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1、(10)申请公布号 CN 103070200 A (43)申请公布日 2013.05.01 CN 103070200 A *CN103070200A* (21)申请号 201310044002.6 (22)申请日 2013.02.04 201210041090.X 2012.02.22 CN A01N 63/04(2006.01) A01N 25/04(2006.01) A01P 7/04(2006.01) (71)申请人 成都医学院 地址 610083 四川省成都市金牛区蓉都大道 天回路 601 号 (72)发明人 杨平 潘克俭 苏晓庆 李敏惠 刘萍 李华 邹强 王玉明 王伦安 (74)专利。
2、代理机构 成都高远知识产权代理事务 所 ( 普通合伙 ) 51222 代理人 李高峡 张娟 (54) 发明名称 一种灭蚊凝胶剂及其制备方法 (57) 摘要 本发明公开了一种灭蚊凝胶剂， 它是以 Pythium sp.GY1938 菌丝体为活性成分， 加上辅 料制备而成的凝胶剂， 所述凝胶剂含有如下用量 的组分 ： Pythium sp.GY1938 菌丝体 150300g/ L、 1/81/2 常用真菌培养基和凝固剂 0.52g/ L。 本发明还公开所述灭蚊凝胶剂的制备方法。 本 发明灭蚊凝胶剂灭蚊效果显著， 稳定性好， 有效期 长， 环境友好。 (66)本国优先权数据 (51)Int.Cl.。
3、 权利要求书 1 页 说明书 5 页 附图 2 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书5页 附图2页 (10)申请公布号 CN 103070200 A CN 103070200 A *CN103070200A* 1/1 页 2 1. 一种灭蚊凝胶剂， 其特征在于 ： 它是以 Pythium sp.GY1938 菌丝体为活性成分， 加 上辅料制备而成的凝胶剂， 所述凝胶剂含有如下用量的组分 ： Pythium sp.GY1938 菌丝体 150300g/L、 1/81/2 常用真菌培养基和凝固剂 0.52g/L。 2. 根据权利要求 1 所述的灭蚊。
4、凝胶剂， 其特征在于 ： 所述凝胶剂含有如下用量的组分 ： Pythium sp.GY1938 菌丝体 200g/L、 1/4 常用真菌培养基和凝固剂 1g/L。 3. 根据权利要求 1 或 2 所述的灭蚊凝胶剂， 其特征在于 ： 所述常用真菌培养基为 KPYG2 培养基， 所述培养基每升含有如下重量的成分 ： 蛋白胨 1.5g、 酵母膏 0.5g、 葡萄糖 3g、 胆固 醇 25mg、 氯化钙 110mg、 植物油 10g， 余量为水。 4. 根据权利要求 3 所述的灭蚊凝胶剂， 其特征在于 ： 所述植物油为玉米油。 5. 根据权利要求 1 或 2 所述的灭蚊凝胶剂， 其特征在于 ： 所述凝。
5、固剂是琼脂、 明胶或硅 胶。 6. 根据权利要求 15 任意一项所述的灭蚊凝胶剂， 其特征在于 ： 每升灭蚊凝胶剂中还 包括如下用量的辅料 ： 抗逆保护剂 525g/L。 7. 根据权利要求 6 所述的灭蚊凝胶剂， 其特征在于 ： 所述抗逆保护剂的用量为 10g/L。 8. 根据权利要求 6 或 7 所述抗逆保护剂， 其特征在于 ： 所述抗逆保护剂为海藻糖、 丙三 醇或赤藻糖醇。 9. 一种制备权利要求 18 任意一项所述灭蚊凝胶剂的方法， 其特征在于 ： 包括如下步 骤 ： a、 按权利要求 18 任意一项所述配比， 取 Pythium sp.GY1938 菌丝体和辅料 ； b、 将辅料混匀。
6、， 溶化， 调 pH 值至 7.010.0， 冷却至 4060， 加入菌丝体， 匀浆搅拌， 得 凝胶混悬液， 成型， 即可。 权 利 要 求 书 CN 103070200 A 2 1/5 页 3 一种灭蚊凝胶剂及其制备方法 技术领域 0001 本发明涉及一种灭蚊凝胶剂。 背景技术 0002 蚊虫属双翅目昆虫， 可以传播疟疾、 丝虫病、 黄热病和登革热扥多种蚊媒疾病， 威 胁人类健康， 其发育属于变态发育， 需历经卵、 幼虫 （孑孓） 、 蛹、 成虫 4 个时期。与成虫相比， 蚊蚴须高密度生活在水中， 所以水生阶段是大规模杀灭蚊虫、 从源头防治蚊媒疾病最有效 的切入点。 目前， 蚊虫防治的常用手。
