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1、(10)授权公告号 CN 102668983 B (45)授权公告日 2013.08.28 CN 102668983 B *CN102668983B* (21)申请号 201210161579.0 (22)申请日 2012.05.23 A01H 4/00(2006.01) (73)专利权人 四川农业大学 地址 611130 四川省成都市温江区惠民路 211 号 (72)发明人 郑有良 江千涛 刘登才 魏育明 马建 刘亚西 王际睿 (74)专利代理机构 北京路浩知识产权代理有限 公司 11002 代理人 王朋飞 王加岭 (54) 发明名称 节节麦成熟胚的组织培养方法 (57) 摘要 本发明提供一。
2、种节节麦成熟胚的组织培养方 法， 包括种子消毒、 分离成熟胚并切除胚尖、 愈伤 组织诱导培养、 分化培养及生根培养的步骤， 其中 愈伤组织诱导培养和分化培养步骤中使用的培养 基分别为 AtEI 和 AtS。采用本发明方法， 可高效 促进节节麦成熟胚愈伤组织的形成和体细胞胚胎 的发生， 具有出愈率高、 愈伤质量好的显著优势， 增加产生不定芽的数目， 提高植株再生率。 (51)Int.Cl. 审查员 王岩 权利要求书 2 页 说明书 6 页 附图 2 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书2页 说明书6页 附图2页 (10)授权公告号 CN 102668983 B 。
3、CN 102668983 B *CN102668983B* 1/2 页 2 1. 节节麦成熟胚的组织培养方法， 包括种子消毒、 分离成熟胚并切除胚尖、 愈伤组织诱 导培养、 分化培养及生根培养的步骤， 其特征在于， 所述愈伤组织诱导培养步骤中使用的 AtEI 培养基为 ： 基础培养基 +2， 4- 二氯苯氧乙 酸 2-6mg/L+ 麦草畏 1-5mg/L+6- 糖氨基嘌呤 0.5-1.0mg/L， pH 值 6.0 ； 所述分化培养步骤 中使用的 AtS 培养基为 ： 基础培养基 +0.5mg/L 或 1.0mg/L- 萘乙酸 +6-（4 羟基 -3- 甲 基 -2- 反丁烯基） 氨基嘌呤 2。
4、.0mg/L 或 4.0mg/L+6- 糖氨基嘌呤 1.0mg/L+2- 羟乙基 - 三甲 基氢氧化胆碱 1.0mg/L， pH 值 6.0 ； 所述基础培养基配方为 ： 2. 根据权利要求 1 所述的方法， 其特征在于， 所述愈伤组织诱导培养步骤中使用的 AtEI培养基为基础培养基+2， 4-二氯苯氧乙酸2mg/L+麦草畏2mg/L+6-糖氨基嘌呤0.5mg/ L。 3. 根据权利要求 1 或 2 所述的方法， 其特征在于， 分化培养步骤中使用的 AtS 培养基 为基础培养基 +0.5mg/L- 萘乙酸 +6-（4 羟基 -3- 甲基 -2- 反丁烯基） 氨基嘌呤 4.0mg/ 权 利 要 。
5、求 书 CN 102668983 B 2 2/2 页 3 L+6- 糖氨基嘌呤 1.0mg/L+2- 羟乙基 - 三甲基氢氧化胆碱 1.0mg/L。 4. 根据权利要求 1 或 2 所述的方法， 其特征在于， 愈伤组织诱导培养的方法为 ： 将切除 胚尖的成熟胚， 按胚轴向上接种在AtEI培养基上， 置于25， 暗培养15天， 得到成熟胚愈伤 组织。 5. 根据权利要求 4 所述的方法， 其特征在于， 分化培养的方法为 ： 将成熟胚愈伤组织转 移至 AtS 培养基中， 置于 25， 光照 16 小时 / 天， 光照强度为 4000-6000lux， 培养至出苗。 6. 根据权利要求 5 所述的方。
