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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201610236735.3 (22)申请日 2016.04.14 (83)生物保藏信息 CCTCC NO: M 2016097 2016.03.09 (71)申请人 青岛易邦生物工程有限公司 地址 266114 山东省青岛市红岛经济区红 岛街道泉大路东大洋社区岙东南路21 号 (72)发明人 刘新文 孙健 邹敏 程增青 徐保娟 郭玉广 (74)专利代理机构 北京科亿知识产权代理事务 所(普通合伙) 11350 代理人 汤东凤 (51)Int.Cl. A61K 39/155(20。
2、06.01) A61P 31/14(2006.01) (54)发明名称 一种B型禽偏肺病毒亚单位疫苗 (57)摘要 本发明提供一种B型禽偏肺病毒亚单位疫 苗， 包括抗原和疫苗佐剂， 所用的抗原为灭活的B 型禽偏肺病毒F蛋白， 其中B型禽偏肺病毒F蛋白 的氨基酸序列为SEQ ID NO:1。 本发明将表达B型 禽偏肺病毒F蛋白的基因工程毕赤酵母菌X33-F， 接种培养基， 在甲醇的作用下， B型禽偏肺病毒F 蛋白获得高效表达， 经提取纯化， 加入甲醛溶液 灭活后， 加油佐剂混合乳化制成疫苗。 本发明制 备的疫苗能提高免疫后的抗体水平， 提高免疫后 抗体的整齐度， 保证了疫苗的免疫效果， 此疫苗 。
3、具有高效、 安全性好的优点。 权利要求书1页 说明书5页 序列表5页 附图3页 CN 105770884 A 2016.07.20 CN 105770884 A 1.一种B型禽偏肺病毒亚单位疫苗， 其特征在于， 所述的亚单位疫苗包含有抗原和疫苗 佐剂， 其中抗原为灭活的B型禽偏肺病毒F蛋白。 2.如权利要求1所述的疫苗， 其特征在于， 所述的B型禽偏肺病毒F蛋白， 包含有： 1)氨基酸序列为SEQ ID NO:1的蛋白， 2)在1)的蛋白上取代、 缺失、 添加一个或几个氨基酸， 且具有1)中蛋白功能的蛋白。 3.如权利要求2所述的疫苗， 其特征在于， 编码B型禽偏肺病毒F蛋白的基因， 其核苷酸。
4、 序列为SEQ ID NO:2。 4.如权利要求1或2所述的疫苗， 其特征在于， 所述的B型禽偏肺病毒F蛋白的表达菌株 为毕赤酵母表达菌株X33-F， 保藏编号为CCTCC M 2016097。 5.如权利要求1所述的疫苗， 其特征在于， 所述的B型禽偏肺病毒F蛋白经过甲醛溶液灭 活。 6.如权利要求1所述的疫苗， 其特征在于， 所述的B型禽偏肺病毒F蛋白的含量不低于50 g/0.3ml。 权 利 要 求 书 1/1 页 2 CN 105770884 A 2 一种B型禽偏肺病毒亚单位疫苗 技术领域 0001 本发明属于生物兽药技术领域， 具体涉及一种B型禽偏肺病毒亚单位疫苗。 背景技术 000。
5、2 禽偏肺病毒属于副黏病毒肺病毒属， 基因组为不分节段的单股负链RNA， 可引起火 鸡发生呼吸道疾病， 称为火鸡鼻气管炎； 感染鸡后引起病毒性气囊炎， 鼻气管炎和肿头综合 征,产蛋下降。 20世纪70年代末， 禽偏肺病毒引起的疾病首次在南非报道， 随后在北美、 南 美、 中东、 远东都有发生。 1989年美国首次分离到此病毒。 在分离此病毒的同时， 往往可分离 到波氏杆菌、 巴氏杆菌、 假单胞杆菌、 鼻气管炎鸟疫杆菌、 粪产碱杆菌等。 禽偏肺病毒能使气 管纤毛的活动受到抑制， 气管中的灰尘向外排出困难， 灰尘中所带的大量细菌很容易发生 继发感染， 侵害呼吸道。 病原禽偏肺病毒可分为三个型： A。
6、型感染火鸡， B型感染肉鸡， C型只 在美国存在， A和B两型有交叉保护作用， 与C型无交叉保护作用。 随着我国禽业养殖规模的 不断扩大， 因禽偏肺病毒感染导致的继发感染也日益严重， 对养禽业的危害非常严重， 唯一 有效办法是通过接种疫苗来预防鸡群的发病。 目前国内外对禽偏肺病毒疫苗的研究大多集 中在灭活疫苗的研制。 0003 完整的病原体含有许多抗原， 但并非所有抗原都能刺激宿主产生保护性应答。 其 中某些抗原还能引起过敏， 免疫抑制和其他副作用， 这是使用完整的病原体做疫苗的缺陷。 并且目前国内应用的灭活苗生产制备抗原过程繁琐， 而弱毒疫苗现也有接种疫苗发病情况 存在。 而用亚单位疫苗则可。
