技术背景
初生动物以及尤其是(密集)养殖的初生动物易于被细菌和其它感染。这些感染可导致与体重减轻相关的腹泻，在严重情况下甚至导致初生动物死亡。例如，几年前，西班牙不同地理位置的猪场中已描述了初生小猪的腹泻病例。认为所述腹泻是这些动物的症状，然而，所述症状的诱发因素有时很难查找。在许多例如初生猪中的腹泻情况下，可以分离到单独的或者联合Clostridiumperfringens或Clostridiumdifficile的可能不利的/不期望的细菌菌株(例如Escherichiacoli)，但腹泻通常在出生后不久发现且常规治疗和预防程序常常无效。
不想受限于任何特定理论，认为菌态不平衡(也被称为菌群失调症)可以是诱发因素。菌态不平衡指的是身体上或身体内微生物失衡的病症。在养殖动物(尤其是猪)中，菌态不平衡可由在母猪喂养期间滥用抗生素，从而使初生小猪的肠道菌群改变引起。
鉴于使用抗生素的这些缺点，建议减少在畜牧业中使用抗生素。另一方面，如此则将需要治疗初生动物的替代性方法来替代通常使用的抗生素。
因为EU从2005年开始建议减少使用抗生素作为养猪业的生长促进剂(被2005年3月4日的规章(EC)编号378/2005修正)，所以动物饲养者需要能够改善(畜牧场)动物(尤其在生命早期)的一般健康状况的替代物。本发明人提供了这个问题的解决方案，所述解决方案将在下文中被描述。因此，本发明解决了一些由现有技术方法引起的问题，其有利效果将在下文详述。
发明概述
在第一方面，本发明涉及组合物，其包含至少1种(例如1种)，优选地至少2种(例如2种)，更优选地至少3种(例如3种)，更优选地至少4种(例如4种)，或者至少5种(例如5种)，或者至少6种(例如6种)，或者至少7种(例如7种)，或者至少8种(例如8种)微生物，优选细菌，更优选地乳酸菌。所述乳酸菌理想地选自下列菌株：CECT8163(AqSyn04)；CECT8165(AqSyn06)；CECT8164(AqSyn09)；CECT8166(AqSyn10),CECT8347(AqSynJ12)；CECT8348(AqSynJ17)；CECT8349(AqSynJ55)和CECT8350(AqSynJ59)，它们都保藏在CECT。在一个实施方式中，所述组合物包含1种或更多种菌株，其中每种菌株至少满足下述条件a.，优选地条件a.和b.二者，最优选地全部条件a.、b.和c.：
a.显示出由至少1种下述抑制区(inhibitionzone)证明的抗微生物活性(i)对于Salmonella，10mm或更大，例如14mm或更大，(ii)对于Listeriamonocytogenes，9mm或更大，优选地10mm或更大，(iii)对于Staphyloccocusaureus，9mm或更大，优选地10mm或更大，(iv)对于Escherichiacoli，10mm或更大，例如18mm或更大；
b.在pH＝3.5或者pH＝2.5下孵育3小时期间能够基本保持相同的生存力；
c.在0.45％胆汁提取物的存在下优选地在pH＝8下孵育4小时期间能够基本保持相同的生存力。
本发明的组合物可用于治疗或预防由细菌感染引起的腹泻和/或增加初生哺乳动物(优选地小猪)的重量的方法中。在这个方法中，所述组合物被施用至哺乳动物。
本发明还提供微生物，优选地细菌，更优选地乳酸菌。所述乳酸菌理想地选自下列菌株：CECT8163(AqSyn04)；CECT8165(AqSyn06)；CECT8164(AqSyn09)；CECT8166(AqSyn10),CECT8347(AqSynJ12)；CECT8348(AqSynJ17)；CECT8349(AqSynJ55)和CECT8350(AqSynJ59)，它们都由AQUILONCYLS.L保藏在CECT(西班牙典型培养物保藏中心)。括号内的AqSyn编号可被同义地用于每种菌株，它们由本发明的发明人分配给菌株。
CECT8163(AqSyn04)；CECT8165(AqSyn06)；CECT8164(AqSyn09)和CECT8166(AqSyn10)在2012年6月20日被保藏。CECT8347(AqSynJ12)；CECT8348(AqSynJ17)；CECT8349(AqSynJ55)和CECT8350(AqSynJ59)在2013年5月16日被保藏。
在一个具体实施方式中，所述组合物包含下列3种菌株中的至少1种(例如1种)，优选地至少2种(例如2种)，更优选地至少3种(例如3种)：CECT8163(AqSyn04)；CECT8164(AqSyn09)和CECT8166(AqSyn10)。在一个替代性实施方式中，所述组合物包含CECT8163(AqSyn04)；CECT8165(AqSyn06)；CECT8164(AqSyn09)；和CECT8166(AqSyn10)中的全部4种。
在一个替代性实施方式中，所述组合物包含CECT8163(AqSyn04)；CECT8165(AqSyn06)；CECT8164(AqSyn09)；CECT8166(AqSyn10)；CECT8347(AqSynJ12)；CECT8348(AqSynJ17)；CECT8349(AqSynJ55)和CECT8350(AqSynJ59)中的1种或更多种，例如1、2、3、4、5、6、7、8种。
在一个替代性实施方式中，所述组合物包含CECT8347(AqSynJ12)；CECT8348(AqSynJ17)；CECT8349(AqSynJ55)和CECT8350(AqSynJ59)中的至少1种(例如1种)，优选地至少2种(例如2种)，更优选地至少3种(例如3种)，更优选地至少4种(例如4种)
在一个替代性实施方式中，所述组合物包含下列3种菌株：CECT8347(AqSynJ12)；CECT8348(AqSynJ17)和CECT8349(AqSynJ55)。在一个替代性实施方式中，所述组合物包含下列3种菌株：CECT8348(AqSynJ17)；CECT8349(AqSynJ55)和CECT8350(AqSynJ59)。在一个替代性实施方式中，所述组合物包含下列3种菌株：CECT8347(AqSynJ12)；CECT8348(AqSynJ17)；和CECT8350(AqSynJ59)。在一个替代性实施方式中，所述组合物包含下列3种菌株：CECT8347(AqSynJ12)；CECT8349(AqSynJ55)和CECT8350(AqSynJ59)。在一个优选实施方式中，所述组合物包含CECT8347(AqSynJ2)；CECT8348(AqSynJ17)；CECT8349(AqSynJ55)和CECT8350(AqSynJ59)中的全部4种。
在本发明的一个实施方式中，组合物中所包含的至少1种菌株，例如组合物中所包含的1种和/或2种和/或3种和/或4种和/或5种和/或6种和/或7种，和/或8种以及优选地全部菌株无抗生素抗性，即它们在暴露于恰当的标准抗生素处理后不能存活。
在任何一种情况下，“包含”可被任选地理解为：存在其它细菌菌株，或不存在其它细菌菌株。即使不存在其它细菌菌株，“包含”可任选地表示：存在其它成分，即不同于细菌的任何成分。
其它成分不以任何方式被限制。在一个优选的方面，至少一种益生元化合物被包含在本发明的组合物中，即作为其它成分。