6、法， 其特征在于， 生根培养的方法为 ： 将经过分化培养后长 出的苗转移至生根培养基中进行培养， 当不定根长度达 3-4cm 时， 将植株移入大田中培养。 权 利 要 求 书 CN 102668983 B 3 1/6 页 4 节节麦成熟胚的组织培养方法 技术领域 0001 本发明属于植物组织培养领域， 具体地说， 涉及节节麦成熟胚的组织培养方法。 背景技术 0002 节节麦 (Aegilops tauschii,2n=14,DD)， 是普通小麦 (Triticurn aestivum,2n=6x=42,AABBDD)D 染色体组的供体物种。节节麦具有抗病、 抗虫和耐胁迫等多 种优良特性， 是小。
7、麦遗传改良的重要基因资源。 利用基因工程技术， 对优异外源基因进行功 能验证和遗传转化利用， 日益受到人们的重视。但是， 普通小麦是异源六倍体， 遗传背景复 杂， 虽然遗传转化取得一定的进展， 但转化效率仍远低于玉米和水稻。 特别是对于基因功能 验证， 要求快捷的时效性。节节麦除了为普通小麦提供 D 染色体组外， 与普通小麦的 A、 B 染 色体组具有高度同源性， 仅包含一套基本染色体， 遗传背景相对简单， 适宜作为遗传转化的 优良受体。因此， 可以作为小麦基因功能验证的重要模式植物。 0003 实现遗传转化的重要技术基础是组织培养体系的建立。 目前， 以幼胚、 幼穗和成熟 胚作为外植体进行的。
8、麦类遗传转化都获得了成功， 其中， 幼胚是转化成功最多的外植体。 但 幼胚的取材受季节限制， 个体间生理状态一致性难以把握， 短时间难以进行重复试验。 成熟 胚具有取材方便， 不受季节、 植株发育阶段等因素限制的特点， 能保证不同个体间生理状态 的一致性和提供足够愈伤数量， 是开展遗传转化最为方便实用的受体。 目前， 关于节节麦成 熟胚组织培养的研究， 在国内外都未见报道。节节麦成熟胚组织培养体系尚处于初步探索 阶段， 特别是针对成熟种子的表面消毒， 减少愈伤组织培养过程中的污染， 以及提高成熟胚 绿苗分化能力等方面缺乏深入研究。 发明内容 0004 本发明的目的是提供一种高效的节节麦成熟胚的。
9、组织培养方法。 0005 为了实现本发明目的， 本发明的一种节节麦成熟胚的组织培养方法， 其包括种子 消毒、 分离成熟胚并切除胚尖、 愈伤组织诱导培养、 分化培养及生根培养的步骤。 0006 其中， 所述愈伤组织诱导培养步骤中使用的 AtEI 培养基为 ： 在基础培养基中添加 2， 4- 二氯苯氧乙酸 (2， 4-D)、 麦草畏 (Dicamba) 或 6- 糖氨基嘌呤 (KT) 中的一种或多种后 制成的 pH 值为 6.0 的培养基 ； 所述分化培养步骤中使用的 AtS 为 ： 在基础培养基中添加 -萘乙酸(NAA)、 6-(4羟基-3-甲基-2-反丁烯基)氨基嘌呤(ZT)、 6-苄氨基嘌呤。
10、(6-BA)、 6-糖氨基嘌呤或2-羟乙基-三甲基氢氧化胆碱(CC)中的一种或多种后制成的pH值为6.0 的培养基。 0007 上述基础培养基配方为 ( 以水配制 ) ： 0008 说 明 书 CN 102668983 B 4 2/6 页 5 0009 优选所述愈伤组织诱导培养步骤中使用的 AtEI 培养基为基础培养基 +2， 4- 二氯 苯氧乙酸 2-6mg/L+ 麦草畏 1-5mg/L+6- 糖氨基嘌呤 0-1.0mg/L。更优选地， 所述 AtEI 培养 基为基础培养基 +2， 4- 二氯苯氧乙酸 2mg/L+ 麦草畏 2mg/L+6- 糖氨基嘌呤 0.5mg/L。 0010 优选分化培。
