相关申请的交叉引用
本申请涉及于2005年7月1日提交的美国临时申请第60/695,546号以及于2005年12月6日提交的美国临时申请60/742,972并要求它们的优先权。
技术领域
本发明涉及抗微生物组合物，这些组合物可以在装置，并且尤其是医疗装置如导管上或装置中抑制生物薄膜包埋的微生物(embedded microorganism)的生长和增殖。
背景技术
尿道感染(UTI)是最常见的医院获得性感染，占所有医院内感染的高达40％。大多数UTI病例与泌尿导管(urinary catheter)的使用有关，包括经尿道福利导管、耻骨上导管、以及肾造口(nephrostomy)导管。这些泌尿导管被插入到各种群体，包括老人、卒中患者、脊髓损伤患者、术后患者以及那些患有梗阻性尿路病的患者。虽然遵守用于插入和维持泌尿导管的无菌导线(sterileguideline)，但与导管相关的UTI仍然是一个主要问题。例如，据估计，几乎四分之一的住院脊髓损伤患者在他们的住院期间发展了症状性UTI。在与导管相关的UTI的病例中，革兰氏阴性菌占几乎60-70％，肠球菌占约25％，以及念珠菌菌种占约10％。此外，通过提供静脉通路，包括血管导管(脉管导管)的留置医疗装置在治疗住院患者方面正变成基本的。源自这些导管以及其它类型的医疗装置，如腹膜导管、心血管装置、矫形植入物、以及其它修复装置(假体装置)的益处经常被感染性并发症所抵消(offset)。引起这些感染性并发症的最常见的生物是表皮葡萄球菌和金黄色葡萄球菌。在血管导管的情况下，上述两种生物占所有感染性生物的几乎70-80％，其中表皮葡萄球菌是最常见的生物。白色念珠菌，一种真菌剂，占导管感染的10-15％。
近年来，人们已作出很大努力来在装置表面或装置内螯合(sequester)抗微生物和抗生素，其中所述装置然后被放置在脉管系统或尿道中，用来降低与装置相关的感染的发生率。这些抗微生物剂具有不同的化学组成，并且可以包括阳离子多肽(鱼精蛋白、聚赖氨酸、溶菌酶等)、防腐剂(氯己定、三氯生等)、表面活性剂(十二烷基硫酸钠、吐温-80、表面活素等)、季铵化合物(苯扎氯铵、三(十二烷基)甲基氯化铵、二癸基二甲基氯化铵等)、银离子/化合物、以及呋喃西林(硝基糖腙)。
抗微生物导管制备的主要方法包括浸没(浸入)或冲洗、涂层(涂敷)、药物-聚合物轭合物以及浸渍(Tunney et al.，Rev.Med.Microbiol.，7(4)：195-205，1996)。在临床设置中，可以通过紧接着在放置之前的浸没来处理适宜的导管，在某些情况下其可以向临床医师提供灵活性和控制。许多研究已检查了涂布有抗微生物剂的导管的临床效力。涂布有二甲胺四环素和EDTA的聚氨酯导管呈现出降低复发性与血管导管相关的感染的潜力(Raad et al.，Clin.Infect.Dis.，25：149-151，1997)。二甲胺四环素和利福平涂层已显示出可显著地降低与导管相关的感染的危险(Raad et al.，Crit.Care Med.，26：219-224，1998)。涂布在泌尿导管上的二甲胺四环素已显示出可以提供一定的保护以防止移殖(集群，colonization)(Darouiche et al.，Int.J.Antimicrob.Ag.，8：243-247，1997)。Johnson等人描述了商业上可获得的呋喃西林涂布的硅酮导管的显著的体外抗微生物活性(Antimicrob.Agents Chemother.，43：2990-2995，1999)。已广泛研究了用于医疗装置的作为抗微生物涂层的含银化合物的抗菌活性。连同氯己定一起使用的磺胺嘧啶银盐(烧伤宁)作为中央静脉导管涂层已受到特别的关注(Stickler，Curr.Opin.Infect.Dis.，13：389-393，2000；Darouiche et al.，New Eng.J.Med.，340：1-8，1999)。
通过浸没或涂布技术进入医疗装置的抗微生物剂的负荷具有相对简单的优点。然而，可以加入的有限质量的药物对于延长的抗微生物效应可能是不足的，并且在装置的临床插入后药物的释放是快速和相对不受控制的。减少这些问题的一种方式是通过在聚合物合成阶段或在装置制造阶段将抗微生物剂直接加入到医疗装置的聚合物基质中。已将利福平加入硅酮，以试图防止脑脊液分流的感染，并取得一定成功(Schierholz et al.，Biomaterials，18：839-844，1997)。也已将碘加入到医疗装置生物材料中。已对冠状动脉支架(coronary stent)进行了改进以具有抗血栓发生和抗菌活性，其中通过将肝素共价附着于硅酮，其后在结合于肝素化表面的交联胶原中截留抗生素(Fallgren et al.，Zentralbl.Bakteriol.，287：19-31，1998)。
Welle等人披露了用于制备冲洗医疗装置的试剂盒的方法(美国专利第6,187,768号)。该试剂盒包括包含抗生素、抗凝剂(硫酸鱼精蛋白(鱼精蛋白硫酸盐))以及抗血栓剂或螯合剂的溶液，其用于防止由在导管中生长的细菌所引起的感染。
Raad等人披露了，二甲胺四环素和EDTA的混合物的药物组合物用于保持导管端口的开发(美国专利第5,362,754号)。最近，Raad和Sheretz进一步披露了，有效的导管冲洗溶液可以制备自非糖肽抗微生物剂、抗血栓剂、抗凝剂、以及螯合剂，其选自由EDTA、EGTA以及DTPA组成的组(美国专利第5,688,516号)。
