本发明涉及一种用于预防或治疗骨关节炎用途的组合物，其包含姜黄色素(curcuminoid)与绿茶多酚，或与甘氨酸、脯氨酸和羟脯氨酸的组合。本发明还涉及一种在哺乳动物中预防或治疗骨关节炎的方法，所述方法包括对所述哺乳动物给药一种组合物，所述组合物包含姜黄色素与绿茶多酚，或与甘氨酸、脯氨酸和羟脯氨酸的组合。
软骨退化可由几种原因引起，如反复运动、关节的不稳定性等，其可能导致关节的炎症。虽然较大部分患有关节炎的人类具有类风湿性关节炎，但是发生在伴侣动物中的大部分关节炎是骨关节炎。
现今，对骨关节炎的治愈并不存在，并且药物治疗限于减轻症状。最常用的是非甾体抗炎药，但是这些药物与不良反应相关。较安全的治疗是所期望的。
本发明的第一方面涉及一种用于预防或治疗骨关节炎用途的组合物，其包含姜黄色素与绿茶多酚，或与甘氨酸、脯氨酸和羟脯氨酸的组合。治疗骨关节炎包括减轻骨关节炎的症状。
本发明对于所有方面涉及任何哺乳动物，包括人类。具体而言，本发明涉及患有或易于患有骨关节炎的伴侣动物，如犬、猫或马科动物(例如马)或任何其它这种动物。
本发明的组合物包含姜黄色素。姜黄色素(curcuminoid)是姜黄素(curcumin)或姜黄素的衍生物。多种姜黄色素的化学结构在它们官能团上存在不同。
姜黄色素包括姜黄素、去甲氧基姜黄素(demethoxycurcumin)、双去甲氧基姜黄素(bis-methoxycurcumin)和/或四氢姜黄素(tetrahydrocurcumin)。
姜黄色素是天然酚类，其特别存在于印度香料姜黄(turmeric)中。姜黄来源于植物姜黄(Curcumalonga)的根。姜黄色素还存在于姜科(Zingiberaceae)姜黄属(Curcumagenus)植物的其它种的根中。姜黄色素明显具有土味、苦味、辛辣味和芥末的气味。
具体而言，姜黄含有60-80％姜黄素、15-30％去甲氧基姜黄素和2-6％双去甲氧基姜黄素。
本发明的组合物中的姜黄色素可以是任何形式的，包括粉末或脂质提取物。
在一些实施方案中，姜黄色素可以与磷脂和/或纤维素、淀粉或其衍生物混合，以形成复合物。这可以有助于稳定性和/或进一步增加姜黄色素的溶解性和生物利用度。
姜黄色素可以与精油(essentialoils)、胡椒碱或菠萝蛋白酶混合。姜黄色素可以与磷脂酰胆碱例如卵磷脂混合。
优选地，本发明的姜黄色素是姜黄素，其是最具活性的姜黄色素。根据本发明的姜黄素包括去甲氧基姜黄素、双去甲氧基姜黄素和/或四氢姜黄素。
本发明的组合物包含姜黄色素和绿茶多酚。
茶(茶树(Camelliasinensis))，特别是绿茶，具有高含量的类黄酮，包括多酚，特别是儿茶精类(catechins)。茶中的儿茶精类包括表没食子酸儿茶素-3-没食子酸酯(epigallocatechin-3-gallate，EGCG)、表儿茶素(epicatechin，EC)、表儿茶素-3-没食子酸酯(epicatechin-3-gallate，ECG)、表没食子酸儿茶素(epigallocatechin，EGC)、儿茶素和没食子儿茶素(gallocatechin，GC)。
优选地，绿茶多酚包括儿茶素。优选地，儿茶素包括EGCG。绿茶提取物通常含有至少约25％多酚、约12.5％儿茶精类和约9.3％EGCG。
表没食子酸儿茶素没食子酸酯(epigallocatechingallate，EGCG)是表没食子酸儿茶素和没食子酸的酯。EGCG是茶中最丰富的儿茶素并且是强抗氧化剂。其特别存在于绿茶中。EGCG是主要的绿茶多酚并显示抗氧化、抗肿瘤和抗诱变活性。
本发明的组合物包含姜黄素以及甘氨酸、脯氨酸和羟脯氨酸的组合。