就不同菌株的组合物而言，任何混合比例都可以。下文中利用菌落形成单位(CFU)表示混合比例，CFU在混合各菌株之前被适当地测定。在一个实施方式中，菌株比例可相等或可不相等，例如对于3种菌株的组合物为1：(0.1-10)：(0.1-10)，对于4种菌株的组合物为1：1：(0.1-10)：(0.1-10)：(0.1-10)，等等。在另一个实施方式中，菌株比例大致或基本相等，例如对于3种菌株的组合物为1：1：1，对于4种菌株的组合物为1：1：1：1，等等。可通过混合将被并入组合物的各菌株的相应细菌量(根据菌落数所测定)来制备组合物。将被并入的菌株可被提供为各种菌株的储备物(stock)，它们中的每一种例如为冻干物形式。如果不同储备物的浓度(CFU/g)不同，那么使用恰当量(g)的每种储备物，以使期望的组合物具有每种菌株的期望CFU。其实例在下文中被展示。
益生元在本领域众所周知，当在本发明中使用时，对益生元本身没有特别限制。然而，在一些优选的实施方式中，组合物中的至少一种益生元产品选自下列化合物和组合物：β-葡聚糖、甘露寡糖、菊粉、寡果糖(oligofructose)、半乳寡糖(GOS)、乳果糖、低聚乳果糖(lactosucrose)、半乳三糖、果寡糖(FOS)、纤维二糖、纤维糊精、环糊精、麦芽糖醇、乳糖醇、葡糖基蔗糖(glycosilsucrose)、维生素E或其变体(其中所述变体选自α、β、γ、δ-生育酚、生育三烯酚和生育单烯酚(tocomonoenol))。任选地，甘露寡糖和/或菊粉可以是优选的。
本发明还提供上述组合物在人类或动物的治疗方法中的用途。治疗动物、哺乳动物和/或尤其驯养动物可以是优选的。优选地，动物是非人类的动物，更优选地它来源于Suina亚目(Suina亚目(也被称为Suiformes)是哺乳动物的品系，其包括Suidae和Tayassuidae科的猪和野猪)。野生的或驯养的猪可以是特别优选的。在另一个实施方式中，组合物被施用至人类。
本发明还提供组合物，所述组合物包含微生物，优选地细菌，更优选地乳酸菌，其用于治疗或预防由细菌感染引起的腹泻和/或增加初生哺乳动物(优选地小猪)的重量的方法中。或者，所述组合物用于促进初生哺乳动物(优选地小猪)生长的方法中。
用于治疗或预防由细菌感染引起的腹泻和/或增加重量和/或促进生长的方法中的所述组合物可包含细菌菌株CECT8163(AqSyn04)；CECT8165(AqSyn06)；CECT8164(AqSyn09)；CECT8166(AqSyn10)；CECT8347(AqSynJ12)；CECT8348(AqSynJ17)；CECT8349(AqSynJ55)和CECT8350(AqSynJ59)中的至少一种。在一些实施方式中，用于治疗或预防由细菌感染引起的腹泻和/或增加重量和/或促进生长的方法中的所述组合物是上述的特定组合物(在所述的任何实施方式中)。
用于治疗或预防由细菌感染引起的腹泻和/或增加重量和/或促进生长的方法中的所述组合物可在出生后的头14天内(更优选地在出生后的头13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3或2天内，最优选地在出生后的头2天内或在出生后的头1天(24小时)内)被施用。
为此目的，例如，可经口施用组合物。组合物可以是任何形式，例如冻干的，液体的或雾状形式。例如，如果使用冻干细菌来制造组合物，那么可例如利用无菌等渗盐水溶液将冻干细菌的所述初步组合物再水化，从而可获得具有期望的总浓度(CFU/ml)的最终组合物。
为了使得使用简单，组合物可以为剂量形式(dosedform)。例如，每剂量包含107或更多，108或更多，109或更多，1010或更多，1011或更多细菌菌落形成单位(CFU)(109或更多可以是优选的)。剂量的体积可在0.1-100ml，更优选地0.2-50ml，更优选地0.5-20ml，更优选地1.0-10ml，更优选地1.5-5ml，甚至更优选地(基本上)2ml的范围内。具有109或更多CFU的2ml剂量可以是特别优选的。
可施用任何剂量数，本领域技术人员能够根据各个畜牧场的需要选择治疗长度。在一个具体实施方式中，向动物施用的总剂量数为10或更少，例如选自下列的任何数字：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10，或者组合任何一个这些数字(除了10)和任何一个这些数字的任何范围，前提条件是第二个数字更大(例如1-3剂量)。每个动物共2剂量可以是特别优选的。
在一个优选的实施方式中，在出生后的头24小时内施用第一剂并在随后的24小时内施用第二剂。任选地，这些是仅有的2个剂量。在另一个方式中，接下来施用更多剂量。
本发明的组合物特别适用于治疗或预防哺乳动物中的病症，例如细菌感染。在一些实施方式中，所述病症可选自由细菌感染(包括大肠杆菌症)引起的腹泻、Clostridiumdifficile新生腹泻、ClostridiumperfringensA和C类型。还可以向患腹泻的动物施用所述组合物，即使(尚)未证明(细菌)感染是所述腹泻的诱发因素。
附图简介
图1：不同PCR谱图，通常针对实施例1中所述独特的细菌物种(泳道1-5，7：Lactobacillusreuteri，泳道8-11：Enterococcusfaecium，泳道6：分子量标记)。
图2：抑制区，示例性实例。
发明的详细公开内容
以下详细描述公开了本发明所述各特征的特殊和/或优选变化形式。本发明还特别预期了特别优选的实施方式，它们通过组合关于本发明的二种或更多种特征描述的二种或更多种特定和/或优选变化形式而产生。
除非另外清楚指出，术语“包含”在本文件的语境中被用来表示：除了通过“包含”被引入的成员列表之外，其它成员可任选地存在。然而，作为本发明的一个特定实施方式考虑，术语“包含”涵盖其它成员不存在的可能性，即，为了这个实施方式的目的，“包含”应被理解为具有“由……组成”的含义。
除非另外清楚指出，本申请中的所有相对量表示均基于重量/重量。由通用术语表征的组分的相对量表示意指由所述通用术语涵盖的所有具体变化形式或成员的总量。如果由通用术语界定的某一组分被指定以某一相对量存在，且如果这种组分还被表征为所述上述术语涵盖的具体变化形式或成员，那么这表示：不额外存在所述通用术语涵盖的其它变化形式或成员以至于所述通用术语涵盖的组分的总相对量超过指定的相对量；更优选地根本不存在所述通用术语涵盖的其它变化形式或成员。
本发明整合了益生菌和益生元的概念，从而提供合生元(synbiotics)。本发明人打开了具有免疫调节剂效应效果的细菌和组合物的新的治疗窗。微生物或组合物可在动物(例如小猪)的生命早期阶段被施用。因此，本发明涉及可有益于畜牧业的产品和组合物。由实施例证明的真正重要的观察为：在生产力方面，与抗生素治疗相比，益生菌治疗至少有相等效果，并非常可能更好(与标准抗生素治疗相比)。由于治疗的总成本以及法律压力和环境影响二者，本发明人的贡献具有巨大经济效益。
根据本发明可被使用的微生物(优选地细菌)是具有有益效果的微生物。它们优选地是乳酸菌。根据本发明甚至可使用非细菌的微生物物种，只要它们符合下列选择标准a.到c.。例如，已知一些酵母也可具有益生性能。
