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1、(10)申请公布号 CN 103283950 A (43)申请公布日 2013.09.11 CN 103283950 A *CN103283950A* (21)申请号 201310234406.1 (22)申请日 2013.06.14 A23K 1/00(2006.01) A23K 1/16(2006.01) C12N 1/20(2006.01) C12R 1/01(2006.01) (71)申请人 广州格拉姆生物科技有限公司 地址 510000 广东省广州市萝岗区云埔三路 19 号自编 3 栋 3 层 301 房 (72)发明人 李帅伟 李本涛 (54) 发明名称 一种乳酸片球菌活菌制剂及其。
2、制备方法 (57) 摘要 本发明涉及一种乳酸片球菌活菌制剂的生产 方法， 属于微生物技术领域， 具体涉及一种乳酸片 球菌活菌制剂的液体厌氧发酵生产方法。它包括 以下步骤 ： 采用乳酸片球菌作为发酵菌种， 接种 于经过优化的液体培养基中， 在温度为 3740 的条件下培养 1618h， 放罐并测定活菌数， 用植 物淀粉吸附发酵液并干燥、 粉碎和包装， 制成活性 稳定的乳酸片球菌制剂。本发明的优点 ： 用普通 发酵罐即可完成乳酸片球菌的高密度发酵， 操作 简单， 效果稳定， 能耗低 ； 不用离心机和冷冻干燥 机等设备， 降低了生产成本， 提高了生产效率， 易 于推广使用。 (51)Int.Cl. 。
3、权利要求书 2 页 说明书 3 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书2页 说明书3页 (10)申请公布号 CN 103283950 A CN 103283950 A *CN103283950A* 1/2 页 2 1. 一种乳酸片球菌活菌制剂的制备方法包括以下步骤 ： （1） 菌种活化 ： 本发明采用乳酸片球菌作为发酵菌种， 购于广东省微生物菌种保藏管理中心， 保藏编 号 ： GIM1.263， 将 -80保存的乳酸片球菌活菌菌种在 MRS 培养基 （蛋白胨 10.0 g， 牛肉膏 10.0 g， 酵母膏 5.0 g， 柠檬酸氢二铵 2.0 g， 葡萄糖 2。
4、0.0 g， 吐温 80 1.0 mL， 乙酸钠 5.0 g， 磷酸氢二钾 2.0 g， 硫酸镁 0.58 g， 硫酸锰 0.25 g， 琼脂粉 15.0 g， 蒸馏水 1 000 mL， pH 6.26.6， 高温高压灭菌） 固体斜面上划线， 37培养 16 个小时左右， 菌种活化一般 13 次 ； （2） 制备一级种子 ： 将活化的乳酸片球菌， 用接种环挑取一环接种于 20mL MRS 液体 （蛋白胨 10.0 g， 牛肉 膏 10.0 g， 酵母膏 5.0 g， 柠檬酸氢二铵 2.0 g， 葡萄糖 20.0 g， 吐温 80 1.0 mL， 乙酸钠 5.0 g， 磷酸氢二钾2.0 g， 。
5、硫酸镁0.58 g， 硫酸锰0.25 g， 蒸馏水1 000 mL， pH 6.26.6， 高温高 压灭菌） 的试管中， 37深层静置培养 16 小时左右， 菌液以 35% 的接种量接种到装有适当 体积 MRS 培养基的三角瓶中， 37深层静置培养 16 小时左右备用 ； 若培养基灭菌后未立即 使用， 则需在沸水浴中加热 10min 驱氧后使用 ； （3） 配制液体发酵培养基 ： 培养基包括的原料及重量份数为 ： 玉米粉 4070， 小麦粉 1530， 豆饼粉 015， 葡萄糖 1015， 酵母浸出粉13， 蛋白胨24， 原料当以克计， 蒸馏水相应以mL计的份数为8001000， 溶解， 加入。