甘氨酸、脯氨酸和羟脯氨酸的组合占水解胶原的总氨基酸含量的50％。优选地，甘氨酸、脯氨酸和羟脯氨酸的组合是水解胶原。水解胶原的氨基酸组成列于下表中：
表1
氨基酸 百分比 脯氨酸/羟脯氨酸 25％ 甘氨酸 20％ 谷氨酸 11％ 精氨酸 8％ 丙氨酸 8％ 其它必需氨基酸 16％ 其它非必需氨基酸 12％
水解胶原是通过存在于动物如牛、鱼、马、猪和兔的骨、皮(skin)和结蹄组织中的胶原组织的酶法水解获得。水解胶原是好消化的，并优先积累在软骨中。
优选的组合物包括姜黄色素、绿茶多酚以及甘氨酸、脯氨酸和羟脯氨酸的组合。优选地，该组合物包括姜黄素、绿茶多酚和水解胶原。
本发明优选地是食料。其可以是任何食料，如干食品、半潮湿食品或湿食品。特别是，所述食料可以是宠物食品。
宠物食料优选地是商品化的宠物食品。这种产品优选作为用于喂给宠物动物特别是宠物猫或宠物犬的产品而售卖。
典型的宠物食料含有约20-30％粗蛋白和约10-20％脂肪，余量为碳水化合物，包括膳食纤维和灰分。典型的湿或潮湿产品包含(以干物质为基础)：约40％脂肪、50％蛋白质和余量的纤维和灰分。本发明的食料可以是干产品(具有约5％至约15％水分)、半潮湿产品(具有约15％至约70％水分)或湿产品(具有约70％至约90％水分)。
食料的剩余组分对本发明不是必需的，并且典型的标准产品可以被包括在内。根据本发明的食料的组合成分可提供针对所讨论的特定动物的所有建议的维生素和矿物质(完全且均衡的食物)。
根据本发明的食料包括宠物在其饮食中消耗的任何产品。因此，本发明涵盖了标准食品，包括液体，以及宠物食物点心(snacks)(例如，点心棒(snackbar)、宠物咀嚼物、松脆零食、谷物棒(cerealbar)、点心(snacks)、饼干和甜味产品)和补充剂。
食料可以作为食物补充剂提供。食物补充剂可以是可与其它食料或不与其它食料一同给予的粉末、调味汁、顶料(topping)、饼干、粗粒物(kibble)、囊(pocket)或小块(tablet)。当食物补充剂与其它食料一同给予时，食物补充剂可以顺序地同时或分开给予。食物补充剂可以与食料混合、撒在食料上或分开食用。或者，可将食物补充剂加入为饮用而提供的液体如水或奶中。
食料优选地是熟食(cookedfood)。其可以包括肉或动物来源的材料(如牛肉、鸡肉、火鸡肉、羔羊肉、鱼肉、血浆、髓性骨(marrowbone)等，或它们的一种或多种)。该产品或者可以是不含肉的(优选地包括肉替代物，如大豆、玉米麸质或大豆制品)，以便提供蛋白质源。食料可以含有其它蛋白质源，如大豆蛋白浓缩物、奶蛋白、麸质等。食料还可以含有淀粉源，如一种或多种谷物(例如小麦、玉米、大米、燕麦、大麦等)，或者可以是无淀粉的。
本发明的食料优选地生产成含有约5％至约15％水分的干产品。优选的干食物更优选地以小饼干-样粗粒物出现。
下表具体描述了根据本发明的组合物的量和根据本发明的为犬食用的组合物的量：
表2
在本发明的第一方面中的组合物可以包含姜黄色素，按食物的“现状(asis)”重量百分比以姜黄色素的重量计，其量的范围为约0.005％至1.1％。姜黄色素的量可以是0.005％至1.1％(现状)的任意量。姜黄色素的量可以是0.1％至1％(现状)的任意量。姜黄色素的量可以是0.1％至0.6％(现状)的任意量。姜黄色素的量可以是0.3％至0.6％(现状)的任意量。
在本发明的第一方面中的组合物可以包含姜黄色素，按食物的“现状”重量百分比以姜黄色素的重量计，其量的范围为约0.005％至0.15％。姜黄色素的量可以是0.005％至0.15％(现状)(7至99mg/400kcal)的任意量。