7、段仍以传统的化学药剂杀灭为主， 但化学农药存在环境 污染、 生态平衡被破， 并导致害虫产生抗药性。 生物防治是采用害虫天敌或可对害虫致病的 微生物来控制或杀灭害虫。它有对害虫高度特异性， 对非靶生物无毒无害， 不污染环境， 不 破坏生态平衡， 不易诱导害虫的抗药性的优点， 是较为理想的害虫防治方法。 0003 Pythium sp.GY1938 是由贵阳医学院苏晓庆教授从中国西南土壤中分离得到的丝 状腐霉Pyghium guiyangense， 于2005年3月7日保藏在中国典型培养物保藏中心(地址 ： 中国武汉武汉大学 )， 保藏号 ： CCTCC NO ： M205020， 又名 ： 贵阳。
8、腐霉 (Pythium guiyangense Su， GY， Pggy)， 记载在专利申请号 ： 200510003027.7， 发明名称 ：“一种腐霉属菌种及其用 途” 的专利申请中。该腐霉能够对尚处于水生阶段、 高度密集的蚊蚴孑孓进行有效灭 杀， 可以有效切断蚊虫传播疾病的途径， 但是， 其灭蚊的应用尚处于起步阶段， 因腐霉只有 在有活力的情况下才能灭蚊， 直接将腐霉制成灭蚊产品， 活力差， 难以满足实际应用的需 要， 目前， 还未见报道使用该腐霉制备的灭蚊产品。 发明内容 0004 为了解决上述技术问题， 本发明提供了一种灭蚊凝胶剂以及该灭蚊凝胶剂的制备 方法。 0005 本发明灭蚊凝。
9、胶剂， 它是以Pythium sp.GY1938菌丝体为活性成分， 加上辅料制备 而成的凝胶剂， 所述凝胶剂含有如下用量的组分 ： Pythium sp.GY1938 菌丝体 150300g/L、 1/81/2 常用真菌培养基和凝固剂 0.52g/L。 0006 本发明 Pythium sp.GY1938， 于 2005 年 3 月 7 日保藏在中国典型培养物保藏中 心 ( 地址 ： 中国武汉武汉大学 )， 保藏号 ： CCTCC NO ： M205020， 又名 ： 贵阳腐霉 (Pythium guiyangense Su， GY， Pggy)。 0007 1/81/2常用真菌培养基 ： 溶。
10、质浓度为常用真菌培养基1/41/2倍的培养基。 常 用真菌培养基， 是指用于真菌培养的常规培养基， 如马丁氏培养基、 察氏培养基、 马铃薯培 养基。 0008 凝固剂 ： 是使溶液凝固为不溶性凝胶状态的添加剂， 又被称为组织硬化剂。 0009 优选地， 所述凝胶剂含有如下用量的组分 ： Pythium sp.GY1938 菌丝体 200g/L、 1/4 常用真菌培养基和凝固剂 1g/L。 0010 优选地， 所述常用真菌培养基为 KPYG2培养基， 所述培养基每升含有如下成分 ： 蛋 说 明 书 CN 103070200 A 3 2/5 页 4 白胨 1.5g、 酵母膏 0.5g、 葡萄糖 3。
11、g、 胆固醇 25mg、 氯化钙 110mg、 植物油 10g， 余量为水。其 中， 所述植物油为玉米油。 0011 其中， 所述凝固剂是琼脂、 明胶或硅胶。 0012 其中， 每升灭蚊凝胶剂中还包括如下用量的辅料 ： 抗逆保护剂 525g/L。 0013 抗逆保护剂， 是指在高温、 高寒、 高渗透压及干燥失水等恶劣环境条件下维持生命 体的生命过程和生物特征的物质。 0014 优选地， 所述抗逆保护剂的用量为 10g/L。 0015 其中， 所述抗逆保护剂为海藻糖、 丙三醇或赤藻糖醇。 0016 本发明灭蚊凝胶剂的方法， 包括如下步骤 ： 0017 a、 按前述配比， 取 Pythium sp。
