ： 质膜和线粒体都受损 ； 左下区 ： 质膜完整但线粒体功能丧 失 ； 右下区 ： 质膜和线粒体功能都完整 ； 右上区 ： 质膜受损而线粒体功能正常。 0036 如图 2， 鲜精的质膜和线粒体有少量的受损， 可能是因为精子本身质量和实验操作 过程造成的， 质膜和线粒体正常的占 (89.772.54) ； 含 10 DMSO 精子细胞膜和线粒体 较大部分受损， 其中质膜和线粒体都正常的占 (45.314.55) ； 添加 1.4310-4mol/L 的 虾青素冻精复苏后， 质膜和线粒体都正常的占 (64。
17、.583.97)。结果表明， 精子细胞质膜 和线粒体质量有所提高， 说明虾青素能够保护精细胞质膜和线粒体功能的完整性， 从而减 轻了冷冻 - 复苏过程对细胞造成过度的损伤。 0037 从以上实验数据可以看出， 本发明的添加了虾青素的鱼类精细胞冻存保护液， 能 提高鱼精子的活力及寿命 ； 能保护精细胞的细胞膜结构， 增加膜的稳定性， 从而减轻了 DNA 冷冻损伤的程度 ； 能够保护精细胞质膜和线粒体功能的完整性， 从而减轻了冷冻 - 复苏过 程对细胞造成过度的损伤。 使得鱼精子在低温保存的过程中减轻冷冻损伤， 营养精子， 并延 长其活力， 对鱼的人工养殖和种质资源保护有重要意义。 说 明 书 CN 102524241 A 6 1/1 页 7 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 102524241 A 7 。