当食物是干的时，“现状”重量与“干物质重量”相同。
优选地，姜黄色素在组合物中的量的范围是约0.01％至0.07％(现状)(14至46mg/400kcal)。更优选地，姜黄色素的量是0.035％(现状)(36mg/400kcal)。
在一些实施方案中，组合物中的姜黄色素是姜黄素，姜黄素的量按食物的“现状”重量百分比以姜黄素的重量计范围为约0.005％至0.15％。姜黄素的量可以是0.005％至0.15％(现状)(7至99mg/400kcal)的任意量。优选地，姜黄素的量的范围是约0.01％至0.05％(现状)(14至32mg/400kcal)。最优选地，姜黄素的量是0.026％(现状)(27mg/400kcal)。
在本发明的第一方面中的组合物可以包含绿茶多酚，按食物的“现状”重量百分比以绿茶多酚的重量计，其量的范围为约0.01％至1.1％。绿茶多酚的量可以是0.01％至1.1％(现状)的任意量。绿茶多酚的量可以是0.1％至1％(现状)的任意量。绿茶多酚的量可以是0.1％至0.6％(现状)的任意量。绿茶多酚的量可以是0.3％至0.6％(现状)的任意量。
在本发明的第一方面中的组合物可以包含绿茶多酚，按食物的“现状”重量百分比以绿茶多酚的重量计，其量的范围为约0.01％至0.3％。绿茶多酚的量可以是0.01％至0.3％(现状)(14至197mg/400kcal)的任意量。优选地，绿茶多酚的量的范围是约0.03％至0.17％(现状)(43至113mg/400kcal)。最优选地，绿茶多酚的量是0.085％(现状)(87mg/400kcal)。
在一些实施方案中，绿茶多酚是EGCG，EGCG的量按食物的“现状”重量百分比以EGCG的重量计范围为约0.005％至0.2％。EGCG的量可以是0.01％至0.06％(现状)(14至39mg/400kcal)的任意量。最优选地，EGCG的量是0.032％(现状)(33mg/400kcal)。
在本发明的第一方面中的组合物可以包含甘氨酸、脯氨酸和羟脯氨酸的组合，按食物的“现状”重量百分比以组合的甘氨酸、脯氨酸和羟脯氨酸的重量计，其量的范围为约0.5％至10％。组合的甘氨酸、脯氨酸和羟脯氨酸的量可以是0.5％至10％(现状)(720至6591mg/400kcal)的任意量。优选地，组合的甘氨酸、脯氨酸和羟脯氨酸的量的范围是约1.2％至5％(现状)(1736至3295mg/400kcal)。最优选地，组合的甘氨酸、脯氨酸和羟脯氨酸的量是2.7％(现状)(2780mg/400kcal)。
在一些实施方案中，甘氨酸、脯氨酸和羟脯氨酸的组合是水解胶原，按食物的“现状”重量百分比以组合的甘氨酸、脯氨酸和羟脯氨酸的重量计，其量的范围是约0.5％至5％。水解胶原的量可以是0.5％至5％(现状)(720至3295mg/400kcal)的任意量。优选地，水解胶原的量的范围是约0.7％至3.2％(现状)(1016至2138mg/400kcal)。最优选地，水解胶原的量是1.7％(现状)(1750mg/400kcal)。
在其它实施方案中，组合物可包含约27mg/400kcal(35mg/400kcal的姜黄色素)的姜黄素和约87mg/400kcal的绿茶多酚以及约2757mg/400kcal的组合的甘氨酸、脯氨酸和羟脯氨酸，其中，甘氨酸、脯氨酸和羟脯氨酸的组合是水解胶原。优选地，其中甘氨酸、脯氨酸和羟脯氨酸的组合是水解胶原，且在组合物中存在的量为约1747mg/400kcal。