11、养步骤中使用的 AtS 培养基为基础培养基 +0-1.0mg/L- 萘乙酸 +6-(4 羟基 -3- 甲基 -2- 反丁烯基 ) 氨基嘌呤 1-5mg/L+6- 苄氨基嘌呤 0-2.0mg/L+6- 糖氨 基嘌呤 0-1.0mg/L+2- 羟乙基 - 三甲基氢氧化胆碱 0-3.0mg/L。更优选地， 所述 AtS 培养基 为基础培养基 +0.5mg/L 或 1.0mg/L - 萘乙酸 +6-(4 羟基 -3- 甲基 -2- 反丁烯基 ) 氨基 嘌呤2.0mg/L或4.0mg/L+6-糖氨基嘌呤1.0mg/L+2-羟乙基-三甲基氢氧化胆碱1.0mg/L。 最优选地， 所述 AtS 培养基为基础培。
12、养基 +0.5mg/L - 萘乙酸 +6-(4 羟基 -3- 甲基 -2- 反 丁烯基)氨基嘌呤4.0mg/L+6-糖氨基嘌呤1.0mg/L+2-羟乙基-三甲基氢氧化胆碱1.0mg/ L。 0011 前述方法中， 种子消毒的方法为 ： 将种子去壳后， 浸泡于 75% 酒精中 1min， 用无菌 水冲洗3次后， 置于25%次氯酸钠溶液中振荡处理20min， 然后用无菌水冲洗3次， 浸泡于无 菌水中 10-12h。 0012 前述方法中， 愈伤组织诱导培养的方法为 ： 将切除胚尖的成熟胚， 按胚轴向上接种 说 明 书 CN 102668983 B 5 3/6 页 6 在 AtEI 培养基上， 置于。
13、 25 C， 暗培养 15 天， 得到成熟胚愈伤组织。 0013 前述方法中， 分化培养的方法为 ： 将成熟胚愈伤组织转移至 AtS 培养基中， 置于 25 C， 光照 16 小时 / 天， 光照强度为 4000-6000lux。培养至出苗。 0014 前述方法中， 生根培养的方法为 ： 将经过分化培养后长出的苗转移至生根培养基 中进行培养， 当不定根长度达 3-4cm 时， 将植株移入大田中培养。 0015 本发明的优点在于 ： 本发明的节节麦成熟胚的组织培养方法， 可高效促进节节麦 成熟胚愈伤组织的形成和体细胞胚胎的发生， 具有出愈率高、 愈伤质量好的显著优势， 增加 产生不定芽的数目， 。
14、提高植株再生率。 附图说明 0016 图 1 为节节麦 AS2399 成熟胚在利用本发明方法和常规方法培养条件下的愈伤生 长情况对比 ； 其中， A 为利用本发明方法的愈伤诱导情况 ； B 为利用常规方法的愈伤诱导情 况。 0017 图 2 为节节麦 AS2407 成熟胚在利用本发明方法和常规方法培养条件下的愈伤生 长情况对比 ； 其中， A 为利用本发明方法的愈伤诱导情况 ； B 为利用常规方法的愈伤诱导情 况。 0018 图 3 为节节麦 AS2399 成熟胚在利用本发明方法和常规方法培养条件下的分化情 况对比 ； 其中， A 为利用本发明方法的绿苗分化情况 ； B 为利用常规方法的绿苗分。
15、化情况。 0019 图 4 为节节麦 AS2407 成熟胚在利用本发明方法和常规方法培养条件下的分化情 况对比 ； 其中， A 为利用本发明方法的绿苗分化情况 ； B 为利用常规方法的绿苗分化情况。 具体实施方式 0020 以下实施例用于说明本发明， 但不用来限制本发明的范围。 若未特别指明， 实施例 中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段， 所用原料均为市售商品。 0021 实施例 1 节节麦成熟胚的组织培养再生方法 0022 1.1 诱导培养基 (AtEI) 和分化培养基 (AtS) 的配制 0023 AtEI 诱 导 培 养 基 ： KNO3 1500mg、 (NH4)2SO4。