12、.GY1938 菌丝体和辅料 ； 0018 b、 将辅料与水混合， 溶化， 调pH值至7.010.0， 冷却至4060， 加入菌丝体， 匀浆 搅拌， 得凝胶混悬液， 成型， 即可。 0019 根据申请人研究发现， 以腐霉Pythium sp.GY1938活性成分， 使用真菌农药制剂的 常规辅料， 制成常见制剂， 如乳剂、 油剂和粉剂， 存在稳定性差、 货架保质期短的问题， 辅以 常见的稳定剂后， 仍然难以克服该缺陷， 同时， 因使用对象为水体， 乳剂、 油剂和粉剂会飘在 水面上， 难以有效灭蚊， 使用不方便， 污染水体。 0020 本发明以 Pythium sp.GY1938 菌丝体为有效活性。
13、成分， 以 1/81/2 常用真菌培 养基和凝固剂为辅料， 成功制备得到灭蚊凝胶剂， 凝胶剂中菌丝的活力强， 稳定性好， 放置 6 个月后菌丝体活性无显著变化， 灭蚊活性好， 持续时间长， 使用方便， 不会污染环境， 生产工 艺简单， 成本低廉， 应用前景良好。 0021 显然， 根据本发明的上述内容， 按照本领域的普通技术知识和惯用手段， 在不脱离 本发明上述基本技术思想前提下， 还可以做出其它多种形式的修改、 替换或变更。 0022 以下通过实施例形式的具体实施方式， 对本发明的上述内容再作进一步的详细说 明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容 所实。
14、现的技术均属于本发明的范围。 附图说明 0023 图 1 本发明灭蚊凝胶剂的菌丝体生长活力 0024 图 2 本发明灭蚊凝胶剂中 Pythium sp.GY1938 菌丝体形态 （激光共聚焦显微镜 Olympus FV1000， Calcofluor White M2R， 365nm 激 发） A. 明 场， 1020 ； B.365nm 激 发， 1020 ； C.merge， 1020 0025 图 3 不同保存期的本发明灭蚊凝胶剂的实验室灭蚊数据 0026 图 4 不同保存期的本发明灭蚊凝胶剂模拟野外灭蚊数据 具体实施方式 0027 实施例 1 本发明灭蚊凝胶剂的制备 0028 a、 取。
15、 Pythium sp.GY1938 菌丝体 200g ； 0029 b、 取1/4KPYG2培养基 （组成 ： 蛋白胨0.375g， 酵母膏0.125g， 葡萄糖0.75g， 胆固醇 6.25mg， 氯化钙 27.5mg， 玉米油 2.5g， 加水至 1L） ， 加入海藻糖 10g， 调 pH 值至 7.010.0， 加 说 明 书 CN 103070200 A 4 3/5 页 5 入琼脂粉 1g， 溶化， 冷却至 60， 加入菌丝体， 匀浆搅拌， 得凝胶混悬液， 立即置于模具中， 凝固后切块定型， 4 8封装保存。 0030 实施例 2 本发明灭蚊凝胶剂的制备 0031 a、 取 Pyth。
16、ium sp.GY1938 菌丝体 300g ； 0032 b、 取 1/2KPYG2培养基 （组成 ： 蛋白胨 0.75g， 酵母膏 0.25g， 葡萄糖 1.5g， 胆固醇 12.5mg， 氯化钙 55mg， 玉米油 5g， 加水至 1L） ， 调 pH 值至 7.010.0， 加入琼脂粉 2g， 溶化， 冷 却至 40， 加入菌丝体， 匀浆搅拌， 得凝胶混悬液， 立即置于模具中， 凝固后切块定型， 4 8封装保存。 0033 实施例 3 本发明灭蚊凝胶剂的制备 0034 a、 取 Pythium sp.GY1938 菌丝体 150g ； 0035 b、 取 1/8KPYG2培养基 （组成。
17、 ： 蛋白胨 0.1875g， 酵母膏 0.0625g， 葡萄糖 0.375g， 胆固醇 3.125mg， 氯化钙 13.75mg， 玉米油 1.25g， 加水至 1L） ， 加入海藻糖 25g， 调 pH 值至 7.010.0， 加入琼脂粉 0.5g， 溶化， 冷却至 60， 加入菌丝体， 匀浆搅拌， 得凝胶混悬液， 立 即置于模具中， 凝固后切块定型， 4 8封装保存。 0036 实施例 4 本发明灭蚊凝胶剂的制备 0037 a、 取 Pythium sp.GY1938 菌丝体 150g ； 0038 b、 取 1/4 马铃薯培养基 （组成 ： 马铃薯 50g， 葡萄糖 5g， 加水至 1。