在其它实施方案中，组合物可包含约33mg/400kcal的姜黄素(43mg/400kcal的姜黄色素)和约106mg/400kcal的绿茶多酚以及约3295mg/400kcal的组合的甘氨酸、脯氨酸和羟脯氨酸，其中，甘氨酸、脯氨酸和羟脯氨酸的组合是水解胶原。优选地，其中甘氨酸、脯氨酸和羟脯氨酸的组合是水解胶原，且在组合物中存在的量为约2108mg/400kcal。
在其它实施方案中，组合物可包含约15mg/400kcal的姜黄素(22mg/400kcal的姜黄色素)和约51mg/400kcal的绿茶多酚以及约1736mg/400kcal的组合的甘氨酸、脯氨酸和羟脯氨酸，其中，甘氨酸、脯氨酸和羟脯氨酸的组合是水解胶原。优选地，其中甘氨酸、脯氨酸和羟脯氨酸的组合是水解胶原，且在组合物中存在的量为约1016mg/400kcal。
这些值适用于喂给哺乳动物、特别是伴侣动物的组合物。
本发明的第二方面涉及一种预防或治疗哺乳动物中的骨关节炎的方法。
骨关节炎(OA)是影响哺乳动物中的关节的退行性且炎性的病症。其也被称为退行性关节炎或退行性关节疾病。骨关节炎是一类涉及关节包括关节软骨和软骨下骨的退化的异常。
骨关节炎是分解代谢和合成代谢的不平衡的结果，其中，分解代谢增加；合成代谢降低，导致软骨细胞的炎症。软骨细胞是健康软骨中仅存的细胞。它们产生并维持软骨基质，软骨基质主要由胶原和蛋白聚糖组成。本发明的组合物已证明在体外炎症诱导的软骨细胞和体内健康软骨细胞中提供了尤其是减少的炎症、降低的分解代谢和增加的合成代谢。因此本发明的组合物预防和/或治疗动物中的骨关节炎。
本发明对于所有方面涉及任何哺乳动物，包括人类。具体而言，本发明涉及患有或易于患有骨关节炎的伴侣动物，如犬、猫或马科动物(例如马)或任何其它这种动物。
具体而言，在宠物食料和伴侣动物健康领域中所期望的是提供包括适合支持伴侣动物的健康的补充剂。具体而言，期望的是提供适合促进或维持已经健康的伴侣动物的健康的饮食。
具体而言，本发明的第二方面提供一种用于预防和治疗哺乳动物、特别是伴侣动物中的骨关节炎的方法，包括减轻骨关节炎的症状。所述方法包括给予所述动物一种组合物，所述组合物包含姜黄素与绿茶多酚，或与甘氨酸、脯氨酸和羟脯氨酸的组合。所述动物可能是需要该组合物的。因为显著数量的犬在其一生中患有骨关节炎，因此所有犬可被认为需要预防。
在具体实施方案中，所述方法包括给予所述动物一种组合物，所述组合物包括姜黄素、绿茶多酚以及甘氨酸、脯氨酸和羟脯氨酸的组合。更优选地，所述甘氨酸、脯氨酸和羟脯氨酸的组合是水解胶原。
并且，所述方法优选地给药至患有骨关节炎和需要减轻骨关节炎的症状或需要进一步预防骨关节炎的症状或需要治疗骨关节炎的动物，特别是伴侣动物。这可以施用于例如幼年宠物动物，如幼犬，或大龄伴侣动物。在组合物是食料的情况下，食料可按照伴侣动物平时的饮食方案(dietaryregime)而被给予至饮食方案中。根据所需的预防或治疗的水平，食料可包括100％的伴侣动物的饮食，或少于该比例。食料允许容易地给药组合物，由此避免补充伴侣动物的食物的需要。此外，食料可通过动物的主人给予，由此避免持续的兽医监督。食料可以从售卖宠物食品的任何零售商店(outlet)获得，或者从兽医处获得。食料可以是根据本发明的第一方面的如上所述的食料。
本文使用的“给药”还包括喂食或任何其它的口服给药方法。给药的其它方式还包括片剂、胶囊、注射、栓剂或任何其它适合的方式。
本发明的第二方面的优选特征在进行必要的变化的情况下适用于第一方面。
本发明包括用于制备本发明的第一方面的组合物的方法。