虽然本文所述功能参数是最重要的选择标准，但就所涉及的微生物物种而言，乳酸菌是优选的。乳酸菌(LAB)包含革兰氏阳性耐酸细菌的进化枝，它们因它们的共有代谢和生理特征相关。这些细菌被天然地发现于分解的植物和乳产品以及动物排泄物中，它们产生乳酸作为碳水化合物发酵的主要代谢终产物。由于乳酸菌在食物中的普遍存在以及它们对哺乳动物黏膜表面的健康微生物群落的贡献，它们通常被认为是安全的(GRAS状态)。乳酸菌优选地选自Lactobacillus,Leuconostoc,Pediococcus,Lactococcus,StreptococcusAerococcus,Carnobacterium,Enterococcus,Oenococcus,Sporolactobacillus,Tetragenococcus,Vagococcus,和Weisella属。Lactobacillus和/或Enterococcus可以是优选的。Lactobacillus是优选的。本文中优选的细菌优选地为革兰氏阳性和过氧化氢酶阴性。可根据本领域已知的标准技术检测细菌是否为革兰氏阳性。革兰氏染色法包括连续地用不同“着色剂”(染色剂)染色并洗涤样品以核实其为阳性或阴性。如下所述检测细菌是否为过氧化氢酶阴性：过氧化氢酶试验涉及将过氧化氢加入到培养样品或琼脂斜面上。如果目标细菌产生过氧化氢酶，那么它们将转变过氧化氢并将产生氧气。气体的产生导致形成泡沫，这些泡沫是阳性试验的指示(过氧化氢酶阳性细菌)。
本文中优选的乳酸菌优选地能够在MRS培养基，更优选地在酸化MRS琼脂中生长，如下所述。MRS培养基被创造以促进乳酸菌，尤其是Lactobacillussp的生长。其被认为抑制绝大部分革兰氏阴性细菌的生长。然而，不同于乳酸菌的其它细菌可最终在MRS上生长，因此建议或甚至必须核实菌落属于革兰氏阳性且为过氧化氢酶阴性细菌。
本文中优选的乳酸菌可以是益生细菌。“益生菌”最普遍接受的定义在1998年由Füller给出，Füller将它描述为“通过改善宿主动物的肠道微生物平衡有益影响宿主动物的活的微生物饲料补充物”。益生菌通常是活的微生物。认为不同益生菌在肠中具有不同作用，因此不同益生菌可一起作用从而提供有益效果。其它来源将益生菌定义为对人类或动物的健康益处已被证明的那些微生物。"ReportofaJointFAOWHOExpertConsultationonEvaluationofHealthandNutritionalPropertiesofProbioticsinFoodIncludingPowderMilkwithLiveLacticAcidBacteria",联合国粮农组织和世界健康组织,2001,科多巴,阿根廷中公开了益生菌的选择标准。使用活细菌的优点已被广泛描述。
近些年，“益生元”的概念被引入；益生元是不可消化的食物组分，其增强胃肠道中特定微生物的生长。“合生元”是包含至少1种益生菌和至少1种益生元的组合物。这种组合物被理解为促进有益细菌(例如益生菌)的生长。作为示例性实例，发酵的乳制品常常被认为是合生元，因为它们含有活细菌以及活细菌需要的食物来源。虽然与益生元和益生菌相关的益处是有利的，但研究者对于得出一般性结论很谨慎，因为益处因摄入的益生菌和益生元的类型和量以及特定益生菌与特定益生元的特定组合而异。因此，强效合生元基于特定益生细菌菌株与仔细选择的益生元的组合。它们能够对哺乳动物产生重要的健康益处。
特定益生菌、益生元和合生元已被建议供人类使用，益生菌的选择标准在例如"ReportofaJointFAO/WHOExpertConsultationonEvaluationofHealthandNutritionalPropertiesofProbioticsinFoodIncludingPowderMilkwithLiveLacticAcidBacteria",联合国粮农组织和世界健康组织,2001,科多巴,阿根廷中被公开。
本发明使用微生物，尤其是细菌，其具有显示出对动物(尤其是畜牧场动物)的健康益处的潜能。优选地，动物是驯养的、家养的动物或其本身不是驯养的或家养的(即野生的)但属于驯养动物的相同物种或属的动物。例如，野生猪会被包括在这个定义中，因为它属于驯养猪的相同物种。可被治疗的驯养动物的一些实例包括但不限于狗、猫和其它宠物、马、牛、鸡和其它家禽、猪、绵羊、山羊。优选地，动物是畜牧场动物，畜牧场动物包括但不限于马、牛、鸡和其它家禽、猪、绵羊、山羊。更优选地，动物来源于Suina亚目。Suina亚目(也被称为Suiformes)是哺乳动物的品系，其包括Suidae和Tayassuidae科的猪和野猪。野生的或驯养的猪可以是特别优选的。
可如下所述鉴定适用于本发明的菌株。
获得本发明所述菌株的第一步：分离单菌株
在第一步中，分离含微生物(优选地细菌)的样品。任何微生物来源可以是合适的，最广义地说，其可以是任何来源于自然的未经灭菌的样品。所述来源可以来自(驯养)动物，例如来自生命头30天的仔畜，或者来自它们的母亲。或者，来源可来自野生动物(例如野猪)，例如从捕获的野猪收集的样品。合适的来源包括来自母亲动物(例如母猪)的初乳，来自初生动物(例如小猪)的胎便样品、来自驯养或野生动物的肠壁洗涤物或天然肠乳酸菌。可使样品中所含的微生物(例如细菌)在本领域公知适合肠道微生物生长的生长培养基(例如MRS培养基)上生长。可将微生物划线，这将能够分离单菌落。可挑取单菌落并使各个菌株在合适的生长培养基(例如与最初使用的培养基相同)上进一步繁殖。
任选地，通过本领域已知方法利用革兰氏染色法检验这些单菌落的菌株(并选择革兰氏阳性菌株)，和/或如上所述检验过氧化氢酶活性的存在(并选择过氧化氢酶阴性菌株)。
获得本发明所述菌株的第二步：体外试验
为了被选择为对本发明有用，微生物菌株(优选地来源于上述第一步)必须满足下述标准中的至少一种，所述标准先在此处列出并将在下文详述：
a.抗不期望细菌的活性；
b.耐酸性；
c.胆汁盐耐受性；
项目a.到c.代表优先次序；即最期望的是满足标准a.，第二最期望的是满足标准a.和b.，最优选的是满足标准a.到c.全部。下文详述了选择标准。
(i)抗不期望细菌活性
进行抗不期望细菌的体外筛选。“不期望的”是选择下列一种或更多种的细菌：Salmonellasp.,Listeriamonocytogenes,Staphyloccocusaureus和Escherichiacoli。优选地，Salmonella物种是Salmonellaenterica，更优选地Salmonellaenterica血清型Typhimurium。
根据下述菌苔斑点试验(spotonlawntest)检验抗不期望细菌的活性。将待被检验的每种菌株的液体过夜培养物(MRS)在MRS琼脂上涂布为10μl的单个斑点并在厌氧条件下在30℃孵育24小时。孵育之后，用7ml接种有一种不期望细菌(1％；100ml培养基中1ml过夜培养物)的半固体BHI琼脂(0.7％)覆盖平板。分别的含一种待被检验的特定菌株的平板分别被一种不期望的细菌物种覆盖。每个这种试验一式三份进行。在处于或者接近不期望细菌的最佳生长温度(本文中涉及的每种不期望细菌的最佳生长温度在本领域已知)下孵育24小时之后，检验样品的抑制证据。为了达到这个目的，首先核实是否存在抑制区。如果存在，则光学测量抑制区的直径。如果抑制区显示为不精确的圆形，那么按照测量抑制区的最短直径的规则来进行抑制区的测量。最后，确定三次实验的算术平均值并核实其是否满足下述标准。
标准：为了被选择为阳性，菌株必须满足下述条件[(i),(ii),(iii),(iv)]中的至少一种：
