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1、(10)授权公告号 CN 102668985 B (45)授权公告日 2013.12.25 CN 102668985 B *CN102668985B* (21)申请号 201210168597.1 (22)申请日 2012.05.28 A01H 4/00(2006.01) (73)专利权人 西北大学 地址 710069 陕西省西安市太白北路 229 号 (72)发明人 黄萱 芦恒 刘梦昕 曾洁 黄凤智 李颖 (74)专利代理机构 西安西达专利代理有限责任 公司 61202 代理人 谢钢 (54) 发明名称 一种明日叶快速繁殖方法 (57) 摘要 本发明公开了一种以明日叶的叶片为外植 体， 在培。
2、养基上直接诱导产生丛生芽的快繁方法。 该方法利用明日叶的叶片作为外植体， 在离体条 件下不经愈伤组织阶段直接诱导培养产生丛生 芽， 之后再利用丛生芽诱导生根长成完整植株。 本 发明避免了先产生愈伤组织这一过程， 节约了诱 导时间， 减少了诱导突变率， 为明日叶药用价值的 开发提供了原料基础， 具有很好的应用前景。 (51)Int.Cl. 审查员 杜玉娟 权利要求书 1 页 说明书 2 页 附图 1 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书1页 说明书2页 附图1页 (10)授权公告号 CN 102668985 B CN 102668985 B *CN1026689。
3、85B* 1/1 页 2 1. 一种明日叶快速繁殖方法， 其特征在于包括以下步骤 ： （1） 取材 ： 在明日叶成株上取新鲜叶片 ； （2） 灭菌 ： 用流水冲洗叶片 3 5min， 然后用 70% 的酒精浸泡 30 60s， 再用 0.1% 的 HgCl2浸泡灭菌 5 7 min， 不停晃动减少外植体上的气泡， 使叶片完全浸在升汞中充分消 毒， 最后用无菌水冲洗 6 8 次 ； （3） 接种和诱导 ： 将灭菌后的明日叶的叶片切成 0.5 1.0cm 的正方形碎片， 接种在诱 导丛生芽的 MS 培养基上， 培养 20d 产生绿色的芽点， 继续培养 10 15d 分化长成丛生芽， 诱导丛生芽的M。
4、S培养基组成为 ： 在MS培养基中加入1 mg/L 2,4-D和0.2 mg/L 6-BA ； 培养条件为 ： 光照强度为 40 molm-2s-1， 光照时间 16h， 温度为 25 2 ； （4） 生根 ： 待丛生芽长至23cm， 剪下， 插入含有NAA 0.5mg/L的MS生根培养基中进行 生根培养， 培养条件为 ： 光照强度为 40 molm-2s-1， 光照时间 16h， 温度为 25 2。 权 利 要 求 书 CN 102668985 B 2 1/2 页 3 一种明日叶快速繁殖方法 技术领域 0001 本发明涉及一种明日叶快速繁殖方法， 具体涉及一种以明日叶的叶片为外植体， 在培养。
5、基上诱导直接产生丛生芽的方法， 属于植物组织培养技术领域。 背景技术 0002 明日叶 （Angelica Keiskei Miq.Koidz), 别名明日草、 八丈草， 原产于日本的八 丈岛和伊豆诸岛。经常食用明日叶的当地人， 长寿者很多， 而且到了高龄仍很健康， 能与年 轻人一样地劳动， 所以又叫做长寿菜。近年来， 明日叶中的许多成分逐渐地被了解， 也因此 受到瞩目， 其中含有非常丰富的各种维生素、 矿物质和微量元素， 并且这些营养成分十分均 衡。明日叶中含有的珍贵活性成分查尔酮有抗肿瘤、 抗氧化以及清除自由基、 抗胃溃疡、 抗 菌和抗炎等功效， 所以明日叶的高食用价值和药用价值日益受到人。
6、们的重视。 0003 明日叶为多年生草本， 株高 50-100cm ； 叶互生， 三出复叶， 叶缘具细锯齿 ； 花白色， 伞形花序顶生， 发芽率低， 这也就使组织培养技术在明日叶的繁殖起到很大作用。 0004 中国专利 （CN1930952） 报道了一种明日叶的组织培养和快速繁殖方法， 该方法包 括 ： (1) 采用明日叶的带芽茎段作为外植体， 经消毒后进行接种培养， 获得愈伤组织， 诱导 出丛生状芽 ； (2) 通过丛生芽在培养基里的增殖， 将其增殖约 3 倍 ； (3) 将增殖所得的丛生 芽切割， 移接到生根培养基中促其生根， 获得完整的再生植株 ； (4) 将再生植株移栽到营养 土中， 。