食料可通过本领域中的例如帕加马牛津出版社出版的由ATB埃德尼编辑、A·瑞博德分章节的犬与猫的营养丛书中第57-74页中的标题为“平衡饮食”的文章(WalthamBookofDogandCatNutrition,Ed.ATBEdney,ChapterbyA.Rainbird,entitled"ABalancedDiet"onpages57to74,PergamonPressOxford)中的任何已知的方法制成。
例如，本文所限定的用于制造食料的方法包括将配料与组合物混合在一起，所述组合物包含姜黄色素与绿茶多酚或与甘氨酸、脯氨酸和羟脯氨酸的组合物，并形成食料，特别是宠物食料。在混合之前、之中或之后，可将加热/烹调应用于任意一种或多种配料。
组合物可被喷洒在食料上，与食料混合或掺入基质中的食料中。将组合物包含在内的方法是本领域中已知的。
本发明的重要性在于姜黄色素与绿茶多酚或与甘氨酸、脯氨酸和羟脯氨酸的组合(任选地作为水解胶原)的有益性质。特别是，可观察到比累加效应更大的效果。
对于姜黄色素、绿茶多酚以及甘氨酸、脯氨酸和羟脯氨酸(任选地作为水解胶原)的三重成分组合，观察到了进一步的益处。
本发明的组合物的化合物的组合在降低炎症、降低分解代谢和提高合成代谢中的一个或多个方面上可提供协同效应。
现通过参考以下实施例进一步描述本发明，这些实施例仅出于说明的目的提供，不应视为限制本发明。
实施例1：化合物的单独筛选
进行实验以评价几种化合物对牛软骨细胞的原代培养(primaryculture)的作用，其中，通过白细胞介素-1β诱导炎症和分解代谢过程，以模拟关节炎软骨细胞的作用。
下表具体描述了贯穿整个实验中测定的生物标记，以示出化合物对软骨细胞上的三种代谢途径的作用。
表3：检测的生物标记
单层牛软骨细胞的原代培养
从1岁至2岁的死后不久的公牛的掌指关节(metacarpal-phalangealjoint)获得正常的牛关节软骨。全厚(full-depth)关节软骨被切除并浸入补充有N-(2-羟乙基)哌嗪-N’-(2-乙磺酸)(HEPES)10mM、青霉素(100U/ml)和链霉素(0.1mg/ml)(均来自龙沙(Lonza)韦尔维耶，比利时)的达尔伯克氏改良伊格尔培养基(Dulbecco’sModifiedEagleMedium，DMEM)(含酚红和4.5g/L葡萄糖)中。在三次洗涤后，通过在37℃下用0.5mg/ml透明质酸酶IVS型(西格玛-奥德里奇(Sigma-Aldrich)，博尔内姆，比利时)进行30min，在37℃下用1mg/ml链霉蛋白酶E(默克，鲁汶(Leuven)，比利时)进行1h和在37℃下用0.5mg/ml梭菌胶原酶(clostridialcollagenase)IA(西格玛-奥德里奇，博尔内姆，比利时)进行16h至20h的连续的酶消化从软骨中释放出软骨细胞。然后将酶解分离的细胞通过尼龙网(70μm)过滤，洗涤三次，计数并填充至DMEM(含酚红和4.5g/L葡萄糖)的0.25x106个细胞/ml的密度，所述DMEM补充有10％胎牛血清、10mMHEPES、100U/ml青霉素、0.1mg/ml链霉素、2mM谷氨酰胺(均来自龙沙，韦尔维耶，比利时)和20μg/ml脯氨酸(西格玛-奥德里奇，博尔内姆，比利时)。通过加入2ml的前述培养基/孔，将细胞以0.5X106个细胞/孔接种于6孔板中并以单层培养5天。然后，在补充有1％胎牛血清、10mMHEPES、100U/ml青霉素、0.1mg/ml链霉素、2mM谷氨酰胺和20μg/ml脯氨酸的DMEM(无酚红并仅含有1g/L葡萄糖)(龙沙，韦尔维耶，比利时)，以单层培养软骨细胞直到汇合(confluence)(进行约2天)。仅使用原代培养物以确保软骨细胞表型的稳定性。