Welle等人教导将许多抗凝剂用于医疗装置，包括硫酸鱼精蛋白(美国专利第6,187,768号)。硫酸鱼精蛋白和某些抗生素的结合已显示出对与导管相关的细菌如铜绿假单胞菌和表皮葡萄球菌具有协同效应(Soboh et al.，Antimicrob.Agents.Chemother.，39：l281-1286，1995；Richards et a1.，ASAIO Trans，36：296-299)。Kim等人(Am.J.Kidney Dis.，39：165-173，2002)开发了一种抗微生物浸渍的腹膜透析导管，其中用在聚合物基质中的氯己定、磺胺嘧啶银盐以及三氯生浸渍套囊和管路。Fox等披露了具有协同组合物的医疗装置，其中所述组合物包含银盐和氯己定(美国专利第5,019,096号)。Soloman等披露了包含氯己定的抗感染医疗制品(美国专利第6,261,271号)。Modak等，在美国专利第6,706,024号和第6,843,784号中，披露了包含氯己定、三氯生、以及银化合物的医疗装置。
发明内容
本发明的一种具体实施方式提供了一种用于在装置上防止生物薄膜包埋的微生物的生长和增殖的组合物，所述组合物包括：(a)阳离子多肽以及(b)双胍(bis-guanide)或其盐。
在本发明的一种具体实施方式中，阳离子多肽介于约12.5mg/ml至约100mg/ml所述组合物之间。
在本发明的另一种具体实施方式中，双胍介于约100mg/ml至约400mg/ml所述组合物之间。
在一种进一步的具体实施方式中，根据本发明的组合物可有效防止生物薄膜包埋的细菌的生长和增殖。
细菌可以是选自由大肠杆菌、奇异变形菌(奇异变形杆菌)、肺炎克雷伯氏菌、铜绿假单胞菌、奥克西托克雷伯氏菌(产酸克雷伯氏菌，Klebsiella oxytoca)、斯氏普罗威登斯菌、以及粘质沙雷氏菌组成的组中的革兰氏阴性菌。
细菌可以是选自由粪肠球菌、耐万古霉素肠球菌(万古霉素抗药性肠球菌)(VRE)、绿色链球菌(Streptococcus viridans)、表皮葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、以及腐生葡萄球菌组成的组中的革兰氏阳性菌。
在另一种具体实施方式中，所述组合物可有效防止生物薄膜包埋的真菌的生长和增殖，该真菌可以包括白色念珠菌。
在进一步的具体实施方式中，阳离子多肽选自由硫酸鱼精蛋白、防卫素、乳过氧化物酶、以及溶菌酶组成的组。
在又一具体实施方式中，双胍选自由氯己定、阿来西定、以及多聚双胍组成的组。
在又一具体实施方式中，双胍是氯己定盐。
氯己定盐可以选自由二葡萄糖酸氯己定、二乙酸氯己定、以及二盐酸氯己定组成的组。
在进一步的具体实施方式中，阳离子多肽是硫酸鱼精蛋白而双胍是氯己定盐。
在又一具体实施方式中，组合物包含约100mg/ml的硫酸鱼精蛋白和约400mg/ml氯己定盐。
在又一具体实施方式中，根据本发明的组合物进一步包含一种或多种组分，其选自由水；粘合、结合或偶联(偶合)剂或交联剂；双酚；季铵化合物；马来酰亚胺；抗生素；以及pH调节剂组成的组。
在另一个方面，本发明提供了一种制备装置的方法，包括用根据本发明的组合物处理装置的至少一个表面。
在进一步的方面，本发明提供了一种制备装置的方法，包括将根据本发明的组合物加入到用来形成装置的聚合物中。
在另一个方面，本发明提供了一种制备装置的方法，包括将根据本发明的组合物涂布到装置的至少一个表面上。
在一种具体实施方式中，所述组合物包括有效量的硫酸鱼精蛋白和氯己定盐。
在本发明的一种具体实施方式中，装置是医疗装置。
在本发明的另一种具体实施方式中，装置可以是导管。
导管可以是一种留置导管(indwelling catheter)，该留置导管选自由中央静脉导管、外周静脉内导管、动脉导管、血液透析导管、脐导管(脐带导管)、皮前非隧道式硅酮导管(precutaneousnontunneled silicone catheter)、成套隧道式中央静脉导管(cuffedtunneled central venous catheter)、以及皮下中央静脉端口(subcutaneous central venous port)组成的组。
导管可以是选自由泌尿导管、腹膜导管、以及中央静脉导管组成的组的留置导管。
在另一种具体实施方式中，装置可以选自由导管、起搏器、人造心脏瓣膜(人工心瓣)、人造关节、语音假体(voice prostheses)、接触镜(contact lenses)、以及宫内避孕器组成的组。
在进一步的方面，本发明提供了一种用于防止与装置相关的感染的组合物，所述组合物包括：(a)阳离子多肽以及(b)双胍或其盐。
在进一步的方面，本发明提供了一种制备装置的方法，包括用(a)阳离子多肽以及(b)双胍或其盐处理装置的至少一个表面。
在进一步的方面，本发明提供了一种组合物，该组合物包括(a)阳离子多肽、(b)双胍或其盐、以及(c)医疗装置，在该装置上涂布、加入所述阳离子多肽以及所述双胍或其盐，或用所述阳离子多肽以及所述双胍或其盐处理所述医疗装置。
在进一步的方面，本发明提供了本文描述的任何组合物在制备用于植入哺乳动物的医疗装置中的应用。
附图说明
图1是条线图(柱状图)，其图解说明了阴性对照(NC)(没有活性组分的溶液)、50μg/ml硫酸鱼精蛋白(PS)、12.5μg/ml氯己定盐(CHX)、以及50μg/ml硫酸鱼精蛋白和12.5μg/ml氯己定盐的结合(PS+CHX)对生物薄膜包埋的大肠杆菌的数目(CFU)的影响。
图2是条线图，其图解说明了阴性对照(NC)、25μg/ml硫酸鱼精蛋白(PS)、25μg/ml氯己定盐(CHX)、以及25μg/ml硫酸鱼精蛋白和25μg/ml氯己定盐的结合(PS+CHX)对生物薄膜包埋的铜绿假单胞菌的数目(CFU)的影响。
