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1、(10)授权公告号 CN 103222537 B (45)授权公告日 2014.11.05 CN 103222537 B (21)申请号 201310167006.3 (22)申请日 2013.05.08 A23J 3/34(2006.01) (73)专利权人 中国农业科学院农产品加工研究 所 地址 100193 北京市海淀区圆明园西路 2 号 专利权人 华隆 （乳山） 食品工业有限公司 (72)发明人 王强 刘芳友 刘红芝 张文镨 刘丽 李宁 胡晖 (74)专利代理机构 北京纪凯知识产权代理有限 公司 11245 代理人 关畅 吴肖， 等 . 复合酶水解花生粕蛋白工艺研 究 .食品工业科技 。
2、.2005, 第 26 卷 ( 第 1 期 ), 第 120-121 页 . 林勉， 等 . 内肽酶与端解酶水解花生粕蛋白 的研究 .食品科学 .2000, 第 21 卷 ( 第 1 期 ), 第 22-25 页 . (54) 发明名称 一种双中性蛋白酶分步酶解花生分离蛋白制 备花生肽的方法 (57) 摘要 本发明公开了一种双中性蛋白酶酶解花生分 离蛋白制备花生肽的方法。 该方法包括下述步骤 ： 1) 将花生分离蛋白粉用水溶解， 得到花生分离蛋 白溶液， 将花生分离蛋白溶液置于8085水浴 中保持 10 15min ； 2) 将步骤 1) 处理后的花生 分离蛋白溶液取出， 待温度降至中性蛋白酶。
3、酶解 适合的温度后加入中性蛋白酶进行酶解， 得到酶 解液， 记为酶解液 1 ； 3) 向酶解液 1 中加入复合蛋 白酶， 继续进行酶解， 得到酶解液2 ； 4)使酶解液2 中的中性蛋白酶和复合蛋白酶失活， 离心取上清 液， 喷雾干燥得到花生肽。本发明的方法具有花 生肽得率高， 纯度高， 分子量集中分布于 1000Da 以下， 具有较强的 ACE 抑制活性， 且具有制备成本 低， 制备时间短， 制备方法简单、 制备条件温和等 优点。 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 牛力轩 权利要求书 1 页 说明书 5 页 附图 3 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 。
4、权利要求书1页 说明书5页 附图3页 (10)授权公告号 CN 103222537 B CN 103222537 B 1/1 页 2 1. 一种制备花生肽的方法， 包括下述步骤 ： 1） 将花生分离蛋白粉用水溶解， 得到花生分离蛋白溶液， 将所述花生分离蛋白溶液置 于 80 85水浴中保持 10 15min ； 所述花生分离蛋白溶液中花生分离蛋白的质量浓度 为 6 8% ； 2） 将步骤 1） 处理后的花生分离蛋白溶液取出， 待温度降至中性蛋白酶酶解适合的温 度后加入中性蛋白酶进行酶解， 得到酶解液， 记为酶解液 1 ； 所述中性蛋白酶的加入量为 5200 6500U/g 蛋白 ； 所述酶解条。
5、件为 ： 酶解温度 40 50， 酶解时间 1.5 2.0h ； 3） 向所述酶解液 1 中加入复合蛋白酶， 继续进行酶解， 得到酶解液 2 ； 所述复合蛋白酶 的加入量为 216 648U/g 蛋白 ； 所述酶解条件为 ： 酶解温度 40 50， 酶解时间 2.0 2.5h ； 4） 使所述酶解液 2 中的中性蛋白酶和复合蛋白酶失活， 离心取上清液， 即得花生肽的 溶液。 2. 根据权利要求 1 所述的方法， 其特征在于 ： 步骤 1） 中所述花生分离蛋白粉中， 蛋白 含量不低于 90%， 脂肪含量不高于 1%。 3. 根据权利要求 2 所述的方法， 其特征在于 ： 步骤 1） 中所述花生分。