当细胞实现汇合时，去除培养基并由新鲜培养基(补充有1％胎牛血清、10mMHEPES、100U/ml青霉素、0.1mg/ml链霉素、2mM谷氨酰胺和20μg/ml脯氨酸的无酚红且仅含有1g/L葡萄糖的DMEM)替换，所述新鲜培养基含有一些营养物质(nutraceuticals)(其中的每一种为12.5μg/ml)并且无或有重组猪IL-1β(10-11M)(RD系统，阿宾顿，UK)。
通过测量软骨细胞的生存力(viability)和PGE2与NO的产生来测试化合物的抗炎效力(首先单独测试，然后组合测试)。
将化合物或者在炎症前(预防效果测定)或者在炎症同时(治疗效果测定)加入培养基中。
筛选的化合物的列表：
1)鱼油：18％EPA+10％DHA(DSM)
2)EPA99％(西格玛(Sigma))
3)DHA99％(西格玛)
4)芦荟(纳图瑞克斯(Naturex))
5)荨麻叶提取物(纳图瑞克斯)
6)高纯度反式白藜芦醇(Resvida):99％白藜芦醇(Resvératrol)(DSM)
7)绿茶提取物：25％多酚，其中12.5％是儿茶素(catéchines)，8％是EGCG(纳图瑞克斯)
8)松树皮提取物：碧萝芷(Pycnogenol)：65％-75％原花青素(procyanidines)(碧欧蓝德(Biolandes))
9)维生素预混料，包括维生素D3
10)GLM(阿若马NZ(AromaNZ))
11)胶原水解物(富迪格嘉利达(FortigeldeGelita)[3.3kDa]：水解猪肉胶原)
12)ASU(索齐姆(Sochim))
13)姜黄粉：85％姜黄色素(纳图瑞克斯)
结果显示，使用的3种化合物为姜黄提取物、水解胶原和绿茶提取物，其显示出针对不同参数的显著效果。之后，对这3种化合物的反应-剂量进行测试。
实施例2：剂量反应
按照实施例1的方法进行。根据分子重量，测试4个不同浓度：0.5μg/ml、2.5μg/ml、12.5μg/ml和62.5μg/ml，以覆盖对应于10-5M的浓度范围。
结果显示，对于每个化合物，给出最佳效果且没有给出毒性作用的浓度是12.5μg/ml。这是12.5μg/ml的浓度相互组合地被用于测试化合物的原因。
实施例3：测试化合物的特定组合和协同效应
进行实施例1的方法。
化合物的补充
当细胞实现汇合时，去除培养基并由新鲜培养基(补充有1％胎牛血清、10mMHEPES、100U/ml青霉素、0.1mg/ml链霉素、2mM谷氨酰胺和20μg/ml脯氨酸的无酚红且仅含有1g/L葡萄糖的DMEM)替换，所述新鲜培养基含有一些化合物(其中的每一种为12.5μg/ml)并且无或有重组猪IL-1β(10-11M)(RD系统，阿宾顿，UK)。测试了三种化合物，即姜黄提取物(纳图瑞克斯，阿维尼翁，法国)、水解胶原(嘉利达，埃贝尔巴赫，德国)和绿茶提取物(纳图瑞克斯，阿维尼翁，法国)。姜黄提取物制备成12.5mg/ml在四氢呋喃(默克，鲁汶，比利时)中的溶液，然后在细胞培养基中进一步稀释1000倍。将水解胶原和绿茶提取物以12.5mg/ml的浓度溶解于水中，通过无菌网(0.20μm)过滤，然后在细胞培养基中进一步稀释1000倍。在无或有重组猪IL-1β(10-11M)时，在12.5μg/ml的终浓度下化合物得到单独测试，或者组合测试(12.5μg/ml姜黄提取物+12.5μg/ml水解胶原；12.5μg/ml姜黄提取物+12.5μg/ml绿茶提取物；12.5μg/ml姜黄提取物+12.5μg/ml水解胶原+12.5μg/ml绿茶提取物)。将化合物的效果与对照(仅DMEM或DMEM+IL-1β)进行对比。