图3是条线图，其图解说明了阴性对照、12.5μg/ml硫酸鱼精蛋白(PS)、12.5μg/ml氯己定盐(CHX)、以及12.5μg/ml硫酸鱼精蛋白和12.5μg/ml氯己定盐的结合(PS+CHX)对生物薄膜包埋的表皮葡萄球菌的数目(CFU)的增强的影响。
图4是条线图，其图解说明了涂布有100mg/ml硫酸鱼精蛋白(PS)、100mg/ml氯己定盐(CHX)、以及100mg/ml硫酸鱼精蛋白和100mg/ml氯己定盐的结合(PS+CHX)的硅酮导管对大肠杆菌的抗粘附效应(作用)。
图5是条线图，其图解说明了涂布有100mg/ml硫酸鱼精蛋白(PS)、100mg/ml氯己定盐(CHX)、以及100mg/ml硫酸鱼精蛋白和100mg/ml氯己定盐的结合(PS+CHX)的硅酮导管对铜绿假单胞菌的增强的抗粘附效应。
图6是条线图，其图解说明了涂布有100mg/ml硫酸鱼精蛋白(PS)、100mg/ml氯己定盐(CHX)、以及100mg/ml硫酸鱼精蛋白和100mg/ml氯己定盐的结合(PS+CHX)的硅酮导管对表皮葡萄球菌的抗粘附效应。
图7是线图，其图解说明了100mg/ml硫酸鱼精蛋白(PS)和400mg/ml氯己定盐(CHX)涂布的硅酮导管相对于大肠杆菌的抗粘附活性的耐久性。
图8是线图，其图解说明了100mg/ml硫酸鱼精蛋白(PS)和400mg/ml氯己定盐(CHX)涂布的硅酮导管相对于表皮葡萄球菌的抗粘附活性的耐久性。
具体实施方式
包含至少一种阳离子多肽和至少一种双胍的组合物具有增强的抗微生物活性。尤其是，这样的化合物可有效防止微生物的生长和增殖，该微生物包括包埋在生物薄膜中的细菌和真菌物种。仅需要少量的每一种这些化合物就可以产生有效的抗微生物组合物，这证明了增强的抗微生物活性。所需要的化合物的总量小于任何这些化合物单独使用时所需要的量。尤其是，可以使用少量的阳离子多肽，其是生物上可接受的；以及少量的双胍，其在较低浓度是生物上可接受的并且是有效的抗微生物药。
因此，本发明的一种具体实施方式提供了用于防止生物薄膜包埋的微生物的生长和增殖的组合物，所述组合物包括(a)阳离子多肽以及(b)双胍或其盐。
本发明的一种具体实施方式还提供了这样的组合物，通过用所述组合物涂布所述医疗装置或导管来防止由植入的医疗装置或导管所引起或加剧的感染，如由留置导管所引起的尿道感染，这样的组合物包括(a)阳离子多肽以及(b)双胍或其盐。
为了有效，本发明的协同作用的抗微生物组合物需要显著少量的活性组分(和过去使用的活性组分量相比)。根据本发明的组合物可以具有一些性能，这些性能包括分开的化合物的性能但在应用效力和范围方面超过它们。活性化合物或组分的极低水平，因此增加的效力，使得本发明的具体实施方式非常合乎要求并且制备相对经济，虽然如果在某些应用中需要的话，可以使用更高浓度的这些化合物。使用这些组合物的进一步的优点是可有效防止生物薄膜包埋的细菌和真菌的生长，并且尤其是移植于(colonize)医疗装置如导管的细菌和真菌物种。可用于制备本发明的组合物的阳离子多肽的实例包括但不限于硫酸鱼精蛋白、防卫素、乳过氧化物酶、以及溶菌酶。在本发明的一种优选具体实施方式中，阳离子多肽是硫酸鱼精蛋白。
包括在组合物中的阳离子多肽的量优选在约10至200mg/ml之间并且更优选在约12.5至100mg/ml之间。此范围的上端可以用来制备浓缩产品，其可以在使用前加以稀释。
可用于制备本发明的组合物的双胍的实例包括但不限于氯己定、阿来西定、或多聚双胍。双胍可以具有适当的盐的形式。双胍盐是众所周知的。在本发明的一种优选具体实施方式中，使用氯己定盐，并且更优选使用二葡萄糖酸氯己定、二乙酸氯己定、或二盐酸氯己定来制备组合物。
包括在组合物中的双胍的量优选在约10至400mg/ml之间并且优选在约100至400mg/ml之间。此范围的上端可以用来制备浓缩产物，其可以在使用前加以稀释。
更高浓度的化合物可以用于某些应用，其取决于要处理的靶细菌和装置。利用已知的方法可以容易地确定适宜的工作浓度。
在本发明的一种优选具体实施方式中，该组合物包括作为阳离子多肽的硫酸鱼精蛋白以及作为双胍的氯己定盐。在进一步的优选具体实施方式中，该组合物包括约100mg/ml的硫酸鱼精蛋白和约400mg/ml的氯己定盐。
可以利用已知的方法来制备本发明的组合物。一般地，将组分溶解在适宜的溶剂中，如水、甘油、有机酸、以及其它适宜的溶剂。
本发明的组合物可以包括任何数目的众所周知的活性组分和基础材料(base material)。这些组合物可以进一步包括一些组分，如但不限于：适宜的溶剂如水；抗生素如抗菌剂和抗真菌剂；粘合、结合、或偶联剂，或交联剂；或pH调节剂。
本发明的组合物可以进一步包括另外的抗微生物组分如双酚、N-取代的马来酰亚胺、以及季铵化合物。可用于制备本发明的组合物的双酚的实例包括但不限于三氯生和六氯酚。可用于制备本发明的组合物的N-马来酰亚胺的实例包括但不限于N-乙基马来酰亚胺(NEM)、5，5-二硫代双-(2-硝基苯甲酸)(DTNB)、N-苯基马来酰亚胺(PheM)、N-(1-芘基)马来酰亚胺(PyrM)、萘-1，5-二马来酰亚胺(NDM)、N，N′-(1，2-亚苯基)二马来酰亚胺(oPDM)、N，N′-1，4-亚苯基二马来酰亚胺(pPDM)、N，N′-1，3-亚苯基二马来酰亚胺(mPDM)、以及1，1-(亚甲基二-4，1-亚苯基)双马来酰亚胺(BM)。可用于制备本发明的组合物的季铵化合物的实例包括但不限于苯扎氯铵、三(十二烷基)甲基氯化铵、以及二癸基二甲基氯化铵。