7、得到明日叶的移栽苗。 0005 发明人通过大量实验发现， 诱导明日叶的叶片直接产生丛生芽的方法减少了诱导 愈伤组织环节， 节约诱导时间， 减少诱导突变率， 具有很好的应用前景。 发明内容 0006 本发明的目的是提供一种简单、 快捷并能减少诱导突变率的诱导明日叶高频产生 丛生芽的方法， 以克服现有技术的主要不足。 0007 本发明实现过程如下 ： 0008 一种明日叶快速繁殖方法， 其利用明日叶的叶片作为外植体， 在离体条件下不经 愈伤组织阶段直接诱导培养产生丛生芽， 之后再利用丛生芽诱导生根长成完整植株。 0009 上述明日叶快速繁殖方法具体包括以下步骤 ： 0010 （1） 取材 ： 在明。
8、日叶成株上取新鲜叶片 ； 0011 （2） 灭菌 ： 叶片用 HgCl2浸泡灭菌 ； 0012 （3） 接种和诱导 ： 将灭菌后的明日叶的叶片切成 0.5 1.0cm 的正方形碎片， 接种 在诱导丛生芽的 MS 培养基上， 培养 20d 产生绿色的芽点， 继续培养 10 15d 分化长成丛生 芽 ； 0013 （4） 生根 ： 待丛生芽长至 2 3cm， 剪下， 插入含有 NAA 0.5mg/L 的 MS 生根培养基 中进行生根培养。 0014 上述步骤 （2） 中， 用流水冲洗叶片 3 5min， 然后用 70% 的酒精浸泡 30 60s， 再 说 明 书 CN 102668985 B 3 。
9、2/2 页 4 用 0.1% 的 HgCl2浸泡灭菌 5 7 min， 不停晃动减少外植体上的气泡， 使叶片完全浸在升汞 中充分消毒， 最后用无菌水冲洗 6 8 次。 0015 上述步骤 （3） 中， 所述诱导丛生芽的 MS 培养基组成为 ： 在 MS 培养基中加入 1 mg/ L 2,4-D 和 0.2 mg/L 6-BA。 0016 上述步骤 （3） 和 （4） 过程中培养条件为 ： 光照强度为 40 molm-2s-1， 光照时 间 16h， 温度为 25 2。 0017 本发明的优点与积极效果 ： 本发明直接诱导明日叶的叶片产生丛生芽， 避免了先 产生愈伤组织这一过程， 节约了诱导时间。
10、， 减少了诱导突变率， 为明日叶药用价值的开发提 供了原料基础， 具有很好的应用前景。 附图说明 0018 图 1 为实体显微镜下观察的芽点图片 （20d） ； 0019 图 2 为实体显微镜下观察的丛生芽图片 （30d） ； 0020 图 3 为在不同叶片外植体边缘直接长出丛生芽的图片。 具体实施方式 0021 实施例 1 0022 （1） 取材 ： 在生长良好的明日叶成株上取较为新鲜的完整叶片作为外植体。 0023 （2） 消毒 ： 用流水冲洗叶片 4 min， 然后在超净工作台上用 70% 的酒精浸泡 25 s， 再用 0.1% 的 HgCl2浸泡灭菌 6 分钟， 不停晃动， 目的在于减。
11、少外植体上的气泡， 使叶片完全 浸在升汞中， 消毒充分， 最后用无菌水冲洗 7 次。 0024 （3） 接种和诱导 ： 将消毒好的明日叶的叶片切成 0.5 1.0 厘米的正方形碎片， 接 种在含有 1 mg/L 2,4-D 和 0.2 mg/L6-BA 的 MS 诱导培养基上， 20 d 产生大量绿色芽点 （图 1） ， 继续培养， 芽点直接长成丛生芽 （图2） 。 经过数据采集统计， 明日叶外植体直接出芽率达 到了 90% 以上 （图 3） 。丛生芽诱导的培养条件为 ： 光照强度 40 molm-2s-1, 光照时间 16h， 温度为 25 2。 0025 （5） 生根 ： 待不定芽长至 2-3cm， 将诱导得到的不定芽剪下， 插入 MS+ NAA 1mg/L 的 诱导生根培养基中进行培养， 温度为 25 2、 光强为 40 molm-2s-1、 光照时间 16h 条件， 生根率为 100%。培养 2-3 周后即可获得大量组培苗。 说 明 书 CN 102668985 B 4 1/1 页 5 图 1图 2 图 3 说 明 书 附 图 CN 102668985 B 5 。