6、离蛋白溶液中花生 分离蛋白的质量浓度为 8%。 4. 根据权利要求 1-3 中任一项所述的方法， 其特征在于 ： 步骤 2） 中所述中性蛋白酶的 加入量为 5200U/g 蛋白 ； 所述酶解条件为 ： 酶解温度 45， 酶解时间 120min。 5. 根据权利要求 4 所述的方法， 其特征在于 ： 步骤 3） 中所述复合蛋白酶的加入量为 432U/g 蛋白 ； 所述酶解条件为 ： 酶解温度 45， 酶解时间 120min。 6. 根据权利要求 5 所述的方法， 其特征在于 ： 步骤 4） 中使所述中性蛋白酶和复合蛋白 酶灭活的方法如下 ： 将所述酶解液 2 升温至 90 95， 保持 10 2。
7、0min ； 步骤 4） 中所述离心的条件为 4000 4500rpm 离心 20 30min。 7. 根据权利要求 6 所述的方法， 其特征在于 ： 所述方法还包括对步骤 4) 得到的花生肽 的溶液进行干燥的步骤 ； 所述干燥的方式为冷冻干燥或喷雾干燥。 8. 权利要求 1-7 中任一所述的方法制备得到的花生肽， 所述花生肽中分子量小于 1000Da 的肽的含量 98.88%。 权 利 要 求 书 CN 103222537 B 2 1/5 页 3 一种双中性蛋白酶分步酶解花生分离蛋白制备花生肽的方 法 技术领域 0001 本发明涉及一种双中性蛋白酶分步酶解花生分离蛋白制备花生肽的方法。 背景。
8、技术 0002 花生是我国重要的油料作物和食用作物， 产量和出口量高居世界首位。目前， 中 国对花生的利用多在食用油脂的提取方面， 对花生蛋白的利用较少。花生的蛋白质含量为 25 30， 花生蛋白含有人体必需的八种氨基酸， 精氨酸含量高于其它坚果， 生物学效价 高于大豆。目前国内市场上的花生蛋白产品主要是花生蛋白粉， 其一般是作为食品加工中 的基础原料。 花生蛋白粉存在着不易吸收、 生理洁性较差等缺点， 所以在花生蛋白粉的基础 上， 进一步开发和利用这一巨大的潜在蛋白资源生产高附加值产品成了当务之急。 0003 多项研究表明， 花生蛋白经蛋白酶水解制备成花生肽后具有多种生理活性， 包括 抗氧化。
9、作用、 抗菌作用、 降血压作用等。 因此， 研究花生蛋白粉酶解工艺制备花生肽， 可以开 发和利用花生蛋白粉这一巨大的潜在蛋白资源， 生产高附加值蛋白产品。采用生物酶法在 温和条件下对蛋白进行水解， 生成的多肽具有很高营养价值。 现代营养研究表明， 分子量小 于 1000u 的短肤极易被人体吸收利用， 而且具有较强的功能活性， 这就要求所选用的酶解 工艺在保证短肽得率的前提下尽量提高蛋白的水解度。 0004 目前， 蛋白水解制备短肽的工艺中， 酶解时间一般在 360 960min， 短肽得率在 60 65左右， 体系水解度在 12 16左右， 且多存在脱盐等繁琐步骤。因此如何简 化工艺并在短时间。
10、获得高水解度高得率的短肽成为生产工艺中需要解决的一大难题。 发明内容 0005 本发明的目的是提供一种酶解花生分离蛋白制备花生肽的方法。 0006 本发明所提供的制备花生肽的方法， 包括下述步骤 ： 0007 1) 将花生分离蛋白粉用水溶解， 得到花生分离蛋白溶液， 将所述花生分离蛋白溶 液置于 80 85水浴中保持 10 15min， 使花生分离蛋白高度压缩、 紧密的结构松散开， 暴露出分子内部的酶作用位点， 以利于蛋白酶的结合 ； 0008 2) 将步骤 1) 处理后的花生分离蛋白溶液取出， 待温度降至中性蛋白酶酶解适合 的温度后加入中性蛋白酶进行酶解， 得到酶解液， 记为酶解液 1 ； 。