所述组合物的其它可能的组分包括但不限于缓冲溶液、磷酸缓冲盐溶液、盐水、聚乙烯化合物(polyvinyl)、聚乙烯、聚氨酯、聚丙烯、硅酮(例如，硅酮lassoers以及硅酮粘合剂)、聚羧酸(例如，聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸、聚马来酸、聚(马来酸单酯)、聚天冬氨酸、聚谷氨酸、藻朊酸(aginic acid)或果胶酯酸(pectimic aicd))、聚羧酸酸酐(例如，聚马来酐、聚甲基丙烯酸酐或聚丙烯酸酐)、聚胺、聚胺离子(例如，聚乙烯亚胺、聚乙烯胺、聚赖氨酸、聚(甲基丙烯酸二烷基胺乙酯)、聚(二烷基氨基甲基苯乙烯)或聚(乙烯基吡啶))、聚铵离子(例如，聚(2-甲基丙烯酰氧乙基三烷基铵离子)、聚(乙烯基苄基三烷基铵离子)、聚(N，N-烷基吡啶鎓离子)或聚(二烷基亚辛基铵离子))以及多磺酸酯(例如，聚(乙烯基磺酸酯)或聚(苯乙烯磺酸酯))、火棉胶、尼龙、橡胶、塑料、聚酯、DacronTM(涤纶TM)(聚对苯二甲酸乙二酯)、TelfonTM(聚四氟乙烯)、胶乳、及其衍生物、弹性体以及涤纶(用明胶密封)、胶原或白蛋白、氰基丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯、具有多孔隔离膜的纸、粘合剂，例如，热熔性粘合剂、溶剂型胶粘剂(溶剂基粘合剂，solvent based adhesive)、以及粘合水凝胶、织物、以及交联和非交联的水凝胶、以及任何其它聚合物材料，其促进活性组分的分散以及生物薄膜渗透涂层附着于医疗装置的至少一个表面。也可以使用包含作为以上例举的聚合物的组分的单体的线性共聚物、交联共聚物、接枝聚合物、以及嵌段聚合物。
利用根据本发明的组合物可以抑制的生物薄膜包埋的细菌的实例包括革兰氏阴性菌例如但不限于：大肠杆菌、奇异变形菌、肺炎克雷伯氏菌、铜绿假单胞菌、奥克西托克雷伯氏菌、斯氏普罗威登斯菌、或粘质沙雷氏菌，以及革兰氏阳性菌例如但不限于：粪肠球菌、耐万古霉素肠球菌(VRE)、绿色链球菌、表皮葡萄球菌、以及金黄色葡萄球菌或腐生葡萄球菌。通常发现这些细菌伴随包括导管的医疗装置。
根据本发明的组合物也可以用来抑制生物薄膜包埋的真菌如白色念珠菌、近平滑念珠菌、以及产朊假丝酵母(Candida utilis)的生长和增殖。在另一个方面，本发明提供了一种制备装置的方法，包括用根据本发明的阳离子多肽和双胍组合物处理装置的至少一个表面。在本发明的一种优选具体实施方式中，用来制备装置的组合物包括有效量的作为阳离子多肽的硫酸鱼精蛋白以及作为双胍的氯己定盐。
术语“有效的”是指足够量的活性组分以基本上防止生物薄膜包埋的微生物在涂布有具体的组合物的医疗装置的至少一个表面上的生长或增殖，以及足够量的活性组分以基本上渗透、或破裂在医疗装置的至少一个表面上的生物薄膜，从而促进活性组分、抗微生物剂、和/或抗真菌剂进入包埋在生物薄膜中的微生物，因此，从经具体的组合物溶液处理的医疗装置的至少一个表面上除去基本上所有的微生物。总量将因每种活性组分而变化并取决于已知的因素如药物特性、医疗装置的类型、生物薄膜包埋的微生物污染的程度、以及用途和应用的时间长度。
可以利用本发明的组合物处理的装置的实例包括医疗装置如管路和其它医疗装置，如导管、起搏器、人造心脏瓣膜、人造关节、语音假体、接触镜、以及宫内避孕器。
医疗装置包括易处置的或永久的或留置导管(例如，中央静脉导管、透析导管、长期隧道式中央静脉导管、短期中央静脉导管、外周插入中央导管、外周静脉导管、肺动脉斯-甘导管、泌尿导管、以及腹膜导管)、长期泌尿装置、组织结合泌尿装置、血管移植物(人造血管)、血管导管端口、伤口引流管、心室导管、脑积水分流心瓣膜、心脏辅助装置(例如，左心室辅助装置)、起搏器囊(pacemaker capsule)、失禁装置、阴茎植入物、小或暂时关节置换、泌尿扩张器、插管(套管)、弹性体、水凝胶、外科手术器械、牙科器械、管路，如静脉内管、呼吸管、牙科水管线(dental water line)、牙引流管(牙科引流管)、以及饲管、织物、纸、指示条(例如，纸指示条或塑料指示条)、粘合剂(例如，水凝胶粘合剂、热熔性粘合剂、或溶剂型胶粘剂)、绷带、矫形植入物、以及在医疗领域使用的任何其它装置。
医疗装置还包括任何可以插入或植入人类或其它动物、或放置在插入或植入部位(如靠近插入或植入部位的皮肤)的装置，并且其包括至少一个对生物薄膜包埋的微生物的移殖敏感的表面。
用于本发明的医疗装置包括在手术室、急诊室、病房、诊所、以及浴室中的设备的表面。
可植入医疗装置包括矫形植入物，利用内镜检查术可以检查矫形植入物的由生物薄膜包埋的微生物所引起的污染或感染。可插入的医疗装置包括导管和分流器，其可以在无需侵入性技术如内镜检查术的情况下加以检查。
医疗装置可以由任何适宜的金属材料或非金属材料形成。金属材料的实例包括但不限于钛、不锈钢、以及其衍生物或组合。非金属材料的实例包括但不限于热塑性材料或聚合物材料如橡胶、塑料、聚酯、聚乙烯、聚氨酯、硅酮、GortexTM(聚四氟乙烯)、DacronTM(聚对苯二甲酸乙二酯)、TelfonTM(聚四氟乙烯)、胶乳、弹性体、以及用明胶密封的DacronTM、胶原、或白蛋白、以及其衍生物或组合。
在一种优选的具体实施方式中，处理医疗装置的至少一个表面的方法包括用根据本发明的组合物接触医疗装置。如在本文中所使用的，术语“接触”包括但不限于涂布、喷雾、浸泡、漂洗、冲洗、浸入、以及洗涤。用组合物接触医疗装置一段足够的时间以从医疗装置的经处理的表面上基本上除去所有生物薄膜包埋的微生物。