(i)对于Salmonella，抑制区为10mm或更大，例如14mm或更大。
(ii)对于Listeriamonocytogenes，抑制区为9mm或更大，优选地10mm或更大。
(iii)对于Staphyloccocusaureus，抑制区为9mm或更大，优选地10mm或更大。
(iv)对于Escherichiacoli，抑制区为10mm或更大，例如18mm或更大。
9mm或更大包括10mm或更大，11mm或更大，12mm或更大，13mm或更大，14mm或更大，15mm或更大，16mm或更大，17mm或更大，18mm或更大，19mm或更大，20mm或更大，21mm或更大，22mm或更大，23mm或更大，24mm或更大，25mm或更大。
10mm或更大包括11mm或更大，12mm或更大，13mm或更大，14mm或更大，15mm或更大，16mm或更大，17mm或更大，18mm或更大，19mm或更大，20mm或更大，21mm或更大，22mm或更大，23mm或更大，24mm或更大，25mm或更大，26mm或更大，27mm或更大，28mm或更大，29mm或更大，30mm或更大，35mm或更大。
14mm或更大包括15mm或更大，16mm或更大，17mm或更大，18mm或更大，19mm或更大，20mm或更大，19mm或更大，20mm或更大，25mm或更大，30mm或更大。
18mm或更大包括19mm或更大，20mm或更大，21mm或更大，22mm或更大，23mm或更大，24mm或更大，25mm或更大，26mm或更大，27mm或更大，28mm或更大，29mm或更大，30mm或更大，35mm或更大。
也可以根据上述标准检验含若干菌株的组合物，为了被选择为适合本文所述的任意医疗用途，这种组合物必须满足标准[(i),(ii),(iii),(iv)]中的全部。还可以预期：可通过组合每种均满足标准(i),(ii),(iii),(iv)中的至少一种的单个微生物菌株来适当地制备这种组合物；但必须通过实验检验情况是否确实如此。
或者，可使用琼脂孔扩散试验(agarwelldiffusionassay)来测定抑制区。这个方法消除任何痕量乳酸，所述乳酸可产生于低葡萄糖MRS培养液中，其通过中和无细胞上清液进行。通过离心(5000g/20分钟/4℃)收获在厌氧条件下生长的待被检验的稳定期物种培养物，然后用1MNaOH将无细胞上清液的pH调节至6.5。将上清液过滤灭菌(0.20mm；Millipore有限公司，Hertfordshire，英国)。将无细胞上清液(30μl)加入到在琼脂平板中切出的7mm直径孔中，其中接种有[约]105菌落形成单位(CFU)/ml的(i),(ii),(iii),(iv)中所列出的不期望细菌。然后在30℃下孵育琼脂平板24小时。测量孔周围的抑制区的直径，选择标准如上文(i),(ii),(iii),(iv)中所示，将被选择为阳性的菌株必须满足其中的至少一种。
供参考的是：上述试验基于Kawai等人,2004.AppliedandEnvironmentalMicrobiology70(5):2906-2911；Dortu等人2008.LettersinAppliedMicrobiology,47:581-586；Hata等人,2009.InternationalJournalofFoodMicrobiology,37:94-99,Awaisheh2009.FoodPathogensandDisease6(9):1125-1132.)已描述的内容。
(ii)耐酸性
酸可被视为模仿胃液，如下所述检验对其的耐受性。将100μl6-8×108CFU/ml的每种菌株在MRS中的初始悬浮物悬浮在通过加入恰当量的12NHCl被酸化的酸化MRS(pH＝3.5，或者pH＝2.5)中，并在110rpm搅拌条件下在37℃孵育。在0小时、3小时和6小时时通过菌落计数(CFU/ml)检验样品。
标准：在所述培养基中的3小时孵育期间，菌株必须能够保持基本相同的生存力(与试验之前相比，试验之后至少50％，或至少55％，或至少60％，或至少70％，或至少75％，或至少80％，或至少95％的CFU，最优选地与试验之前相比，试验之后至少50％的CFU)。供参考的是：Huang等人,InternationalJournalofFoodMicrobiology91:253-260简述了类似的实验流程。
(iii)胆汁盐耐受性
模拟哺乳动物的天然小肠条件。
将100μl6-8×108CFU/ml的细菌菌株在MRS中的初始悬浮物悬浮在模拟的小肠溶液(例如pH＝8的MRS(通过加入NaOH来调节pH)和0.45％胆汁提取物(胆汁提取物，猪.B8631-100G.SIGMA-ALDRICH))中，并在110rpm搅拌条件下在37℃孵育。在1小时、2小时和4小时时通过菌落计数(CFU/ml)检验样品。
标准：暴露于模拟的小肠液(0.45％胆汁盐，任选地pH＝8)4小时之后，不损失生存力(或基本不损失生存力，即优选地50％或更多CFU，例如50％，或60％，或70％，或75％，或80％，或95％或更多CFU)。Huang等人,InternationalJournalofFoodMicrobiology91:253-260简述了类似的实验流程。
任选地，还可以检验根据以上标准a.到c.已被鉴定为阳性的菌株对上皮表面的粘附性和在动物(例如猪)胃肠道中的持久性。认为具有良好粘附性的菌株将表现最好。
任选地，额外检验根据以上标准a.到c.已被鉴定为阳性的菌株的抗生素抗性谱，例如通过最低抗生素浓度试验(VetMIC微孔板试验)和/或通过对不同抗性基因进行PCR来进行的基因型抗性试验(等人,2010.AntonievanLeeuwenhoek97:189-200)。认为无抗生素抗性的细菌(抗性基因不存在或失活/功能丢失)最适合应用于畜牧场动物。
本发明所述乳酸菌可选自下列菌株：CECT8163(AqSyn04)；CECT8165(AqSyn06)；CECT8164(AqSyn09)；CECT8166(AqSyn10),CECT8347(AqSynJ12),CECT8348(AqSynJ17),CECT8349(AqSynJ55)和CECT8350(AqSynJ59)。认为所有这些菌株都具有益生性能，因此它们在本文中可被称为益生菌。本发明的发明人根据上述选择标准分离各菌株。CECT指的是西班牙典型培养物保藏中心，而括号内的AqSyn编号可被同义地用于每种菌株，其由本发明的发明人分配给菌株的。检验每种细菌并发现它们满足上述标准a.到c.中的至少一种。当发现具有根据本发明的有益性能的其它菌株时，为了被选择为适合本发明，充分条件可以是任何这种菌株满足上述标准a.到c.中的至少一种。本发明还提供组合物，其包含至少1种(例如1种)，优选地至少2种(例如2种)，更优选地至少3种(例如3种)，更优选地至少4种(例如4种)，或者至少5种(例如5种)，或者至少6种(例如6种)，或者至少7种(例如7种)，或者至少8种(例如8种)这些菌株。认为不同菌株在肠中有不同功能，因此不同菌株可一起作用从而提供有益效果。
在一个具体实施方式中，所述组合物包含至少1种(例如1种)，优选地至少2种(例如2种)，更优选地下列3种菌株：CECT8163(AqSyn04)；CECT8164(AqSyn09)和CECT8166(AqSyn10)。在一个替代性实施方式中，所述组合物包含下列菌株：CECT8163(AqSyn04)；CECT8165(AqSyn06)；CECT8164(AqSyn09)和CECT8166(AqSyn10)。