7、以解决这个问题， 尤其是这种疫苗除了具有抗原稳定性高， 纯度 高， 特异性强， 敏感性高， 不产生其他不相关抗体， 免疫效果检测方法方便准确外， 还十分易 于生产。 不用动物体或是胚体生产， 不会带有组织残留物。 而且不需灭活， 但安全性高。 发明内容 0004 本发明的目的是提供一种B型禽偏肺病毒亚单位疫苗， 所提供的疫苗具有高效、 安 全性好、 抗体整齐度高、 保护率高的优点， 从而弥补现有技术的不足。 0005 本发明的B型禽偏肺病毒亚单位疫苗， 包括抗原和疫苗佐剂， 所用的抗原为灭活的 B型禽偏肺病毒F蛋白， 0006 B型禽偏肺病毒F蛋白， 包含有： 0007 1)氨基酸序列为SEQ。
8、 ID NO:1的蛋白， 0008 2)在1)的蛋白上取代、 缺失、 添加一个或几个氨基酸， 且具有1)中蛋 白功能的蛋 白； 0009 编码上述F蛋白的基因， 其核苷酸序列为SEQ ID NO:2； 0010 其中生产B型禽偏肺病毒融合蛋白的巴斯德毕赤酵母X33-F(Pichia pastoris X33-F)， 已于2016年3月9日保藏于武汉大学的中国典型培养物保藏中心， 保藏编号为CCTCC NO:M 2016097。 0011 其中的B型禽偏肺病毒融合蛋白经过甲醛溶液灭活； 说 明 书 1/5 页 3 CN 105770884 A 3 0012 上述的疫苗中B型禽偏肺病毒F蛋白的含量。
9、不低于50 g/0.3ml。 0013 本发明将表达B型禽偏肺病毒F蛋白的基因工程毕赤酵母菌X33-F， 接种培养基， 在 甲醇的作用下， B型禽偏肺病毒F蛋白获得高效表达， 经提取纯化， 加入甲醛溶液灭活后， 加 油佐剂混合乳化制成疫苗。 本发明制备的疫苗能提高免疫后的抗体水平， 提高免疫后抗体 的整齐度， 保证了疫苗的免疫效果， 此疫苗具有高效、 安全性好的优点。 附图说明 0014 图1： 本发明实施例1的F基因PCR扩增鉴定图； 0015 图2： 本发明F基因的核苷酸序列比对图； 0016 图3： 本发明F蛋白的氨基酸序列比对图； 0017 图4： 本发明实施例高效表达载体的酶切鉴定图。
10、； 0018 图5： 本发明实施例重组菌株X33-F的PCR鉴定图； 0019 图6： 本发明实施例重组菌发酵诱导表达产物的SDS-PAGE电泳检定图。 具体实施方式 0020 下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细的说明。 0021 实施例1： F蛋白的扩增及序列分析 0022 2010年在山东省多个种鸡场出现了肿头综合症的症状， 而发病鸡群之前已经注射 了已有的禽肺病毒疫苗， 推测感染的病毒发生了变异； 因此从发病个体中进行禽肺病毒的 筛选。 最终筛选出了一株禽肺病毒SHS/A3。 0023 为验证筛选的病毒的抗原性， 使用了包含筛选毒株SHS/A3在内的5个不同来源的 病毒株作为抗原制。
11、备疫苗， 免疫SPF鸡后用SHS/A3株病毒液进行攻毒实验， 结果表明相比于 其它禽肺病毒疫苗； 其本身制备的疫苗具有更好的免疫效果(p0.05)； 因此确定其发生了 遗传上的变异。 0024 1、 扩增B型禽偏肺病毒SHS/A3株(APV)F基因 0025 根据NCBI中发表的F基因序列， 设计并合成了引物,引物的序列信息如下： 0026 primer1： 5 -GGGATGTACCTCAAACTGCTACTAAT-3 ； 0027 primer2:5 -TCAACTGATGTAGCCCATGTTGC-3 。 0028 2、 PCR扩增F基因克隆与序列测定 0029 提取SHS/A3株的核酸。
12、作为模板， 用引物primer1和primer2进行PCR扩增目的片段， 经序列测定(图1为B型禽偏肺病毒F蛋白基因PCR的扩增鉴定图)， 结果核苷酸序列为SEQ ID NO:2； 其编码的氨基酸序列为SEQ ID NO:1。 与NCBI中已公布的B型禽偏肺病毒的F基因进行 核苷酸序列比对分析， 结果同源性在95.199.2(图2为SHS/A3株F基因的核苷酸序列 比对图)； 推导的氨基酸序列同源性为95.097.4(图3为SHS/A3株F蛋白的氨基酸序列 比对图)。 结果表明， 分离的SHS/A3株为新的B型禽偏肺病毒， 含有新的F基因。 0030 3、 设计并合成B型禽偏肺病毒(APV)F。