在一种更优选的具体实施方式中，将医疗装置浸入组合物至少5分钟。可替换地，可以用组合物冲洗医疗装置。在医疗装置为管路如牙引流管的情况下，可以将组合物注入牙引流管并夹住管路的两端以便将组合物保留在管路的腔(lumen)内。然后使管路保持充满组合物一段足够的时间，以从医疗装置的至少一个表面基本上除去所有的微生物，通常时间为至少约1分钟至约48小时。可替换地，可以通过将组合物注入管路的腔中一段足够的时间来冲洗管路，以防止所有生物薄膜包埋的微生物的显著的生长。当希望或必要时，可以变化组合物中的活性组分的浓度，以减少组合物与医疗装置接触的时间。
在用于处理装置表面的方法的另一种具体实施方式中，本发明的组合物还可以包括有机溶剂、医疗装置材料渗透剂，或将碱化剂(alkalinizing agent)加入组合物，以增强医疗装置的表面与组合物的反应性。有机溶剂、医疗装置材料渗透剂、和/或碱化剂是这样的试剂，其优选促进组合物粘附于医疗装置的至少一个表面。
另一个方面提供了一种将本发明的组合物涂布到装置的至少一个表面上的方法。优选地，该装置是医疗装置。概括地说，用于涂布医疗装置的方法包括以下步骤：提供医疗装置；提供或形成组合物涂层；以及将足够量的组合物涂层施加到医疗装置的至少一个表面上，以基本上防止生物薄膜包埋的微生物在医疗装置的至少一个表面上的生长或增殖。在一种特定的具体实施方式中，用于涂布医疗装置的方法包括以下步骤：形成本发明的有效浓度的组合物，用于激活活性组分，从而基本上防止微生物在医疗装置的至少一个表面上的生长或增殖，其中本发明的组合物是通过使活性组分和基础材料相结合而形成的。然后在一定条件下用本发明的组合物接触医疗装置的至少一个表面，其中本发明的组合物覆盖医疗装置的至少一个表面。术语“接触”进一步包括但不限于：浸渍、复合、混合、结合、涂布、喷雾以及浸涂。
在用于涂布医疗装置的方法的另一种具体实施方式中，优选通过在室温下使活性组分和基础材料相结合并混合组合物足够的时间，以在将组合物施加于装置的表面之前均匀地将活性剂分散在组合物中来形成组合物涂层。医疗装置可以与组合物接触一段足够的时间，以使组合物粘附于装置的至少一个表面。在将组合物施加于装置的表面上以后，使其干燥。
优选在约25℃至约60℃范围的温度下通过将医疗装置浸入组合物中约30秒至约180分钟的一段时间范围来使装置与组合物接触。优选地，在约37℃的温度下通过将医疗装置浸入组合物中约60分钟来使装置与组合物接触。从组合物中除去装置，然后使其干燥。可以将医疗装置放置在烘箱或其它加热环境中一段足够的时间，以使组合物干燥。
虽然相信组合物的一层、或涂层可以提供期望的组合物涂层，但优选为多层。优选通过重复上述步骤将多层组合物施加于医疗装置的至少一个表面。优选地，医疗装置与组合物接触三次，对于每个其后的层，在用组合物接触医疗装置之前，使组合物在医疗装置的至少一个表面上干燥。因此，医疗装置优选在其至少一个表面上包括三个涂层、或三层的组合物。
在另一种具体实施方式中，用组合物涂层涂布医疗装置的方法包括以下步骤：通过将活性组分溶解在有机溶剂中，将医疗装置材料渗透剂结合于活性组分和有机溶剂，以及结合碱化剂以改善医疗装置材料的反应性，从而形成有效浓度的组合物涂层以基本上防止生物薄膜包埋的微生物在医疗装置的至少一个表面上的生长或增殖。然后将组合物加热至约30℃至约60℃的温度范围以增强组合物涂层对装置的至少一个表面的粘附力。将组合物涂层施加于医疗装置的至少一个表面，优选通过使组合物涂层接触医疗装置的至少一个表面足够长的时间，以使组合物涂层粘附于医疗装置的至少一个表面。从组合物涂层除去医疗装置并使其干燥，优选在室温下至少18小时。然后可以用液体(如水)漂洗医疗装置，并在杀菌以前使其干燥至少2小时，并且优选4小时。为了促进本发明的组合物干燥到医疗装置的表面上，可以将医疗装置放入加热环境如烘箱中。
在另一个方面，本发明提供了一种将根据本发明的组合物结合到装置中的方法。优选地，装置是医疗装置并且在形成医疗装置期间将组合物加入到形成医疗装置的材料中。例如，组合物可以与形成医疗装置的材料结合，例如，硅酮、聚氨酯、聚乙烯、GortexTM(聚四氟乙烯)、DacronTM(聚对苯二甲酸乙二酯)、以及TelfonTM(聚四氟乙烯)、和/或聚丙烯，然后和形成医疗装置的材料一起挤出，从而将组合物加入到形成医疗装置的材料中。在该具体实施方式中，可以以隔膜或粘合剂的形式加入组合物，其是被放置在医疗装置插入或植入部位。根据该具体实施方式，其中组合物加入形成医疗装置的材料中的医疗装置的一个实例是下文更详细描述的具有粘合剂层的导管插入密封件。具有组合物加入到材料中的医疗装置的另一个实例是粘合剂。本发明的组合物可以被结合到粘合剂如带中，从而提供粘合剂(adhesive)，其可以防止生物薄膜包埋的微生物在粘合剂的至少一个表面上的生长或增殖。
虽然已参照说明性具体实施方式描述了本发明，但应当理解，本发明并不限于这些明确的具体实施方式并且本领域普通技术人员可以进行各种变化和更改。所有变化和更改旨在被所附权利要求所涵盖。
实施例
实施例1-硫酸鱼精蛋白(PS)和氯己定盐(CHX)的结合对生物薄膜包埋的与导管相关的细菌的增强的影响