在一个替代性实施方式中，所述组合物包含CECT8163(AqSyn04)；CECT8165(AqSyn06)；CECT8164(AqSyn09)；CECT8166(AqSyn10)；CECT8347(AqSynJ12)；CECT8348(AqSynJ17)；CECT8349(AqSynJ55)和CECT8350(AqSynJ59)中的1种或更多种，例如1、2、3、4、5、6、7、8种。
在一个替代性实施方式中，所述组合物包含CECT8347(AqSynJ12)；CECT8348(AqSynJ17)；CECT8349(AqSynJ55)和CECT8350(AqSynJ59)中的至少1种(例如1种)，优选地至少2种(例如2种)，更优选地至少3种(例如3种)，更优选地至少4种(例如4种)。
在一个替代性实施方式中，所述组合物包含下列3种菌株：CECT8347(AqSynJ12)；CECT8348(AqSynJ17)和CECT8349(AqSynJ55)。在一个替代性实施方式中，所述组合物包含下列3种菌株：CECT8348(AqSynJ17)；CECT8349(AqSynJ55)和CECT8350(AqSynJ59)。在一个替代性实施方式中，所述组合物包含下列3种菌株：CECT8347(AqSynJ2)；CECT8348(AqSynJ17)；和CECT8350(AqSynJ59)。在一个替代性实施方式中，所述组合物包含下列3种菌株：CECT8347(AqSynJ12)；CECT8349(AqSynJ55)和CECT8350(AqSynJ59)。在一个替代性实施方式中，所述组合物包含CECT8347(AqSynJ12)；CECT8348(AqSynJ17)；CECT8349(AqSynJ55)和CECT8350(AqSynJ59)的全部4种。
在本发明的一个实施方式中，组合物中所包含的至少1种菌株(例如组合物中所包含的1种和/或2种和/或3种和/或4种和/或5种和/或6种和/或7种和/或8种)以及优选地组合物中所包含的全部菌株无抗生素抗性，即它们在暴露于恰当的标准抗生素处理后不能存活。
可对所有建议菌株进行旨在评估抗生素抗性的最低抑制浓度(MIC)体外试验。被评估的抗生素可以是下列抗生素：
氨苄青霉素、万古霉素、庆大霉素、卡那霉素、链霉素、红霉素、克林霉素、四环素和氯霉素。
为了辨别敏感菌株的抗性，欧洲食品安全局(EFSA)动物饲料添加剂和产品或物质小组(FEEDAP)定义了微生物截取值。通过研究选择的抗微生物剂在属于单个分类学单元(物种或属)的细菌群体中的MIC分布来设置微生物截取值。明显偏离正常敏感群体的群体部分被归类为有抗性。"Guidanceontheassessmentofbacterialsusceptibilitytoantimicrobialsofhumanandveterinaryimportance",EFSA动物饲料添加剂和产品或物质小组(FEEDAP),欧洲食品安全局(EFSA),Parma,意大利.EFSAJournal2012；10(6):2740中定义了可被用于评估本发明所述菌株的抗生素抗性的微生物截取值。
在任何一种情况下，“包含”可被任选地理解为：存在其它细菌菌株，或不存在其它细菌菌株。即使不存在其它细菌菌株，“包含”可任选地表示：存在其它成分，即不同于细菌的任何成分。
其它成分不以任何方式被限制。在一个优选的方面，至少一种益生元化合物被包含在本发明的组合物中，即作为其它成分。在非常宽泛的概念中，益生元是所有可被益生菌代谢的那些食物来源。优选地，益生元不可或不良地被哺乳动物消化。因此，被哺乳动物摄入之后，不可消化的益生元能够通过小肠并进入大肠从而刺激这个区域中益生菌的生长。因此，益生元可担当益生菌的食物来源。认为其中许多是不可消化碳水化合物的益生元促进肠内益生菌的生长。益生元被天然地发现于例如洋葱、全谷类、香蕉、蒜、蜂蜜、韭葱、洋蓟、强化食品和饮料、以及膳食补充剂中。益生元在本领域众所周知，当在本发明中使用时，没有对益生元本身的特别限制。然而，在一些优选的实施方式中，组合物中的至少一种益生元产品选自下列化合物和组合物：不可消化的碳水化合物、β-葡聚糖、甘露寡糖、菊粉、寡果糖、半乳寡糖(GOS)、乳果糖、低聚乳果糖、半乳三糖、果寡糖(FOS)、纤维二糖、纤维糊精、环糊精、麦芽糖醇、乳糖醇、葡糖基蔗糖、维生素E或其变体(其中所述变体选自α、β、γ、δ-生育酚、生育三烯酚和生育单烯酚)。任选地，甘露寡糖和/或菊粉可以是优选的。
就不同菌株的组合物而言，任何混合比例都可以。以菌落形成单位(CFU)表示混合比例，CFU在混合各种菌株之前被适当地测定。在一个实施方式中，菌株比例可相等或可不相等，例如对于3种菌株的组合物为1：(0.1-10)：(0.1-10)，对于4种菌株的组合物为1：(0.1-10)：(0.1-10)：(0.1-10)，等等。在另一个实施方式中，菌株比例可大致或基本相等，例如对于3种菌株的组合物为1：1：1，对于4种菌株的组合物为1：1：1：1，等等。可通过混合待被并入组合物的每种菌株的各细菌量(通过菌落计数所测定的)来制备组合物。
本发明还提供组合物在人类或动物治疗方法中的用途。治疗动物、哺乳动物和/或尤其是驯养动物可以是优选的。优选地，动物来源于Suina亚目(Suina亚目是哺乳动物的品系，其包括Suidae和Tayassuidae科的猪和野猪)。野生的或驯养的猪可以是特别优选的。这还包括居住在半野生条件下的猪，即一年中大部分时间居住在户外并自己寻找它们的食物的驯养猪种。所述组合物可以是包含至少一种上述被保藏菌株的组合物。
本发明还提供组合物，其包含用于增加初生哺乳动物(优选地小猪)的重量的方法中的乳酸菌。或者，组合物用于促进初生哺乳动物(优选地小猪)生长的方法中。或者，组合物用于治疗或预防初生哺乳动物(优选地小猪)中由细菌引起的腹泻的方法中。至少1种，优选地至少2种，更优选地至少3种，例如4种或多于4种不同的乳酸菌菌株被包含在所述组合物中。如果如本段所述使用组合物，那么每种乳酸菌必须满足如上所述标准a.到c.(抗不期望细菌的活性；耐酸性；胆汁盐耐受性)中的至少一种。就标准a.而言，对所有不期望细菌(i)到(iv)都典型地观察到上文提及的最小抑制区。优选地，组合物应该满足上述标准(a.到c.)中的多个(例如a.和b.)，优选地满足全部。在所述方法中，还可以不向动物施用抗生素。益生菌组合物或合生元组合物可被用于所述方法中(即包含至少一种益生元化合物)。
本发明所述组合物包含活的微生物，优选地细菌。特别地，所述用于增加重量和/或促进生长和/或治疗或预防由细菌感染引起的腹泻的方法使用的组合物可包含细菌菌株CECT8163(AqSyn04)；CECT8165(AqSyn06)；CECT8164(AqSyn09)；CECT8166(AqSyn10)；CECT8347(AqSynJ12)；CECT8348(AqSynJ17)；CECT8349(AqSynJ55)和CECT8350(AqSynJ59)中的至少1种，例如1和/或2和/或3和/或4和/或5和/或6和/或7和/或8种。在一些实施方式中，所述用于增加重量和/或促进生长和/或治疗或预防由细菌感染引起的腹泻的方法中的所述组合物是上述特定组合物(在所述的任何实施方式中)。