6、发酵罐内进行 100121， 时间为 1030 分钟的高温高压灭菌， 在发酵罐降温至 3545时， 加入无机盐0.71.5g/1000mL基料， 无机盐选自CaCl2 、 MgSO47H2O及MnSO4 H2O 中的两种或者三种， 为避免形成沉淀， 在加入过程中搅拌均匀， 然后加入液体石蜡至厚度为 12cm ； （4） 液体发酵 ： 将经过灭菌处理的液体发酵培养基按照 35% 的接种量接入一级种子菌， 搅拌均匀， 然后加入液体石蜡至厚度为 12cm， 保持温度为 3740， pH 6.0-6.8， 培养 1618 个 小时放罐， 将乳酸片球菌活菌培养物进行菌落计数， 经过这样发酵的活菌体浓度可。
7、达 1.0109CFU/mL 以上 ； （5） 用植物淀粉吸附发酵液 ： 以玉米粉、 豆饼粉或小麦粉， 或者其任意组合， 作为发酵液 的吸附剂， 并将植物淀粉吸附的发酵液混合物进行烘干干燥， 粉碎和包装， 制成用于畜禽养 殖的微生态饲料添加剂。 2. 根据权利要求 1 所述的乳酸片球菌活菌制剂， 其特征在于所述的液体发酵培养 基为 ： 玉米粉 4070， 小麦粉 1530， 豆饼粉 015， 葡萄糖 1015， 酵母浸出粉 13， 蛋白 胨 24， 原料当以克计， 蒸馏水相应以 mL 计的份数为 8001000， 溶解， 加入发酵罐内进行 100121， 时间为 1030 分钟的高温高压灭菌，。
8、 在发酵罐降温至 3545时， 加入无机盐 0.71.5g/1000mL 基料， 无机盐选自 CaCl2 、 MgSO47H2O 及 MnSO4H2O 中的两种或者三种， 为避免形成沉淀， 在加入过程中搅拌均匀， 然后加入液体石蜡至厚度为 12cm。 3. 根据权利要求 1 所述的乳酸片球菌活菌制剂， 其特征在于 ： 培养温度为温度为 3740， pH 6.06.8。 4. 根据权利要求 1 所述的乳酸片球菌活菌制剂， 其特征在于 ： 各级种子菌接种量为 35% 的接种量。 权 利 要 求 书 CN 103283950 A 2 2/2 页 3 5. 根据权利要求 1 所述的乳酸片球菌活菌制剂，。
9、 其特征在于 ： 所用的菌种为片球菌属 的乳酸片球菌种。 6. 根据权利要求 1 所述的乳酸片球菌活菌制剂， 其特征在于 ： 作为饲料添加剂的应用 领域为畜禽饲料添加剂。 权 利 要 求 书 CN 103283950 A 3 1/3 页 4 一种乳酸片球菌活菌制剂及其制备方法 技术领域 0001 本发明涉及微生物发酵工程领域， 具体地说是一种液体培养基经乳酸片球菌厌氧 发酵制备益生菌饲料添加剂的方法。 背景技术 0002 乳酸片球菌 （Pediococcusacidilactici） 革兰氏阳性菌， 不运动， 兼性厌氧。细胞 圆球状， 在直角两个平面交替分裂形成四联状， 一般细胞成对生， 单生。
10、者罕见， 不成链状排 列。在 MRS 培养基上菌落小， 呈白色。沿洋菜穿刺线的生长物呈丝状。接触酶阴性， 不产细 胞色素。 0003 乳酸片球菌的生理特性有如下几点 ： 产酸， 调节胃肠道菌群， 维持肠道微生 态平衡。 在动物体内对病原微生物有拮抗作用， 可竞争性地抑制病原微生物， 增强动物机体 的免疫功能， 产生有益的代谢产物， 激活酸性蛋白酶的活性， 参与机体的新陈代谢， 防止有 害物质产生。 0004 乳酸片球菌是一种新型饲料添加剂， 其用途和分类与我国的微生态制剂相同， 属 于益生素的一种， 但比益生素又多具备保健剂之功能， 尤其对人及动物无毒无病原性， 对酸 有很强的抵抗力， 可顺利。