进行了体外微板测定(微孔板测定，microplate assay)以确定硫酸鱼精蛋白和氯己定盐的结合对生物薄膜包埋的生物薄膜形成与导管相关的细菌如大肠杆菌、铜绿假单胞菌以及表皮葡萄球菌的生长的增强的影响。使用生长在Luria-Bertani(LB)或胰蛋白酶大豆肉汤(TSB)中的每种菌株的过夜培养物作为种菌。在12孔微孔板上，在没有和有每种试验化合物(PS或CHX)分别和一起(PS+CHX)存在的情况下(12.5、25、或50μg/ml)，细菌生长在菌落形成抗原(CFA)培养基(用于革兰氏阴性)中或生长在TSB(用于革兰氏阳性)中。在37℃下温育平板24小时。温和地除去在每个孔中的包含浮游生物细胞的培养基(介质，media)并用无菌水漂洗。将已知容量的水加入到每个孔中，然后超声处理30秒。将每个孔的内含物转移到无菌管中并旋转一分钟(minute)，接着10倍连续稀释，然后利用涂布器平板接种在琼脂平板上。在37℃下温育平板24小时以后，计数集落形成单位(CFU)。虽然在抑制所有三种生物薄膜包埋的试验生物的生长方面氯己定盐比硫酸鱼精蛋白更有效，但硫酸鱼精蛋白和氯己定盐的结合对于铜绿假单胞菌和表皮葡萄球菌具有增强的抑制效应(图1-3)。
实施例2-硫酸鱼精蛋白(PS)和氯己定盐(CHX)结合涂布的硅酮导管相对于与导管相关的细菌的抑制活性
利用如先前由Sheretz等(Antimicrob.Agents.Chemother.，33：1174-1178，1989)所描述的Kirby-Bauer技术评估了PS+CHX涂布的和未涂布的1cm硅酮导管截面的抗微生物活性。通过浸入PS(100mg/ml)+CHX(400mg/ml)溶液中接着干燥(如在美国专利第6,475,434号中所描述的)来涂布导管。用环氧乙烷对导管进行气体灭菌。将与导管相关的微生物如大肠杆菌、奇异变形菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯氏菌、粪肠球菌、耐万古霉素肠球菌(VRE)、表皮葡萄球菌、金黄色葡萄球菌以及白色念珠菌，在37℃下生长在营养肉汤中18小时。每种菌株或酵母菌株的适当的种菌用来制备铺展板(spread plate)。然后小心地将涂布的和未涂布的导管截面压入每个板的中心。在37℃下温育24小时以后，在垂直于长轴的方向测量围绕每个截面的抑制区域。抑制区域因生物而异，范围是6mm至21mm(表1)。涂布的导管相对于大肠杆菌、表皮葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、以及白色念珠菌具有显著的抑制活性。
表1：硫酸鱼精蛋白(PS)+氯己定盐(CHX)涂布的硅酮导管相对于与导管相关的微生物的抑制活性
生物抑制区域(mm)大肠杆菌14±4.2奇异变形菌8±0铜绿假单胞菌6±0肺炎克雷伯氏菌10±2.8粪肠球菌13±1.4耐万古霉素肠球菌(VRE)13±1.4表皮葡萄球菌19±0金黄色葡萄球菌21±4.2白色念珠菌16.5±3.5
实施例3-硫酸鱼精蛋白(PS)和氯己定盐(CHX)结合涂布的硅酮导管对与导管相关的细菌的抗粘附效应
通过将未涂布和涂布的截面以三份暴露于大肠杆菌、铜绿假单胞菌、以及表皮葡萄球菌而测试了PS+CHX、PS、以及CHX涂布的硅酮导管耐细菌集群的活性。硅酮导管涂布有PS(100mg/ml)、CHX(100mg/ml)以及PS(100mg/ml)+CHX(100mg/ml)，然后用环氧乙烷进行气体灭菌。在用细菌攻击之前，在37℃下、以100rpm，在无菌人工尿中温育经涂布的导管截面24小时。在温育以后，用无菌水漂洗导管截面并在37℃的细菌培养物(在BHI培养基中)中以100rpm温育3小时。在温育3小时以后，温和洗涤截面两次。将每个经洗涤的截面转移到包含1ml无菌水的无菌管中并进行超声处理30秒，接着旋转1分钟。此外，利用无菌水连续稀释每个截面并放置在LB琼脂上。在37℃下温育平板24小时，然后对菌落(CFU)进行计数。在抑制大肠杆菌和表皮葡萄球菌的粘附方面，仅涂布CHX的导管优于PS和PS+CHX涂布的导管(图4和图6)。然而，PS+CHX结合涂布的导管相对于铜绿假单胞菌显示出增强的抗粘附效应(图5)。
实施例4-硫酸鱼精蛋白(PS)和氯己定盐(CHX)结合涂布的硅酮导管的抑制活性的耐久性
利用如先前由Sheretz等(Antimicrob.Agents.Chemother.，33：1174-1178，1989)描述的Kirby-Bauer技术评估了PS+CHX涂布的1cm硅酮导管截面的抗微生物活性。通过浸入PS(100mg/ml)+CHX(400mg/ml)溶液中，接着干燥(如在美国专利第6,475,434号中所描述的)，对导管进行涂布。用环氧乙烷对导管截面进行气体灭菌。使与导管相关的微生物如大肠杆菌、奇异变形菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯氏菌、粪肠球菌、耐万古霉素肠球菌(VRE)、表皮葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、以及白色念珠菌，在37℃下生长在营养肉汤中18小时。每种菌株的适当的种菌用来制备铺展板。然后小心地将涂布的导管截面压入每个板的中心。在37℃下温育24小时以后，在垂直于长轴的方向测量围绕每个截面的抑制区域。在测量抑制区域以后，将截面转移到接种有相应的试验生物的新鲜铺展板上，并在37℃下再次温育24小时。再次测量围绕每个截面的抑制区域。重复此步骤，以确定经涂布的导管在第3、7以及10天对于每种试验生物的抑制活性的耐久性。经涂布的导管截面相对于肺炎克雷伯氏菌、VRE、以及铜绿假单胞菌的抑制活性仅持续3天(表2)。然而，甚至在10天以后，经涂布的导管截面相对于大肠杆菌、表皮葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、以及白色念珠菌仍显示出显著的抑制活性。