所述用于增加重量和/或促进生长和/或治疗或预防由细菌感染引起的腹泻的方法中的组合物可在出生后的头14天内(更优选地在出生后的头13或12或11或10或9或8或7或6或5或4或3或2天内，最优选地在出生后的头2天内或在出生后的头1天(24小时)内)被施用。
任何施用途径都是合适的，但经口施用是优选的。最典型地，直接向每个动物的口中给予剂量以确保动物咽下所述剂量。或者，组合物还可以被提供为食物补充剂，即被加入到动物每天的饲料中。
组合物可以是任何形式，例如冻干的，液体或雾状形式。例如，如果使用冻干细菌来制造组合物，那么可例如利用无菌等渗盐水溶液或利用无菌水或利用无菌生长培养基将所述冻干细菌的初步组合物再水化，以至于可获得具有期望的总浓度(CFU/ml)的最终组合物。
为了使得便于使用，组合物可以为剂量形式(dosedform)。例如，每剂量包含107或更多，108或更多，109或更多，1010或更多，1011或更多微生物(细菌)菌落形成单位(CFU)；109或更多的剂量可以是优选的。剂量体积可在0.1-100ml，优选地0.2-50ml，更优选地0.5-20ml，更优选地1.0-10ml，更优选地1.5-5ml，甚至更优选地(基本上)2ml的范围内。具有109或更多CFU的2ml剂量可以是特别优选的。
可施用任何剂量数，本领域技术人员能够根据各个畜牧场的需要选择治疗长度。在一个具体实施方式中，向动物施用的总剂量数为10或更少，例如选自下列的任何数字：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10，或者组合任何一个这些数字(除了10)和任何一个这些数字的任何范围，前提条件是第二个数字更高(例如1-3剂量)。每个动物共2个剂量可以是特别优选的。
因此，本发明人通过任选地在生命早期阶段应用益生菌或合生元组合物提供了这种组合物的新用途。在一个优选的实施方式中，在出生后的头24小时内施用第一剂并在随后的24小时内施用第二剂。任选地，这些是仅有的2剂。在另一个选项中，接下来施用更多剂。
本发明所述组合物特别适用于治疗或预防哺乳动物中的病症，例如细菌感染或菌态不平衡。感染可以是或者包括消化道感染。这种感染可由任何细菌(例如Escherichiacoli)单独或与Clostridiumperfringens或Clostridiumdifficile相组合引起。其它诱发因素可包括Salmonella,Listeriamonocytogenes,Staphyloccocusaureus。在一些实施方式中，所述病症可选自由细菌感染(包括大肠杆菌症)引起的腹泻、Clostridiumdifficile新生腹泻、ClostridiumperfringensA和C类型。还可以治疗链球菌性脑膜炎。还可以向患腹泻或有患腹泻风险的动物施用所述组合物，即使(尚)未证明(细菌)感染是所述腹泻的诱发因素。有患腹泻风险的动物可被视为那些居住在(或出生在)最近12个月、6个月、3个月或1个月期间已观察到腹泻的地区的动物。
本发明人的结果证实了使用本发明所述产品和组合物的有利效果。如以下概念性实施例中的证据所示，死亡率百分比明显低于仅使用常规抗生素管理的其它周(参见实施例)。因此，优选地，本发明所述组合物被施用至同时未利用抗生素处理的动物。
本发明还提供微生物，优选地细菌，更优选地乳酸菌。所述乳酸菌理想地选自下列菌株：CECT8163(AqSyn04)；CECT8165(AqSyn06)；CECT8164(AqSyn09)；CECT8166(AqSyn10),CECT8347(AqSynJ12)；CECT8348(AqSynJ17)；CECT8349(AqSynJ55)和CECT8350(AqSynJ59)，它们都保藏在CECT。
本申请包含下列项目：
1.组合物，其包含用于增加初生哺乳动物(优选地小猪)的重量的方法中的一种或更多种微生物菌株，其中每种所述菌株至少满足下列条件a，更优选地条件a和b二者，最优选地全部条件a.、b.和c.：
a.具有由通过菌苔斑点试验所测定的抑制区证明的至少一种下述抗微生物活性：(i)对于Salmonella，14mm或更大抑制区，(ii)对于Listeriamonocytogenes，9mm或更大抑制区，(iii)对于Staphyloccocusaureus，9mm或更大抑制区，(iv)对于Escherichiacoli，18mm或更大抑制区；
b.在pH＝2.5下孵育3小时期间能够基本保持相同的生存力；
c.在0.45％胆汁提取物存在下且pH＝8下孵育4小时期间能够基本保持相同的生存力。
2.乳酸菌，其选自下列菌株：
a.保藏在西班牙典型培养物保藏中心的保藏号为CECT8163(AqSyn04)的菌株；
b.保藏在西班牙典型培养物保藏中心的保藏号为CECT8165(AqSyn06)的菌株；
c.保藏在西班牙典型培养物保藏中心的保藏号为CECT8164(AqSyn09)的菌株；
d.保藏在西班牙典型培养物保藏中心的保藏号为CECT8166(AqSyn10)的菌株。
3.组合物，其包含项目2细菌菌株中的至少1种，优选地至少2种，更优选地至少3种，更优选地全部。
4.项目3所述组合物，其包含下列3种菌株或由下列3种菌株组成：
i.保藏在西班牙典型培养物保藏中心的保藏号为CECT8163(AqSyn04)的菌株；
ii.保藏在西班牙典型培养物保藏中心的保藏号为CECT8164(AqSyn09)的菌株；
iii.保藏在西班牙典型培养物保藏中心的保藏号为CECT8166(AqSyn10)的菌株。
5.项目4所述组合物，其包含项目1的全部4种菌株或由项目1的全部4种菌株组成。
6.项目3-5中任一项所述组合物，其额外包含至少一种益生元产品。
7.项目6所述组合物，其中所述至少一种益生元产品选自下列化合物和组合物：β-葡聚糖、甘露寡糖、菊粉、寡果糖、半乳寡糖(GOS)、乳果糖、低聚乳果糖、半乳三糖、果寡糖(FOS)、纤维二糖、纤维糊精、环糊精、麦芽糖醇、乳糖醇、葡糖基蔗糖、维生素E或其变体(其中所述变体选自α、β、γ、δ-生育酚、生育三烯酚和生育单烯酚)，其中甘露寡糖和/或菊粉是优选的。
8.根据项目3-7中任一项所述组合物，其用于人类或动物的治疗方法中，所述人类或动物优选地是哺乳动物和/或驯养动物，更优选地是猪。
9.根据项目1被使用的组合物，其中所述组合物是根据项目3-7中任一项所述组合物。
10.根据项目1或9被使用的所述组合物，其中所述组合物在出生后的头14天内(更优选地在出生后的头13、12、11、10、8、7、6、5、4、3天内，最优选地在出生后的头2天内)被施用。
11.根据项目1或9到10中任一项被使用的所述组合物，其被用于经口施用。
12.根据项目1或9到11中任一项被使用的所述组合物，其是冻干的，液体的或雾状形式。
13.根据项目1或9到12中任一项被使用的所述组合物，其中所述组合物以剂量形式被提供，其中每剂量包含109或更多菌落形成单位(CFU)。
14.根据项目13被使用的所述组合物，其用于以2剂量被施用。
15.根据项目14被使用的所述组合物，其中第一剂在出生后的头24小时内被施用且第二剂在随后的24小时内被施用。