11、0009 3) 向所述酶解液 1 中加入复合蛋白酶， 继续进行酶解， 得到酶解液 2 ； 0010 4) 使所述酶解液 2 中的中性蛋白酶和复合蛋白酶失活， 离心取上清液， 即得花生 肽的溶液。 0011 其中， 步骤1)中所述花生分离蛋白溶液中花生分离蛋白的质量浓度为68， 优 选质量浓度为 8。 0012 所述花生分离蛋白粉中， 蛋白含量不低于 90， 脂肪含量不高于 1。 0013 步骤2)中所述中性蛋白酶的加入量为52006500U/g蛋白。 所述酶解的条件为 ： 说 明 书 CN 103222537 B 3 2/5 页 4 酶解温度 40 50， 酶解时间 1.5 2.0h ； 优选。
12、酶解的条件为 ： 酶解温度 45， 酶解时间 120min。所述酶解在恒温水浴振荡器中进行。 0014 步骤 3) 中所述复合蛋白酶的加入量为 216 648U/g 蛋白。所述酶解的条件为 ： 酶解温度 40 50， 酶解时间 2.0 2.5h ； 优选酶解的条件为 ： 酶解温度 45， 酶解时间 120min。所述酶解在恒温水浴振荡器中进行。 0015 本发明中所述中性蛋白酶是由枯草芽孢杆菌经发酵提取而得的， 属于单一酶类， 无特异性酶切位点 ； 所述复合蛋白酶由内切酶和外切酶复合而成。 0016 本发明对中性蛋白酶酶活定义为 ： 酪蛋白底物在特定条件下经酶水解， 每分钟产 生 1g 酪氨酸。
13、为一个活力单位， 以 U 表示。 0017 对复合蛋白酶酶活的定义为 ： 酪蛋白底物在特定条件下经酶水解， 每分钟产生 1g 酪氨酸为一个活力单位， 以 U 表示。 0018 步骤4)中可按照下述方法使所述中性蛋白酶和复合蛋白酶灭活 ： 将酶解液2升温 至 90 95， 保持 10 20min。 0019 步骤 4) 中所述离心的条件为 4000 4500rpm 离心 20 30min。 0020 上述方法还包括对步骤 4) 得到的花生肽的溶液进行干燥的步骤。所述干燥可采 用冷冻干燥或喷雾干燥。 0021 本发明提供了一种方法简单、 条件温和、 制备时间短、 花生肽制备成本低， 花生肽 得率高。
14、且纯度高的花生肽的制备方法。 所得花生肽的分子量集中分布于1000Da以下 ； 最终 水解度达到38.23， 短肽得率达到88.52， 其中分子量小于1000Da占98.88， 并具有较 强的 ACE 抑制活性， 其 IC50值为 0.842mg/ml。 附图说明 0022 图 1 为本发明中测得的中性蛋白酶加酶量与水解关系曲线图。 0023 图 2 为本发明中测得的复配酶种类与水解关系曲线图。 0024 图 3 为本发明中测得的复合蛋白酶加酶量与水解关系曲线图。 0025 图 4 为本发明中测得的酶解温度与水解关系曲线图。 0026 图 5 为本发明中测得的酶解时间与水解关系曲线图。 002。
15、7 图 6 为本发明中测得的短肽分子量分布的 GPC 图谱。 具体实施方式 0028 下面通过具体实施例对本发明的方法进行说明， 但本发明并不局限于此。 0029 下述实施例中所述实验方法， 如无特殊说明， 均为常规方法 ； 所述试剂和生物材 料， 如无特殊说明， 均可从商业途径获得。 0030 下述实施例中所采用的中性蛋白酶购自北京索莱宝科技有限公司， 商品目录号 ： Z8030， 酶活为 6.00104U/g ； 所采用的复合蛋白酶购自北京索莱宝科技有限公司， 商品目 录号 ： C8800， 酶活为1.20105U/g ； 所采用的木瓜蛋白酶购自北京索莱宝科技有限公司， 商 品目录号 ： 。