18、L） ， 加入赤藻糖醇 5g， 调 pH 值至 7.010.0， 加入明胶粉 0.5g， 溶化， 冷却至 60， 加入菌丝体， 匀浆搅拌， 得凝 胶混悬液， 立即置于模具中， 凝固后切块定型， 4 8封装保存。 0039 下面以实验例的方式说明本发明的有益效果 ： 0040 实验例 1 本发明灭蚊凝胶剂的制备及应用 0041 1、 材料、 试剂与仪器 0042 Pythium sp.GY1938 菌株， 贵阳医学院苏晓庆教授赠送， 常规保存， 定期转种。 0043 SFE 培养基 ： 将 100g 葵花籽粉碎， 浸泡于 1000ml ddH2O 中， 6 层纱布过滤， 再加 1000ml dd。
19、H2O 蒸馏水， 分装贮存于 -20， 临用时取出解冻， 用 ddH2O 稀释 1 倍， pH9.0。 0044 KPYG2常规传代培养基 ： 蛋白胨 1.5g/L， 酵母膏 0.5g/L， 葡萄糖 3.0g/L， 胆固醇 25mg/L， 氯化钙 110mg/L， 玉米油 10g/L， 余量为水， pH9.0。 0045 KPYG2标准固体培养基 ： 蛋白胨 1.5g/L， 酵母膏 0.5g/L， 葡萄糖 3.0g/L， 胆固醇 25mg/L， 氯化钙 110mg/L， 玉米油 10g/L， 4g/L 琼脂粉， 余量为水， pH9.0。 0046 1/2KPYG2固体培养基 ： 蛋白胨 0.7。
20、5g/L， 酵母膏 0.25g/L， 葡萄糖 1.5g/L， 胆固醇 12.5mg/L， 氯化钙 55mg/L， 玉米油 5g/L， 2g/L 琼脂粉， 余量为水， pH9.0。 0047 1/2KPYG2定型固体培养基 ： 蛋白胨 0.75g/L， 酵母膏 0.25g/L， 葡萄糖 1.5g/L， 胆固 醇 12.5mg/L， 氯化钙 55mg/L， 玉米油 5g/L， 琼脂粉 2g/L， 海藻糖 20g/L， 余量为水， pH9.0。 0048 1PBS 含 NaCl8.5g/L， Na2HPO412H2O3.5g/L， NaH2PO42H2O0.25g/L， pH7.6。 0049 Ca。
21、lcofluor White M2R（Sigma） 。 0050 供试蚊虫 ： 致倦库蚊 （Culex quinquefasciatu） 1 龄幼虫 （孑孓） ， 采自四川省成都 市新都镇稻田。 0051 MJPS-150 霉菌培养箱 （上海精宏） ； ZHWY-200B 恒温摇床 （上海智诚） ； SW-CJ-1F 超 净工作台 （苏州苏净） ， 激光共聚焦显微镜 Olympus FV1000。 说 明 书 CN 103070200 A 5 4/5 页 6 0052 2、 本发明灭蚊凝胶剂的制备 0053 （1） 菌种活化与传代 0054 无菌接种环挑取KPYG2斜面培养基上Pythium 。
22、sp.GY1938保种菌丝体， 接种于90mm SFE 固体培养基中央， 251倒置培养 7d， 观察菌丝形态 ； 无菌手术刀片切取培养皿周边 新鲜菌丝块 （1.01.0cm2） ， 倒置于 SFE 固体培养基中央， 251常规培养， 每 7d 传代一 次。 0055 （2） 菌丝体的收集 0056 从SFE固体培养基上切取20块 （0.50.5） cm2菌丝块， 于无菌条件下接种于100ml KPYG2常规液体培养基， 251、 110r/min 振荡培养 72h， 无菌纱布过滤， 1PBS 缓冲液冲 洗 2 次， 无菌刮勺收集菌丝体。 0057 （3） 凝胶剂的制备 0058 10ml1P。
23、BS 重悬菌丝体， 匀浆搅拌器中速搅拌 5 10min， 得到长度约为 0.5 1.0cm 的菌丝体碎片悬液 ； 加入 10ml1/2KPYG2定型固体培养基 （需预热溶化， 冷却至 60左 右） ， 适当匀浆搅拌， 即得 “菌丝体 1/4KPYG2凝胶” 混悬液， 立即将菌丝体凝胶液倒入模具 （长8.0cm， 宽5.0cm， 高1.0cm） ， 凝固彻底后切块定型 （1.51.51.0cm3） ， 即得到本发明灭 蚊凝胶剂， 无菌塑封， 4 8保存。 0059 3、 性质测定 0060 （1） 活力实验 0061 将本发明灭蚊凝胶剂置于 4 8保存， 每隔 2 周随机抽取制品 1 袋， 切取。