培养停止
在这些条件下培养24h后，收集每种条件的三个孔的条件培养基，并在-20℃下储存。解体这些对应的孔的细胞，使用RNeasy迷你试剂盒(RNeasyminikit)(凯杰(Qiagen)，芬洛，荷兰)进行RNA提取，使用LightCycler480(罗氏(Roche)，韦尔维耶，比利时)实施逆转录酶聚合酶链反应(areversetranscriptasepolymerasechainreaction)，然后实施定量实时聚合酶链反应(aquantitativerealtimepolymerasechainreaction)，以分析基因表达。
在这些条件下培养48h后，收集剩余孔(每种条件三个孔)的条件培养基(乳酸脱氢酶释放试验)，并在-20℃下储存，直到进行分析(亚硝酸盐和前列腺素E2试验)。解体细胞，并通过在4℃下超声解离20s在500μlTris-HCl缓冲液中均质化，以测定DNA含量。
乳酸脱氢酶释放试验
通过在培养上清液中定量乳酸脱氢酶(LDH)的释放来估计细胞生存力。将100μl上清液样品或标准溶液(来自兔肌肉的LDH)的稀释液与含有800nM乳酸盐的50μlTris缓冲液(10mMTris-HCl(pH8.5)、0.1％牛血清白蛋白)混合。然后加入50μl比色试剂、1.6mg/ml碘硝基氯化四氮唑蓝(iodonitrotetrazoliumchloride)(西格玛-奥德里奇，博尔内姆，比利时)、4mg/ml烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(罗氏诊断(RocheDiagnostics)，布鲁塞尔，比利时)和0.4mg/ml吩嗪硫酸甲酯(西格玛-奥德里奇，博尔内姆，比利时)，在室温下孵育10min后读取492nm下的吸光度。
DNA试验
通过在4℃下超声解离15s在500μlTris-HCl缓冲液中使软骨细胞均化。使用赫斯特(Hoechst)荧光法在细胞提取液中测定DNA含量。
亚硝酸盐试验
基于格里斯反应(Griessreaction)使用分光光度法在培养上清液中，通过定量一氧化氮的衍生产物亚硝酸盐来测定一氧化氮(NO)的产生量。简言之，将100μl上清液或亚硝酸钠(NaNO2)标准稀释液与100μl格里斯试剂(Griessreagent)(0.5％磺胺、0.05％萘基乙二胺二盐酸盐、2.5％H3PO4)混合。测定在540nm处的吸收。NO的产生量由每毫克DNA表示。
PGE2试验
使用DetectXPGE2高灵敏度免疫试剂盒(DetectXPGE2HighSensitivityImmunoassaykit)(阿伯试验(ArborAssays)，密歇根州，美国)在培养上清液中测定前列腺素E2(PGE2)的产生量。简言之，将100μl上清液或PGE2标准稀释液用移液器滴入包被有捕获小鼠IgG的抗体的清洁的微量滴定板中。将PGE2-过氧化物酶缀合物(25μl)加入孔中的标准液和上清液中。通过加入25μl抗PGE2单克隆抗体来起始结合反应。在4℃下孵育过夜后，洗涤板，并加入100μl底物。底物与结合的PGE2-过氧化物酶缀合物反应。在短暂的孵育后，停止反应，在450nm波长下检测产生的颜色的强度。PGE2的产生量由每毫克DNA表示。
定量实时逆转录酶聚合酶链反应(Quantitativereal-timereversetranscriptasepolymerasechainreaction，RTPCR)