11、地通过胃， 并在肠道内迅速增殖， 调解肠道菌群， 分泌类杀菌因子， 刺激免疫系统提高免疫能力， 促进动物全群健康水平等方面， 是饲料业中的绿色添加剂。 0005 将乳酸片球菌经过高密度液体发酵， 获得高菌体密度的发酵培养液， 经植物淀粉 吸附后， 干燥， 粉碎， 制成的乳酸片球菌微生态制剂应用于畜牧养殖， 能够调节动物肠道菌 群平衡， 增强机体免疫力， 提高抗病能力。 0006 以往的乳酸片球菌的发酵方式主要存在以下问题和不足 ：（1） 采用厌氧培养罐或 通过持续通入二氧化碳或氮气维持其厌氧环境来进行， 原料不能重复使用， 操作较复杂， 成 本较高 ；（2） 液体发酵产物的后处理需要高速冷冻离。
12、心机进行离心和低温冷冻干燥， 工艺 复杂， 成本高昂， 产量低 ；（3） 发酵产物的活菌密度不够高。 发明内容 0007 本发明的目的是提供一种乳酸片球菌活菌制剂的制备方法， 以克服现有的乳酸片 球菌活菌制剂的制备方法上存在的上述不足。 0008 实现本发明目的的技术方案如下 ： 一种乳酸片球菌活菌制剂的制备方法， 包括以下步骤 ： （1） 配制培养基 ； （2） 溶解上罐的培养基， 装上 pH 电极并调整 pH 值， 然后将培养基装入发酵罐中 ； （3） 对发酵罐中的培养基加温灭菌 ； （4） 接种乳酸片球菌种子菌 ： 在发酵罐降温后加入无机盐溶液， 然后加入液体石蜡及接 入种子菌 ； （5。
13、） 控温发酵 ； 控制 pH 值和温度， 在保温的状态下发酵 ； 说 明 书 CN 103283950 A 4 2/3 页 5 （6） 放罐并测定发酵液菌数 ； （7） 用玉米粉、 小麦粉或者大豆粉及其组合物吸附发酵液， 将吸附后的混合物干燥和粉 碎， 制得稳定的乳酸片球菌活菌制剂。 0009 与现有技术相比， 本发明的技术优势 ： （1） 直接利用普通发酵罐即可进行生产， 操作简单， 质量稳定， 成本低廉， 易于产业化生 产 ； （2） 产品成本与发酵污染风险降低 ： 本发明由于生产周期缩短， 生产成本降低， 同时， 发 酵基料前期产酸较快、 pH 值下降迅速， 能较好抑制杂菌污染， 产品发。
14、酵失败风险大大降低 ； （3） 采用厌氧培养罐或通过持续通入二氧化碳或氮气维持其厌氧环境来进行， 原料不 能重复使用， 操作较复杂， 成本较高 ； 用于隔绝空气的液体石蜡可以多次反复使用， 大大降 低了生产成本 ； （4） 本发明采用经过优化的乳酸片球菌液体发酵培养基， 乳酸片球菌菌数含量明显提 高， 发酵产物活菌浓度可达 1.0109 CFU/mL 以上 ； （5） 本发明采用植物淀粉吸附发酵液， 后处理工艺不需要用高速冷冻离心机， 本发明将 植物淀粉吸附混合物直接干燥和粉碎， 包装后即制成产品， 后处理工艺大大简化， 生产成本 更低 ； （6） 国内外有关粉末发酵剂的研制， 大多采用真空冷。
15、冻干燥法， 此方法的优点是菌体细 胞存活率高， 但是工艺复杂， 制作成本高， 而吸附后干燥法的生产成本低， 操作工艺简单， 较 易用于大规模的工业化生产和推广应用， 适合于我国饲料企业在现有设备条件下生产乳酸 片球菌微生态制剂产品。 0010 具体实施方式 0011 实施例 1 制备乳酸片球菌活菌制剂的工艺流程， 包括以下步骤 ： （1） 菌种活化 ： 本发明采用乳酸片球菌作为发酵菌种， 购于广东省微生物菌种保藏管理中心， 保藏编 号 ： GIM1.263， 将 -80保存的乳酸片球菌活菌菌种在 MRS 培养基 （蛋白胨 10.0 g， 牛肉膏 10.0 g， 酵母膏 5.0 g， 柠檬酸氢二。