16、G8430， 酶活为 5.00105U/g ； 所采用的风味蛋白酶购自北京索莱宝科技有限公 司， 商品目录号 ： F8250， 酶活为 2.00104U/g。 0031 下述实施例中所采用的花生分离蛋白粉， 其蛋白含量为 90， 脂肪含量为 1。 说 明 书 CN 103222537 B 4 3/5 页 5 0032 下述实施例中可溶性氮的测定 ： folin- 酚法 ； 0033 短肽得率测定 ： 三氯乙酸可溶性氮法 N1/N0100 ； 0034 式中， TCA-NSI- 三氯乙酸可溶性氮得率， ； N1- 在 10 TCA 中可溶性氮， mg ； N0 原料中总氮， mg。 0035 水。
17、解度 (DH) 的测定 ： 邻苯二甲醛 (OPA) 法。 0036 花生肽分子量分布的测定 ： 采用高效液相色谱 (HPLC) 对酶解物的分子量分布 进行分析， 条件为 ： 色谱柱 ： TSKgel2000SWXL300mm7.8mm ； 流动相 ： 45乙睛 +55水 +0.1三氟乙酸 ； 流速 ： 0.5ml/min ； 温度 ： 30 ； 检测波长 ： 220nm。 0037 ACE 抑制活性的测定 ： 采用高效液相色谱 (HPLC) 对酶解物的 ACE 抑制活性进行分 析， 条件为 ： 实验色谱柱 Sunfi reTM-C18(250mm4.6mm)， 流动相乙腈 - 水 - 三氟乙酸。
18、， 体积 比 50 50 0.05， 检测波长 228nm， 流速 0.4mL/min， 柱温 30， 进样量 20L。 0038 实施例 1、 考察不同蛋白酶复配对水解度及短肽得率的影响 0039 第一步 ： 取花生分离蛋白粉， 加入蒸馏水， 使之溶解后， 得到质量浓度 8的花生 分离蛋白溶液 ； 将其加入 80恒温水浴中保持 10min， 使花生分离蛋白高度压缩、 紧密的结 构松散开， 暴露出分子内部的酶作用位点， 以利于蛋白酶的结合 ； 0040 第二步 ： 第一步完成后取出花生分离蛋白溶液， 恢复温度到中性蛋白酶适合温度 (45 ) 后加入中性蛋白酶 (5200U/g 底物 )， 在 。
19、45的恒温水浴振荡器中反应 120min ； 0041 第三步 ： 第二步反应结束后， 加入复合蛋白酶 (432U/g 底物 ) 混合均匀， 继续在 45的恒温水浴振荡器中反应 120min ； 0042 第四步 ： 第三步反应结束后取出， 放入 90恒温水浴中保持 10min， 使中性蛋白酶 失活， 4500 转离心 20min 后喷雾干燥得到花生肽。 0043 第五步 ： 采用高效液相色谱 (HPLC) 对第四步所得花生肽的分子量分布进行分析， 测得的短肽分子量分布如图 6 所示， 分子量小于 1000Da 占 98.88。 0044 第六步 ： 采用高效液相色谱 (HPLC) 对酶解物的。
20、 ACE 抑制活性进行分析， ACE 抑制 活性的 IC50值为 0.842mg/ml。 0045 采用上述方法制备花生肽， 最终水解度达到 38.23， 短肽得率达到 88.52 ( 以 蛋白含量计 )， 分子量小于 1000Da 占 98.88， ACE 抑制活性的 IC50值为 0.842mg/ml。 0046 上述第二步中不同中性蛋白酶的用量所对应的花生分离蛋白的水解度和短肽得 率的结果， 见图 1。由图 1 中可以看出 ： 酶用量在 2600 3900U/g 浓度范围内， 酶解液的 DH 和 TCA-NSI 上升缓慢， 当酶用量在 3900 6500U/g 浓度范围内时， 酶解液的 。