使用RNeasy迷你试剂盒(凯杰，芬洛，荷兰)分离来自每种条件的3个孔的细胞的RNA。然后，逆转录RNA。通过使用SYBRPremixExTaq(带有预先混合SYBR染料的DNA聚合酶ExTaq)(TliRNaseHPlus)(维斯特博格(Westburg)，勒斯登，荷兰)进行定量实时聚合酶链反应(PolymeraseChainReaction，PCR)。PCT模板源为第一链cDNA或纯化的DNA标准链。用于扩增所需cDNA的引物序列如下：牛HPRT正向和反向引物：5’-AGTTTGGAAATACCTGGCG-3’和5’-AGTCTTTAGGCTCGTAGTGC-3’；牛白细胞介素(IL)-6正向和反向引物：5’-TGGTGATGACTTCTGCTTTCC-3’和5’-TGCCAGTGTCTCCTTGC-3’；牛环氧酶(COX)2正向和反向引物：5’-GTCTGATGATGTATGCCACC-3’和5’-ACGTAGTCTTCAATCACAATCT-3’；牛诱导型一氧化氮合成酶(iNOS)正向和反向引物：5’-GGCAAGCACCACATTGAGA-3’和5’-TGCGGCTGGATTTCGGA-3’；牛聚集蛋白聚糖(aggrecans)(AGG)正向和反向引物：5’-TGCCTTTGACGTGAGC-3’和5’-GCATTGTTGTTGACAAACT-3’；牛II型胶原(COL2)正向和反向引物：5’-CTGCGTCTACCCCAAC-3’和5’-GGGTGCAATGTCAATGAT-3’；牛金属蛋白酶(MMP)-3正向和反向引物：5’-TCTATGAAGGAGAAGCTGACATAAT-3’和5’-TTCATGGGCAGCAACAAG-3’；牛的带有血小板反应蛋白模体的解整合素及金属蛋白酶(ADisintegrinandMetalloproteinasewithThrombospondinMotifs，ADAMTS)4正向和反向引物：5’-CTTTCAATGTCCCACAGGC-3’和5’-CAGGAACGGAAGCGGGTA-3’；牛ADAMTS5正向和反向引物：5’-GACACCCTGGGAATGGCA-3’和5’-CACAGAACTTGGAATCGTCA-3’。
用分光荧光热循环仪(spectrofluorometricthermalcycler)(LightCycler480，罗氏诊断，韦尔维耶，比利时)进行扩增。为了标准化mRNA水平，扩增作为内部对照的管家基因HPRT。通过计算IL-6、COX2、iNOS、AGG、COL2、MMP-3、ADAMTS4、ADAMTS5和HPRT的cDNA拷贝数量之间的比例标准化基因表达。
结果表示为与对照相比的平均增加百分比。使用t-测试评价统计显著性。p<0.05时的偏差被认为是统计上显著的。下表详细记载了在结合化合物与观察到的协同作用时所提供的结果。
表4
(*有益作用；**负作用；***比预期的更有益)
讨论
组合的结果比每个化合物的叠加效果要好。一种解释是因为化合物对相关的不同代谢途径起作用，当有炎症时，分解代谢增加而合成代谢降低。因此，我们的非限定性假设是，姜黄素抑制由IL-1β诱导的炎症(并且也由胶原和绿茶诱导)。一旦炎症被抑制，分解代谢降低，并且胶原和绿茶多酚可对合成代谢具有其正向作用。由于关节炎是恶性循环(炎症诱导分解代谢，分解代谢诱导炎症等)，当分解代谢降低(且合成代谢增加)时，会有炎症的降低，并弥补恶性循环。
然而，通常，在健康细胞中，分解代谢和合成代谢之间总有平衡。可见，该组合可对健康细胞的代谢具有正向作用(没有通过IL-1β诱导炎症)。非常有趣的是，在关节炎或关节炎之前的情况中，仍处于良好健康的细胞可被这些组合所保护。