16、铵 2.0 g， 葡萄糖 20.0 g， 吐温 80 1.0 mL， 乙酸钠 5.0 g， 磷酸氢二钾 2.0 g， 硫酸镁 0.58 g， 硫酸锰 0.25 g， 琼脂粉 15.0 g， 蒸馏水 1 000 mL， pH 6.26.6， 高温高压灭菌） 固体斜面上划线， 37培养 16 个小时左右， 菌种活化一般 13 次 ； （2） 制备一级种子 ： 将活化的乳酸片球菌， 用接种环挑取一环接种于 20mL MRS 液体 （蛋白胨 10.0 g， 牛肉 膏 10.0 g， 酵母膏 5.0 g， 柠檬酸氢二铵 2.0 g， 葡萄糖 20.0 g， 吐温 80 1.0 mL， 乙酸钠 5.0 g。
17、， 磷酸氢二钾2.0 g， 硫酸镁0.58 g， 硫酸锰0.25 g， 蒸馏水1 000 mL， pH 6.26.6， 高温高 压灭菌） 的试管中， 37深层静置培养 16 小时左右， 菌液以 35% 的接种量接种到装有适当 体积 MRS 培养基的三角瓶中， 37深层静置培养 16 小时左右备用 ； 若培养基灭菌后未立即 使用， 则需在沸水浴中加热 10min 驱氧后使用 ； （3） 配制液体发酵培养基 ： 培养基包括的原料及重量份数为 ： 玉米粉 70， 小麦粉 20， 豆饼粉 10， 葡萄糖 15， 酵母浸 说 明 书 CN 103283950 A 5 3/3 页 6 出粉 2， 蛋白胨 。
18、4， 原料当以克计， 蒸馏水相应以 mL 计的份数为 8001000， 溶解， 加入发酵 罐内进行 121， 时间为 20 分钟的高温高压灭菌， 在发酵罐降温至 3545时， 加入无机盐 1.2g/1000mL 基料 , 无机盐 ： CaCl2 0.02%， MgSO47H2O 0.04%， MnSO4H2O 0.04%， ， 为避免 形成沉淀， 在加入过程中搅拌均匀， 然后加入液体石蜡至厚度为 2cm ； （4） 液体发酵 ： 将经过灭菌处理的液体发酵培养基按照 5% 的接种量接入一级种子菌， 搅拌均匀， 然后 加入液体石蜡至厚度为2cm， 保持温度为3740， pH 6.0-6.8， 培养。
19、20个小时放罐， 将乳酸 片球菌活菌培养物进行菌落计数， 经过这样发酵的活菌体浓度达到 1.9109CFU/mL ； （5） 用植物淀粉吸附发酵液 ： 以质量比为 7:2:1 的玉米粉、 小麦粉豆饼粉作为发酵液 的吸附剂， 并将植物淀粉吸附的发酵液混合物进行干燥， 65下加温处理 60min 左右， 经过 干燥、 粉碎和包装， 制成用于畜禽养殖的微生态饲料添加剂。 0012 实施例 2 与上述实施例 1 不同的是 ： （1） 培养基配方 ： 玉米粉 60， 小麦粉 30， 豆饼粉 10， 葡萄糖 10， 酵母浸出粉 1.5， 蛋白 胨 3.0， 原料当以克计， 蒸馏水相应以 mL 计的份数为 。
20、8001000， 溶解经 100、 30min 高 温高压灭菌， 在发酵罐降温至 3545时， 加入无机盐 1.2g/1000mL 基料， 无机盐的组成 ： MgSO47H2O 0.04%， MnSO4H2O 0.04%， 为避免形成沉淀， 在加入过程中搅拌均匀， 然后加入 液体石蜡厚度为 1cm 左右 ； （2） 控温发酵 ： 接入乳酸片球菌液体种子的接种量为 3%， 搅拌均匀， 起始 pH 6.6， 控制 pH 6.06.8， 发酵温度控制在 3740， 发酵 18 个小时， 放罐， 将乳酸片球菌培养物进行菌 落计数， 经过这样发酵的活菌体浓度为 1.5109CFU/mL ； （3） 用植物淀粉吸附发酵液 ： 以等质量的玉米粉和小麦粉混合均匀， 作为发酵液的吸附 剂， 将吸附的混合物经过干燥、 粉碎和包装， 制成用于畜禽养殖的微生态饲料添加剂。 说 明 书 CN 103283950 A 6 。