21、DH 和 TCA-NSI 随酶用量的升高上升迅速， 当酶用量达到5200U/g时， TCA-NSI达到43.930.40， 之后上 升均趋于平缓， 所以选择中性蛋白酶加酶量为 5200U/g 底物。 0047 将上述第三步中的复合蛋白酶分别替换成木瓜蛋白酶 (3000U/g 底物 )、 风味蛋白 酶 (3000U/g 底物 )， 考察不同蛋白酶与中性蛋白酶复配， 水解花生分离蛋白的水解度和短 肽得率。结果见图 2。由图 2 中可以看出 ： 在各种蛋白酶的推荐使用条件下 ( 木瓜蛋白酶、 风味蛋白酶的酶解条件为 ： 温度50， 加酶量3000U/g底物， 酶解时间120min)， 复合蛋白酶 与。
22、中性蛋白酶复配水解花生分离蛋白的水解度和短肽得率显著高于其他两种蛋白酶， 所以 选择复合蛋白酶作为中性蛋白酶的复配酶。 0048 实施例 2、 考察复合蛋白酶用量对水解度及短肽得率的影响 说 明 书 CN 103222537 B 5 4/5 页 6 0049 第一步 ： 取花生分离蛋白粉， 加入蒸馏水， 使之溶解后， 得到质量浓度 8的花生 分离蛋白溶液 ； 将其加入 80恒温水浴中保持 10min， 使花生分离蛋白高度压缩、 紧密的结 构松散开， 暴露出分子内部的酶作用位点， 以利于蛋白酶的结合 ； 0050 第二步 ： 第一步完成后取出花生分离蛋白溶液， 恢复温度到中性蛋白酶适合温度 (4。
23、5 ) 后加入中性蛋白酶 (5200U/g 底物 )， 在 45的恒温水浴振荡器中反应 120min ； 0051 第三步 ： 第二步反应结束后， 加入不同量的复合蛋白酶 (216U/g 底物 -8640U/g 底 物 ) 混合均匀， 继续在 45的恒温水浴振荡器中反应 120min ； 0052 第四步 ： 第三步反应结束后取出， 放入 90恒温水浴中保持 10min， 使中性蛋白酶 失活， 4500 转离心 20min 后喷雾干燥得到花生肽。 0053 不同复合蛋白酶的用量所对应的花生分离蛋白的水解度和短肽得率的结果， 见图 3。由图 3 中可以看出 ： 水解液中水解度和短肽得率呈先上升后。
24、下降的趋势。随着加酶量增 大， 酶的水解作用加强， 反应后水解度和短肽得率上升， 但当加酶量继续增加， 酶的抑制作 用导致水解度和短肽得率均不同程度下降。所以选择复合蛋白酶加酶量为 216 648U/g 底物， 最优选 432U/g 底物。 0054 实施例 3、 考察不同酶解温度对水解度及短肽得率的影响 0055 第一步 ： 取花生分离蛋白粉， 加入蒸馏水， 使之溶解后， 得到质量浓度 8的花生 分离蛋白溶液 ； 将其加入 80恒温水浴中保持 10min， 使花生分离蛋白高度压缩、 紧密的结 构松散开， 暴露出分子内部的酶作用位点， 以利于蛋白酶的结合 ； 0056 第二步 ： 第一步完成后。
25、取出花生分离蛋白溶液， 恢复温度到中性蛋白酶适合温度 (45 ) 后加入中性蛋白酶 (5200U/g 底物 )， 在 45的恒温水浴振荡器中反应 120min ； 0057 第三步 ： 第二步反应结束后， 加入复合蛋白酶 (432U/g 底物 ) 混合均匀， 继续在 45的恒温水浴振荡器中反应 120min ； 0058 第四步 ： 第三步反应结束后取出， 放入 90恒温水浴中保持 10min， 使中性蛋白酶 失活， 4500 转离心 20min 后喷雾干燥得到花生肽。 0059 不同酶解温度所对应的花生分离蛋白的水解度和短肽得率的结果， 见图 4。由图 4 可以看出 ： 酶的作用效果受到温度。