24、 1/2 块 凝胶， 倒置于 KPYG2常规固体培养基中央， 251， 培养 24h， 监测菌丝生长速度 ； 同时， 切 取菌丝块， 经 Calcofluor White M2R 染色， 将菌丝一侧倒置于载玻片， 通过共聚焦显微镜 （WU 激发， 365nm) 观察菌丝体状态， 连续观察 6 月。 0062 （2） 实验室灭蚊实验 0063 取 2 只容积为 200ml 的塑料杯， 各加注 100ml 脱氯水， 分别标记为实验组和对照 组 ； 实验组加入 2 块本发明灭蚊凝胶剂 （共 3 组， 凝胶剂保存时间依次为 0.5、 1.0、 1.5 月） ， 对照组加入 2 块 “1/4KPYG2凝。
25、胶块” ； 0064 再各自滴加 6 滴 4兔肝粉悬液和 25 只第一龄致倦库蚊幼虫， 室温喂养 （251， 湿度为 60 70， 明场 ： 暗场 =14h:10h） ， 每日观察 2 次， 连续观察 7d， 将死亡 幼虫挑出， 镜下观察确认系由真菌感染致死， 记录蚊蚴感染数量， 并统计蚊蚴感染率 （按 照 Shengwen H,Xiaoqing S.Biological studies on Pythium guiyangense,a fungal pathogen of mosquito larvaeJ.Mycosystema.2007,26(3):380-388. 所述方法统计） 。 0。
26、065 （3） 模拟野外灭蚊实验 0066 取 2 只容积为 200ml 的塑料杯， 各加注约 100ml 稻田水， 分别标记为实验组和对照 组 ； 实验组加入 2 块本发明灭蚊凝胶剂 （共 6 组， 凝胶剂保存时间依次为 0.5、 1.0、 1.5、 2.0、 2.5、 3.0 月） ， 对照组加入 2 块 “1/4KPYG2凝胶块” ； 加入 25 只致倦库蚊 1 龄幼虫， 置于自然 条件下 （夏季、 楼顶背阴处） ， 统计7d幼虫死亡率 （按照Shengwen H,Xiaoqing S.Biological studies on Pythium guiyangense,a fungal 。
27、pathogen of mosquito larvaeJ. Mycosystema.2007,26(3):380-388. 所述方法统计） 。 0067 4、 测定结果 说 明 书 CN 103070200 A 6 5/5 页 7 0068 （1） 菌丝体生长活力 0069 结果如图 12 所示， 4 8保存 6 月的凝胶剂， 菌丝生长活力强， 与保存 2 周的凝 胶剂无明显差异， 并且， 菌丝形态优良， 说明本发明灭蚊凝胶剂的稳定性强， 保质期长。 0070 2 实验室灭蚊效果 0071 实验结果如表 1 和图 3 所示 ： 0072 表 1 实验室灭蚊效果 0073 0074 由表 1 和。
28、图 3 可以看出， 本发明灭蚊凝胶剂投入水体后， 不会立即产生灭蚊效果， 投入水体 13 天后具有灭蚊效果， 随着时间延长， 灭蚊效果增强， 且持续时间长 ； 本发明灭 蚊凝胶剂放置1个月与放置3个月的实验室灭蚊效果无差异， 与放置半个月相比， 实验室灭 蚊效果稍低， 差异不显著， 说明本发明灭蚊凝胶的稳定性强， 保质期长。 0075 3 模拟野外灭蚊实验 0076 实验结果如表 2 和图 3 所示 ： 0077 表 2 模拟野外灭蚊效果 0078 0079 由表2和图3可以看出， 本发明灭蚊凝胶投入水体7d后， 蚊虫致死率为2328%， 灭 蚊效果优良 ； 放置 0.53 个月的灭蚊效果无显著差异， 说明本发明灭蚊凝胶的稳定性强， 保 质期长。 0080 综上， 本发明灭蚊凝胶剂的灭蚊效果优良， 且稳定性好， 可长期保存， 组成成分为 培养基， 可以被菌丝体分解吸收， 不会造成环境污染， 制备工艺简单， 成本低廉， 使用方便， 是一种新型环保水体灭蚊剂。 说 明 书 CN 103070200 A 7 1/2 页 8 图 1 图 2 图 3 说 明 书 附 图 CN 103070200 A 8 2/2 页 9 图 4 说 明 书 附 图 CN 103070200 A 9 。