表2：硫酸鱼精蛋白(PS)+氯己定盐(CHX)涂布的硅酮导管切片(节段，segment)的抑制活性的耐久性
生物抑制区域(mm)第0天第1天 第3天 第7天 第10天大肠杆菌1410 11 10 8奇异变形菌80 0 0 0铜绿假单胞菌66 11 0 0肺炎克雷伯氏菌106 6 0 8粪肠球菌138 9 6 6耐万古霉素肠球菌(VRE)139 9 7 0表皮葡萄球菌1916 13 15 12金黄色葡萄球菌2113 14 8 10白色念珠菌1713 8 8 8
实施例5-硫酸鱼精蛋白(PS)和氯己定盐(CHX)结合涂布的硅酮导管的抗粘附活性的耐久性
通过将未涂布和涂布的截面(双份)暴露于大肠杆菌和表皮葡萄球菌试验了PS+CHX涂布的硅酮导管耐细菌集群的能力，时间为7天。用PS(100mg/ml)+CHX(400mg/ml)涂布硅酮导管，然后用环氧乙烷进行气体灭菌。在用细菌攻击之前，在37℃下、以100rpm，分别在无菌人工尿中温育经涂布的和未涂布的导管截面7天。每24小时用新鲜人工尿更换烧瓶中的人工尿。在1、3、5、以及7天的时间间隔取出经涂布和未涂布的导管切片(三份)，并用无菌水温和漂洗。此外，用上述试验生物一次一个攻击它们。在温育以后，用无菌水温和漂洗导管截面三次并在37℃的试验生物培养肉汤中以100rpm温育3小时。在温育3小时以后，温和洗涤截面两次。将每个经洗涤的切片转移到包含1ml无菌水的无菌管中并进行超声处理30秒，接着旋转1分钟。此外，利用无菌水连续稀释每个截面并放置在LB琼脂上。在37℃下温育平板24小时，然后对集落形成单位(CFU)进行计数。对于每个时间间隔重复此步骤。PS+CHX涂布的导管截面可有效防止细菌细胞粘附，因为在第7天观测到可抑制两种菌株的粘附约为80％(图7-8)。
实施例6-硫酸鱼精蛋白(PS)和氯己定盐(CHX)结合涂布的硅酮导管的体内效力
利用先前报道的稍加改进的兔模型进行了体内效力研究(Darouiche，et al.，J.Heart.Valve.Dis.，11：99-104，2002)。此初步研究是为了估计涂布有PS(100mg/ml)+CHX(400mg/ml)的硅酮导管在防止皮下植入的硅酮导管切片的大肠杆菌感染方面的体内效力。用PS(100mg/ml)+CHX(400mg/ml)涂布硅酮导管，然后用环氧乙烷进行气体灭菌。将总共15个未涂布的1cm硅酮导管切片和15个经涂布的导管切片皮下植入到总共4只兔的背部，其中所述兔已接受单剂量的万古霉素(20mg/kg体重)，用于预防革兰氏阳性皮肤微生物区系。用50μl的2×104CFU/ml的大肠杆菌的临床分离菌接种每个装置，然后闭合伤口。每天将2mg/kg体重的酮洛芬肌内(IM)注入每只兔中，作为消炎药/镇痛药。7天以后，处死四只兔。将装置移出并通过利用超声处理技术和平板接种进行培养。从周围的流体收集物(collection)获得拭子培养物(swabculture)。虽然15个中有3个(20％)未涂布的切片被大肠杆菌移殖，但所有15个涂布的切片完全没有细菌移殖(表3)。
表3：硫酸鱼精蛋白(PS)和氯己定盐(CHX)涂布的硅酮导管的体内效力
试验组 兔数目 植入切片的数目 感染％(7天后) 对照 1 4个未涂布的 20 2 4个未涂布的 3 4个未涂布的 4 3个未涂布的 实验 1 4个涂布的 0 2 4个涂布的 3 4个涂布的 4 3个涂布的
实施例7-用氯己定/鱼精蛋白涂布的硅酮膀胱导管的体内效力
此实施例的目的是：(1)与未涂布的导管相比，证实用氯己定/鱼精蛋白涂布的导管的体内效力，(2)对氯己定/鱼精蛋白涂布的导管和水凝胶-银涂布的导管比较大肠杆菌的装置移殖和与装置相关的感染的速率，(3)表明涂布有氯己定/鱼精蛋白的导管可用于防止生物薄膜包埋的微生物的生长或增殖，以及(4)表明涂布有氯己定/鱼精蛋白的导管可用于防止与装置相关的感染。
利用已建立起来的皮下插入兔背部的医疗装置的大肠杆菌感染模型进行了动物研究。通过接受肌肉注射(0.5ml/kg体重)的氯胺酮(70mg/kg体重)和乙酰丙嗪(2mg/kg体重)的混合物来麻醉雌性新西兰白色、无特异性病原体的兔(体重2-3kg)。为了模拟在人类患者中给予手术期间的抗生素预防，在麻醉诱导以后，每只动物立即接受肌肉注射万古霉素(20mg/kg)，其相对于革兰氏阳性生物是活性的但相对于大肠杆菌则不是活性的。刮取兔的背部，然后以无菌方式制备和覆盖。6个(2个氯己定/鱼精蛋白涂布的、2个水凝胶-银涂布的、以及2个未涂布的)2cm长的导管切片被皮下插入脊柱侧部的3-4cm处并彼此分开。将总共84个装置放置在14只兔中。将105CFU病原大肠杆菌菌株2131(来自与导管相关的UTI患者的临床分离菌)接种到插入装置的表面上，然后缝合伤口。每天监测兔的局部感染的体征、脓毒症、或重症不良应激(majordistress)。在第一周将兔处死，然后进行以下研究：
a.通过利用超声处理技术，来自装置的定量培养物。
b.相邻于装置的部位的定性拭子培养物。
该研究的两个主要结果是装置移殖(定义为来自定量超声处理培养物的大肠杆菌的生长；可检测限度，10 CFU)和与装置相关的感染(定义为来自围绕装置的部位的定性拭子培养物的大肠杆菌的装置移殖加上生长)。通过利用双尾费希尔(2-tailed Fisher’s)精确检验(具有90％概率)，在不同组之间比较了装置移殖和与装置相关的感染的比率。≤0.05的P值表示显著性差异。
通过利用双样本t检验(具有不等方差)，在三组之间比较了回收自移走导管的平均细菌CFU的辅助结果。≤0.05的P值表示显著性差异。