16.根据项目1或9到15中任一项被使用的所述组合物，其被用于治疗或预防细菌感染，例如由细菌感染(包括大肠杆菌症)引起的腹泻，Clostridiumdifficile新生腹泻，ClostridiumperfringensA和C类型。
材料和方法
MRS培养基：根据如下的获自西班牙典型培养物保藏中心(CECT；www.cect.org)的配方制备MRS培养基配方：蛋白胨10.0g，牛肉提取物10.0g，酵母提取物5.0g，葡萄糖20.0g，柠檬酸铵2.00g，乙酸钠5.00g，MgSO4.7H2O0.20g，MnSO4.H2O0.05g，K2HPO42.00g，[琼脂粉末(仅用于固体培养基)15g]，蒸馏水1L。
BHI(脑心浸液)：根据如下的获自西班牙典型培养物保藏中心(CECT；www.cect.org)的配方制备培养基配方：牛脑浸出物固体12.5g，牛心浸出物固体5.0g，示蛋白胨10.0g，葡萄糖2.0g，NaCl5.0g，HNa2PO42.5g，蒸馏水1L，[琼脂粉末(仅用于固体培养基)15g]。
抗生素处理：典型地，每个猪场用抗生素和可能地铁补充剂处理初生小猪。每个猪场对它们的动物一般有不同的“标准”处理(它们通常在出生时注射抗生素剂和铁补充剂)。在下述实验中，使用各个畜牧场的标准处理。出现腹泻、跛行、呼吸系统症状和许多其它事实时通常还偶发性地每天使用抗生素，而在小猪中没有完全确立的流程。
实施例
实施例1A:菌株来源
如下所述分离和鉴定细菌菌株。
从母猪初乳和初生小猪的胎便样品中分离CECT8163(AqSyn04)；CECT8165(AqSyn06)；CECT8164(AqSyn09)和CECT8166(AqSyn10)细菌菌株。取样发生在西班牙高卫生质量的猪场中。
使样品在DeMan,Rogosa,Sharpe(MRS)琼脂平板上在37℃下有氧和厌氧生长24小时，分离革兰氏阳性且过氧化氢酶阴性的不同形态学菌落。所有菌落都属于细菌菌株。更精确地，61个不同细菌菌株被分离。如Berthier和Ehrlich,1998.FEMSMicrobiologyLetters161:97-106所述，使用靶向16S/23SrRNA间隔区的PCR引物，通过PCR扩增每种菌株。
扩增和电泳之后，纯化并测序明显区分的条带。图1中展示了不同的PCR谱图。通过测序，菌株被分配到若干细菌物种。
1.1表征菌株
不期望受限于特定理论，认为可存在大量菌株差异。为了区分相同物种的菌株，根据制造商说明进行API50CH试验(Biomérieux,REF50300)以描述底物的碳水化合物发酵类型，其证实相同物种的菌株之间的差异。
61种菌株中，根据碳水化合物发酵类型可观察到10个不同组，从而证实了存在10种不同菌株。从每个组中取出一个作为例子并进行下述体外方法。
所述10个菌株属于Lactobacillusreuteri和Enterococcusfaecium物种。
1.Lactobacillusreuteri
2.Lactobacillusreuteri
3.Lactobacillusreuteri
4.Lactobacillusreuteri(AqSyn04)
5.Lactobacillusreuteri
6.Lactobacillusreuteri(AqSyn06)
7.Enterococcusfaecium
8.Enterococcusfaecium
9.Enterococcusfaecium(AqSyn09)
10.Enterococcusfaecium(AqSyn10)
进一步检验这10种菌株以核实它们在改善动物(尤其是猪)健康方面的用途的可行性，参加下列1.2部分。
1.2选择菌株
进一步检验如部分1.1中所述被鉴定的10种菌株。假设抗微生物和耐受性标准的组合能够帮助在之前的菌株中找到合适菌株。因此，使每种菌株单独地接受上述“体外选择试验”下的试验a.到c.中的每一种。
本发明的发明人的辛勤工作显示：上述“体外选择试验”的标准a.到c.适用于鉴定适合本发明的菌株。因此，根据所述标准a.到c.检验菌株。体外试验揭示出4种具有特别有益性能的菌株。结果列举如下。
表：体外试验结果
从上表中可以看出：所述体外试验之后，4种菌株(2种Lactobacillusreuteri(AqSyn04，AqSyn06)和2种Enterococcusfaecium(AqSyn09，AqSyn10))被鉴定[上表中未显示其余6种菌株(即不满足标准a.到c.中的至少一种的菌株)的结果]。
如实施例2A中所述，由这些菌株制备其组合物。
实施例1B:菌株来源
如下所述分离和鉴定细菌菌株。
从野猪肠的肠壁洗涤物中分离CECT8347(AqSynJ12)；CECT8348(AqSynJ17)；CECT8349(AqSynJ55)和CECT8350(AqSynJ59)细菌菌株。
使样品在DeMan,Rogosa,Sharpe(MRS)琼脂平板上在37℃下有氧和厌氧生长24小时，分离革兰氏阳性且过氧化氢酶阴性的不同形态学菌落。所有菌落都属于细菌菌株。更精确地，61个不同细菌菌株被分离。如Berthier和Ehrlich,1998.FEMSMicrobiologyLetters161:97-106所述，使用靶向16S/23SrRNA间隔区的PCR引物，通过PCR扩增每种菌株。
扩增和电泳之后，纯化并测序明显区分的条带。通过测序，菌株被分配到若干细菌物种。
1.1表征并选择菌株
1.Lactobacillusfermentum(AqSynJ12)
2.Lactobacillusreuteri(AqSynJ17)
3.Lactobacillusmucosae(AqSynJ55)
4.Lactobacillusplantarum(AqSynJ59)
遵循上述“体外选择试验”下的标准a.到c.的体外试验揭示出4种具有特别有益性能的菌株。结果列举如下。
从上表中可以看出：来自野猪的菌株满足选择标准。此外，以上鉴定的菌株无抗生素抗性。
对以上菌株(AqSynJ12、AqSynJ17、AqSynJ55、AqSynJ59)进行旨在评估抗生素抗性的最低抑制浓度(MIC)体外试验。被评估的抗生素如下：
氨苄青霉素、万古霉素、庆大霉素、卡那霉素、链霉素、红霉素、克林霉素、四环素和氯霉素。
被用于评估本发明所述菌株的抗生素抗性的微生物截取值在"Guidanceontheassessmentofbacterialsusceptibilitytoantimicrobialsofhumanandveterinaryimportance",EFSA动物饲料添加剂和产品或物质小组(FEEDAP),欧洲食品安全局(EFSA),Parma,意大利.EFSAJournal2012；10(6):2740中被定义。
如实施例2B中所述，由这些菌株制备其组合物(组合物D和E)。
实施例2A:制备根据本发明的益生菌组合物和根据本发明的合生元组合物
通过发酵使菌株AqSyn04、AqSyn06、AqSyn09、AqSyn10中的每一种在MRS培养液中生长，收获并冻干。通过菌落计数核实终产物的生存力。通过任选地加入益生元化合物来制备含这些菌株中全部4种的组合物。制备下列组合物：
组合物A：(2ml中2.5×108CFU每种菌株)
组分 每2ml剂的量 AqSyn04Lactobacillus reuteri 0.0035g AqSyn06 Lactobacillus reuteri 0.0035g