13、基因 0031 根据SHS/A3株F基因的序列测定结果， 设计合成一对引物,引物的序列信息如下： 0032 primer3： 5 -gggggtaccATGTACTTGAAGTTGCAATTG-3 ； 0033 primer4:5 -gcggccgcTCAACTGATGTAACCCATGT-3 。 说 明 书 2/5 页 4 CN 105770884 A 4 0034 以合成的核苷酸序列为SEQ ID NO:2的F基因为模板， 用引物primer3和primer4进 行PCR扩增， 目的片段产物回收连接pMD18-T载体， 转化和筛选阳性克隆pMD18-T-F。 0035 实施例2： F蛋白的。
14、重组表达 0036 1.重组B型禽偏肺病毒F蛋白的制备方法 0037 包括以下步骤： a.构建表达载体； b.构建表达菌株； c.重组F蛋白的诱导和提取纯 化。 0038 a.构建表达载体： 0039 将阳性克隆质粒pMD18-T-F和表达载体pPICZ 载体分别用KpnI和NotI双酶切产物 经1.2琼脂糖凝胶电泳后,用DNA凝胶回收试剂盒回收,分别获得约1.6kb和3.3kb片段,在 16定向连接构建pPICZ -F表达载体(图4是本发明实施例高效表达载体的酶切鉴定图)； 测序验证序列和读码框无误后,将质粒线性化后， 电转化入毕赤酵母感受态细胞。 0040 b.构建表达菌株： 0041 电。
15、转化后， F基因重组到毕赤酵母基因组中， 构建毕赤酵母表达菌株X33-F(已于 2016年3月6日保藏于中国典型培养物保藏中心， 保藏编号为CCTCC M2016097； 图5)； 0042 c.重组F蛋白的诱导和提取纯化： 0043 诱导表达， 挑取含X33-F的单克隆菌落接种于BMGY液体培养基,30振荡培养过 夜， 离心收集菌体， 用适量的BMMY悬浮后， 加入终浓度0.5甲醇， 30诱导96小时。 4, 9000rpm离心5min， 保留上清液， 加入30的硫酸铵沉淀后， 12000rpm离心5min收集蛋白沉 淀， 用PBS重溶蛋白。 加入蛋白电泳上样缓冲液， 沸水煮8分钟后， 用1。
16、2的分离胶进行SDS- PAGE鉴定。 (图6中1、 2、 3为F蛋白表达产物沉淀， M为分子量标准蛋白质。 ) 0044 实施例3： 亚单位疫苗的制备 0045 一、 亚单位疫苗制备 0046 1.制苗用菌液的制备 将X33-F菌种接种于含博莱霉素的YPD液体培养基中， 30 振荡培养1618小时。 然后划线接种于加有博莱霉素的YPD固体培养基， 选取典型菌落23 个混合于少量YPD液体培养基中， 置30摇床中振荡培养18小时， 定量分装， 经纯粹检验后， 作为一级种子。 取一级种子接种于BMGY液体培养基中， 30振荡培养1618小时， 经镜检 后， 置28保存 0047 2.制苗用蛋白的。
17、制备按发酵罐容积60(V/V)加入BMGY不完全液体培养基， 同时 按培养基0.1(V/V)加入消泡剂， 通入高温蒸汽灭菌30分钟， 待培养基温度降至32， 加入 YNB和生物素， 接种B型禽偏肺病毒F蛋白生产用二级种子液， 发酵罐参数设置分别为搅拌速 度800r/min， 温度30， 维持DO值(溶氧量)在20。 培养24小时后的菌液补加甲醇,甲醇的 补加速度为2ml/h/L诱导表达培养， 按照以上发酵控制参数及工艺诱导表达120小时； 发酵 培养菌液经管式离心机10000r/min离心30分钟， 收获的上清， 加入硫酸铵沉淀蛋白后， 按 12000r/min离心30分钟收获沉淀， 加入适量。
18、的生理盐水溶解蛋白沉淀。 0048 3.灭活 将蛋白液置于灭活瓶内， 计量加入10甲醛溶液， 随加随摇， 使其充分混 合， 甲醛溶液的最终浓度为0.1。 加甲醛溶液后倒入另一灭活瓶中， 以避免瓶口附近粘附 的病毒未能接触灭活剂。 37灭活16小时后取出， 置28保存。 0049 4.半成品检验 0050 (1)无菌检验 按现行 中国兽药典 附录进行无菌检验。 说 明 书 3/5 页 5 CN 105770884 A 5 0051 (2)蛋白含量测定 按Bradford法检测蛋白含量。 0052 (3)灭活检验 将灭活后的蛋白液取少量接种YPD固体培养基， 置于置30继续培 养72小时。 观察无。