26、影响较大。一般情况下， 在酶的适用温度范围内， 增加反 应体系的温度， 则酶解的速度加快， 酶解产物增多。如图 4 所示， 在 35 45温度范围内， 水解度和短肽得率随着温度升高而增加。 45后水解度和短肽得率随着温度的升高逐渐降 低。因此， 选择 40 50作为酶解温度， 45作为酶解最佳温度。 0060 实施例 4、 考察不同酶解时间对水解度及短肽得率的影响 0061 第一步 ： 取花生分离蛋白粉， 加入蒸馏水， 使之溶解后， 得到质量浓度 8的花生 分离蛋白溶液 ； 将其加入 80恒温水浴中保持 10min， 使花生分离蛋白高度压缩、 紧密的结 构松散开， 暴露出分子内部的酶作用位点，。
27、 以利于蛋白酶的结合 ； 0062 第二步 ： 第一步完成后取出花生分离蛋白溶液， 恢复温度到中性蛋白酶适合 温度后加入中性蛋白酶 (5200U/g 底物 )， 在 45的恒温水浴振荡器中反应若干时间 (1.0h1.5h2.0h2.5h) ； 0063 第三步 ： 第二步反应结束后， 加入复合蛋白酶 (432U/g 底物 ) 混合均匀， 继续在 45的恒温水浴振荡器中反应若干时间 (3.0h2.5h2.0h1.5h) ； 0064 第四步 ： 第三步反应结束后取出， 放入 90恒温水浴中保持 10min， 使中性蛋白酶 说 明 书 CN 103222537 B 6 5/5 页 7 失活， 45。
28、00 转离心 20min 后喷雾干燥得到花生肽。 0065 不同酶解时间所对应的花生分离蛋白的水解度和短肽得率的结果， 见图 5。由图 5 可以看出 ： 当加酶量、 底物浓度和酶解温度一定时， 调整复合蛋白酶加入时间， 酶解效果不 同。由图 5 可知， 水解度在中性蛋白酶反应 90min 后加入复合蛋白酶继续反应 150min 时达 到最大， 短肽得率在中性蛋白酶反应 120min 后再加入复合蛋白酶反应 120min 时达到最大 值， 而后上述两指标均有不同程度下降， 考虑短肽的得率因素， 因此酶解最佳时间为中性蛋 白酶反应 120min 后加入复合蛋白酶继续反应 120min。 0066 。
29、采用上述方法制备花生肽具有以下有益效果 ： 制备方法简单， 制备条件温和， 制备 时间短， 花生肽制备成本低， 花生肽得率高， 纯度高， 分子量集中分布于 1000Da 以下 ； 最终 水解度达到 38.23， 短肽得率达到 88.52， 分子量小于 1000Da 占 98.99， ACE( 血管紧 张素转化酶 ) 抑制活性的 IC50值为 0.842mg/ml。 0067 本文具体说明了本发明示例性实施实例和目前的优选实施方式， 应当理解， 本发 明的构思可以按其他种种形式实施运用， 它们同样落在本发明的保护范围内。 说 明 书 CN 103222537 B 7 1/3 页 8 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 103222537 B 8 2/3 页 9 图 3 图 4 说 明 书 附 图 CN 103222537 B 9 3/3 页 10 图 5 图 6 说 明 书 附 图 CN 103222537 B 10 。