AqSyn09 Lactobacillus fermentum 0.0016g AqSyn10Lactobacillus fermentum 0.00029g
所有菌株均以冻干形式被使用。组合物A可被视为益生菌。
组合物B：(2ml中2.5×108CFU每种菌株)
组分 每2ml剂的量(g) AqSyn04Lactobacillus reuteri 0.0035g AqSyn06 Lactobacillus reuteri 0.0035g AqSyn09 Lactobacillus fermentum 0.0016g AqSyn10Lactobacillus fermentum 0.00029g 菊粉 0.01 β-葡聚糖和MOS 0.01 脱脂乳粉 0.02
所有菌株均以冻干形式被使用。组合物B可被视为合生元。
此外，还制备组合物C，其仅含有4种细菌菌株中的3种(AqSyn04、AqSyn09、AqSyn10)，如下所述。
组合物C：(2ml中3.3×108CFU每种菌株)
组分 每2ml剂的量(g) AqSyn04Lactobacillus reuteri 0.0047g AqSyn09 Lactobacillus fermentum 0.0021g AqSyn10Lactobacillus fermentum 0.00038g 菊粉 0.01 β-葡聚糖和MOS 0.01 脱脂乳粉 0.02
所有菌株均以冻干形式被使用。组合物C可被视为合生元。
通过混合相同细菌量(通过菌落计数所判断(以上显示以g计的各个值))的将被并入组合物中的每种菌株来制备组合物，加入显示的其它成分(例如组合物B、组合物C)，然后用等渗盐水溶液将由此获得的各种组合物再水化，从而获得2ml剂中含109CFU(其中所含所有菌株的总数)的最终组合物。
实施例2B:制备根据本发明的益生菌组合物和根据本发明的合生元组合物
通过发酵使菌株AqSynJ12、AqSynJ17、AqSynJ55、AqSynJ59中的每一种在MRS培养液中生长，收获并冻干。通过菌落计数核实终产物的生存力。通过任选地加入益生元化合物来制备含这些菌株中全部4种的组合物。制备下列组合物：
组合物D：(2ml中2.5×108CFU每种菌株)
组分 每2ml剂的量 AqSynJ12Lactobacillus fermentum 0.173g AqSynJ17Lactobacillus reuteri 0.04g AqSynJ55Lactobacillus mucosae 0.008g AqSynJ59Lactobacillusplantarum 0.002g
所有菌株均以冻干形式被使用。组合物D可被视为益生菌。
组合物E：(2ml中25×108CFU每种菌株)
组分 每2ml剂的量(g) AqSynJ12 Lactobacillus fermentum 0.173g AqSynJ17 Lactobacillus reuteri 0.04g AqSynJ55 Lactobacillus mucosae 0.008g AqSynJ59 Lactobacillus plantarum 0.002g 菊粉 0.01 β-葡聚糖和MOS 0.01 脱脂乳粉 0.02
所有菌株均以冻干形式被使用。组合物E可被视为合生元。
实施例3:施用至小猪而不施用抗生素(第一概念性证明)
第一概念性证明在位于萨莫拉省(西班牙)的邻近猪场中进行，该猪场具有2400只母猪并初生小猪中有慢性腹泻问题。7窝(78只小猪)接受组合物A(参见实施例2A)，另外7窝(81只小猪)被保留为对照，如下所述。
被施用组合物A的小猪从出生至生命第14天每天接受一剂(参见实施例2A)，而不用抗生素处理。
对照组的处理为IM注射1ml含150mg阿莫西林和40,000UI庆大霉素的市售产品。这个组中的腹泻小猪在它们显示出腹泻的天内每天接受一次这种处理。
这个第一概念性证明的结果显得相当显著，其显示出本发明所述处理出乎意料的疗效。从这些结果看，本发明人认为：不仅在病原体菌群中有预期疗效，而且还刺激小猪的天然免疫系统。不想受限于特定理论，可以理解：被施用的组合物直接影响消化病原体而且很可能直接影响小猪抵抗这些消化感染的天然应答。
实施例4:以不同的剂量方案施用至小猪(第二概念性证明)
这个实验在萨莫拉省(西班牙)与实施例3相同的猪场中进行。简而言之，本发明人旨在证明组合物A对初生小猪的固有免疫系统的影响。还研究了在小猪生命早期不同阶段的施用。应该理解：在小猪生命早期，动物的菌群仍未成熟。
7窝(65只小猪)在出生日被给予组合物A，第二组7窝(84只小猪)在第一和第二生命日接受组合物A(任何抗生素应用)，第三组7窝(80只小猪)被作为对照，如实施例3中所述。重要的是要注意：仅对照组接受抗生素处理，而接受组合物A的组无任何抗生素应用。本发明人证明了可达到与对照组相似的增重。
结果显示：施用2剂是有益的。特别地，在小猪出生后的极早期阶段双次应用能够在不使用抗生素的条件下保护动物抵抗消化疾病，并可降低死亡率。
此时的进一步重要观察为：在生产力方面，被检验的益生菌施用与抗生素处理至少有相等效果。
实施例5:施用至小猪以及对免疫系统的影响(第三概念性证明)
第三概念性证明在位于穆尔西亚省的畜牧场中进行。该畜牧场具有2400只母猪且于刚出生的小猪中存在腹泻问题。这些消化问题被诊断为由Escherichiacoli和Clostridiumdifficile引起。
这个畜牧场中对小猪的惯常处理(这个实验中的对照小猪)为：刚出生后注射100mg托拉霉素。之后，在哺乳期腹泻的小猪还在腹泻的天内每天一次用螺旋霉素(25mg/kg活重)和黏菌素(5mg/kg活重)经口处理。
在这个实验中，在29窝中2次施用组合物A，即(1)刚出生后和(2)在第二生命日，而没有抗生素处理。34窝按照惯常的畜牧场程序被处理。
表：断奶前的生产力指标
这次概念性证明证实了可以改善对初生小猪早期消化紊乱的管理，特别是不使用抗生素。
实施例6:施用至小猪以及对免疫系统的影响(第四概念性证明)
接下来的概念性证明旨在在畜牧场例行程序中检验产品常规表现。这个实验发生在韦斯卡区域中具有5500只母猪的猪场。由于逻辑事实，不可能保留对照组。给予在某一周(2012年的第13周)出生的所有小猪组合物B，将其与实验之前和之后周的生产力指标进行比较。在这个畜牧场中，
腹泻小猪的惯常处理是：在3天期间，每天施用1ml含100mg氨苄青霉素和250000IU甲烷磺酸钠粘菌素的市售产品。
生产指标结果；在第13周施用组合物B。
(A)80％初产母猪(照例而不用组合物B处理)和一些经产母猪中观察到了腹泻情况。小猪3-5天大。所有腹泻情况在不用抗生素处理的条件下消失。
本发明人的结果证实了使用本发明所述产品和组合物的有利效果。死亡率百分比明显低于仅利用例行抗生素管理的其它周。
实施例7
使用组合物E的体内实验在萨拉戈萨(西班牙)中具有1200只高产母猪(每次分娩平均14只活产小猪)且每周56次出生(每周784只小猪)的畜牧场中进行，该畜牧场旨在使小猪生长至20kg然后供应给其它畜牧场，其具有生命小于1周的小猪在哺乳期腹泻的周期性问题。畜牧工人以标准方式管理小猪并在初生时和生命的第二天向所有窝施用产品(上述组合物E)。利用组合物E处理的结果与利用组合物A、B和C获得的那些结果相似。
打印出(原件为电子表格)
(本页不是国际申请的一部分且不视为国际申请的页)