28个氯己定/鱼精蛋白涂布的导管中的两个(7％)、28个银/水凝胶涂布的导管中的25个(89％)、以及其28个未涂布导管中的18个(64％)变成移殖有大肠杆菌。氯己定/鱼精蛋白涂布的导管被移殖的可能性显著低于银/水凝胶涂布的导管(P＜0.001)或未涂布导管(P＝0.0016)。银/水凝胶涂布的导管与未涂布导管的移殖比率没有显著性差异(P＝0.51)。
28个氯己定/鱼精蛋白涂布的导管中的一个(4％)、28个银/水凝胶涂布的导管中的12个(43％)、以及其28个未涂布导管中的14个(50％)发展了由于大肠杆菌的与装置相关的感染。氯己定/鱼精蛋白涂布的导管引起与装置相关的感染的可能性显著低于银/水凝胶涂布的导管(P＝0.046)或未涂布导管(P＝0.013)。银/水凝胶涂布的导管与未涂布导管之间的与装置相关的感染的比率没有显著性差异(P＝1.69)。
CFU的平均数在氯己定/鱼精蛋白组中为4.6×105，在银/水凝胶组中为2.5×106，以及在未涂布导管中为8.3×106。在氯己定/鱼精蛋白涂布的导管的表面上的CFU的平均数显著低于(P＝0.031)未涂布导管。当比较银/水凝胶涂布的导管和氯己定/鱼精蛋白涂布的导管(P＝0.22)或未涂布导管(P＝0.13)时，CFU的平均数没有显著差异。
这些结果(表4)表明，用氯己定/鱼精蛋白但不用银/水凝胶涂布导管可防止装置移殖和与装置相关的感染。用于装置培养物的最小检测度是10 CFU/装置。使用了50μl的2×106 CFU/ml或1×105CFU的绝对种菌。每天将2mg/kg的酮洛芬肌内注入每只兔中，作为消炎药/镇痛药。术前给予2mg/kg的万古霉素作为预防用抗生素。硅酮泌尿导管的外径为4mm。使用了未涂布导管的2cm切片。在处死兔以前抽取自血液的培养物都是阴性的。
表4：抗微生物涂布的硅酮泌尿导管相对于大肠杆菌菌株2131的体内活性
装置 植入的天数 装置处理 装置培养物 (总CFU) 部位拭子(总 CFU) 5-3 7 PA/CH 0 - 5-4 7 PA/CH 0 - 6-1 7 PA/CH 0 - 6-6 7 PA/CH 0 - 7-2 7 PA/CH 0 - 7-5 7 PA/CH 0 - 8-2 7 PA/CH 0 - 8-5 7 PA/CH 0 - 9-3 7 PA/CH 0 - 9-4 7 PA/CH 0 - 10-1 7 PA/CH 0 - 10-6 7 PA/CH 0 - 11-2 7 PA/CH 1.7×102 - 11-5 7 PA/CH 0 - 12-3 7 PA/CH 0 - 12-4 7 PA/CH 0 - 13-1 7 PA/CH 0 -
13-6 7 PA/CH 0 - 14-2 7 PA/CH 0 - 14-5 7 PA/CH 0 - 15-3 7 PA/CH 0 - 15-4 7 PA/CH 0 + 16-2 7 PA/CH 0 - 16-5 7 PA/CH 0 - 17-3 7 PA/CH 1.3×107 + 17-4 7 PA/CH 0 - 18-1 7 PA/CH 0 - 18-6 7 PA/CH 0 - 5-2 7 Ag 4.2×106 + 5-5 7 Ag 2.4×106 + 6-3 7 Ag 7.7×102 + 6-4 7 Ag 8.2×104 + 7-3 7 Ag 7.0×101 - 7-4 7 Ag 4.4×107 + 8-1 7 Ag 3.6×103 - 8-6 7 Ag 1.4×106 + 9-1 7 Ag 2.0×106 + 9-6 7 Ag 3.8×106 - 10-2 7 Ag 1.9×105 - 10-5 7 Ag 0 - 11-3 7 Ag 5.6×106 -
11-4 7 Ag 1.0×104 - 12-2 7 Ag 4.2×102 - 12-5 7 Ag 1.4×102 - 13-2 7 Ag 6.8×105 + 13-5 7 Ag 1.8×106 + 14-3 7 Ag 0 - 14-4 7 Ag 2.5×103 - 15-1 7 Ag 4.3×103 - 15-6 7 Ag 3.1×104 - 16-1 7 Ag 2.5×105 + 16-6 7 Ag 1.1×106 + 17-2 7 Ag 1.8×106 + 17-5 7 Ag 1.8×105 - 18-3 7 Ag 0 - 18-4 7 Ag 1.3×103 - 5-1 7 未涂布的 2.4×107 + 5-6 7 未涂布的 3.6×107 + 6-2 7 未涂布的 1.5×103 + 6-5 7 未涂布的 6.4×104 + 7-1 7 未涂布的 5.6×105 + 7-6 7 未涂布的 7.8×107 + 8-3 7 未涂布的 0 - 8-4 7 未涂布的 0 -
9-2 7 未涂布的 1.6×105 - 9-5 7 未涂布的 1.6×104 + 10-3 7 未涂布的 4.0×101 - 10-4 7 未涂布的 0 - 11-1 7 未涂布的 7.6×106 + 11-6 7 未涂布的 4.2×107 + 12-1 7 未涂布的 0 - 12-6 7 未涂布的 2.3×107 + 13-3 7 未涂布的 0 - 13-4 7 未涂布的 0 - 14-1 7 未涂布的 2.5×105 + 14-6 7 未涂布的 0 - 15-2 7 未涂布的 0 - 15-5 7 未涂布的 1.0×102 + 16-3 7 未涂布的 6.7×102 - 16-4 7 未涂布的 3.0×10 - 17-1 7 未涂布的 2.0×107 + 17-6 7 未涂布的 7.0×105 + 18-2 7 未涂布的 0 - 18-5 7 未涂布的 0 -