19、菌落生长， 判灭活检验合格。 0053 5.亚单位疫苗成品制备 0054 经过检验合格后的半成品蛋白抗原进行疫苗制备(以下配制中各液体成分按体积 比计)。 0055 (1)油相制备 取兽用白油95份， 硬脂酸铝1份， 置于油相制备罐中加热至80后， 再加司本80 5份， 至温度达到115时， 维持30min， 冷却后备用。 0056 (2)水相制备 将B型禽偏肺病毒F蛋白使用生理盐水稀释成150 g/0.1ml。 取灭菌 后的5份吐温-80， 加入配液罐中， 同时加入制苗用蛋白液95份， 搅拌2030min， 使吐温-80 完全溶解。 0057 (3)乳化 取油相2份放于高速剪切机内， 开动电。
20、机慢速转动搅拌， 同时徐徐加入水 相1份， 以10000r/min， 乳化5分钟。 乳化后， 取10ml， 以3000r/min离心15分钟， 管底析出的水 相应不超过0.5ml。 0058 二、 亚单位疫苗成品检验 0059 (1)性状 0060 外观 疫苗应为乳白色乳剂， 无杂质并且外包装应合格。 0061 剂型 为油包水型。 取一清洁吸管， 吸取少量疫苗滴入冷水中， 除第1滴外， 均应不 扩散。 0062 稳定性 吸取疫苗10ml加入离心管中， 以3000r/min离心15分钟， 管底析出的水相 应不超过0.5ml。 0063 黏度 按现行 中国兽药典 附录进行， 应符合规定。 0064。
21、 (2)装量检查 按现行 中国兽药典 附录进行， 应符合规定。 0065 (3)无菌检验 按现行 中国兽药典 附录进行， 应符合规定。 0066 (4)安全检验 用7日龄SPF鸡10只， 每只颈部皮下注射亚单位疫苗1.0ml， 同时设对 照5只， 在相同的条件下饲养， 连续观察14日， 记录试验鸡采食、 饮水及临床情况。 应不出现 由疫苗引起的任何局部和全身不良反应。 0067 (5)效力检验 21日龄SPF鸡10只， 每只颈部皮下注射亚单位疫苗， 0.3ml/只， 另取 10只同日龄SPF鸡作为不免疫作对照。 于免疫后28日， 点眼攻毒SHS/A3株病毒液， 0.1ml/只， 病毒含量为10。
22、6.5TCID50/0.1ml。 攻毒后连续观察7天， 于攻毒后第5天采集鼻拭子、 分离病毒。 结果表明， 用B型禽偏肺病毒F蛋白亚单位疫苗免疫鸡群能够抵抗病毒的攻击， 不出现临床 症状， 病毒分离均为阴性。 对照组出现临床症状， 9/10病毒分离阳性。 本发明制备的F蛋白亚 单位疫苗具有良好的免疫效果(p0.05)， 可以保护免疫鸡抵抗B型禽偏 肺病毒的攻击。 0068 (6)同类产品对比试验 用上述亚单位疫苗、 某进口同类产品， 分别按上述方法免 疫SPF鸡， 进行效力对比试验。 用禽肺病毒病ELISA试剂盒测定抗体， 从抗体值来看， 对照鸡 均为阴性， 亚单位苗免疫鸡均 2000， 同类。
23、产品免疫鸡6/10 2000， 亚单位苗明显高于进口 同类产品。 按上面的方法使用SHS/A3株病毒攻毒， 从攻毒保护结果上看， 本发明制备的亚单 位疫苗攻毒后有90保护， 而同类产品的保护率为60。 由以上结果来看亚单位疫苗优于 同类产品(参见表1)， 发病率远低于其市售疫苗(p0.05)。 说 明 书 4/5 页 6 CN 105770884 A 6 0069 表1： 与同类产品效力对比试验 0070 说 明 书 5/5 页 7 CN 105770884 A 7 0001 序 列 表 1/5 页 8 CN 105770884 A 8 0002 序 列 表 2/5 页 9 CN 105770884 A 9 0003 序 列 表 3/5 页 10 CN 105770884 A 10 0004 序 列 表 4/5 页 11 CN 105770884 A 11 0005 序 列 表 5/5 页 12 CN 105770884 A 12 图1 图2 说 明 书 附 图 1/3 页 13 CN 105770884 A 13 图3 图4 图5 说 明 书 附 图 2/3 页 14 CN 105770884 A 14 图6 说 明 书 附 图 3/3 页 15 CN 105770884 A 15 。