16、 2300mg、 KH2PO42000mg、 CaCl22H2O 630mg、 MgSO47H2O 900mg、 KI 40mg、 MnSO44H2O 220mg、 H3BO3 500mg、 ZnSO47H2O 800mg、 CoCl6H2O0.025mg、 CuSO45H2O 0.025mg、 Na2MoO42H2O 0.25mg、 FeSO47H2O27.8mg、 Na2-EDTA 2H2O 37.3mg， 用水定容至950ml， 调节pH值至6.0， 加入琼脂粉7.0g， 以上成分采 用 121高压灭菌 20min， 灭菌完成后， 待温度降到 60， 将如下成分混合肌醇 100mg、 甘。
17、氨 酸 200mg、 盐酸硫胺素 250mg、 盐酸吡哆醇 25mg、 烟酸 25mg、 脯氨酸 500mg、 谷氨酰胺 500mg、 天冬氨酸 150mg、 酪蛋白水解物 300mg、 2， 4-D 2mg、 Dicamba2mg、 KT 0.5mg 混合， 并用水定容 至 50ml， 过滤灭菌后添加到高压灭菌后的培养基中。 0024 AtS 分 化 培 养 基 ： KNO3 1500mg、 (NH4)2SO4 2300mg、 KH2PO42000mg、 CaCl22H2O 630mg、 MgSO47H2O 900mg、 KI 40mg、 MnSO44H2O 220mg、 H3BO3 500。
18、mg、 ZnSO47H2O 800mg、 CoCl6H2O0.025mg、 CuSO45H2O 0.025mg、 Na2MoO42H2O 0.25mg、 FeSO47H2O27.8mg、 Na2-EDTA 2H2O 37.3mg， 用水定容至950ml， 调节pH值至6.0， 加入琼脂粉7.0g， 以上成分采 用 121高压灭菌 20min， 灭菌完成后， 待温度降到 60， 将如下成分混合肌醇 100mg、 甘氨 说 明 书 CN 102668983 B 6 4/6 页 7 酸 200mg、 盐酸硫胺素 250mg、 盐酸吡哆醇 25mg、 烟酸 25mg、 脯氨酸 500mg、 谷氨酰胺 。
19、500mg、 天冬氨酸 150mg、 酪蛋白水解物 300mg、 NAA 0.5mg、 ZT4mg、 6-BA 为 1mg， CC 1mg 混合， 并用水 定容至 50ml， 过滤灭菌后添加到高压灭菌后的培养基中。 0025 1.2 种子消毒处理 0026 从 6 种节节麦基因型 (AS2386、 AS2393、 AS2399、 AS2404、 AS2405 和 AS2407， 由四川 农业大学小麦研究所提供 ) 中， 选取无病虫害的健康种子， 将种子去壳后， 用 75% 酒精消毒 处理 1min， 无菌水冲洗 3 次后， 用 25% 次氯酸钠溶液振荡消毒处理 20min， 再用无菌水冲洗 3。
20、 次后， 在室温下用无菌水浸泡 10-12h。 0027 1.3 愈伤组织诱导培养 0028 将浸泡处理后的种子， 再用25%次氯酸钠振荡消毒15min， 无菌水冲洗3次后， 用刀 片将成熟胚从种子中分离， 并切除胚尖， 按胚轴向上接种在 AtEI 诱导培养基上， 每皿接种 40 粒成熟胚。将接种于 AtEI 诱导培养基的成熟胚置于 25 C, 暗培养 15 天后培养出愈伤 组织。 分别统计成熟胚胚性愈伤出愈率=胚性愈伤数/接种胚数6种节节麦基因型AS2386、 AS2393、 AS2399、 AS2404、 AS2405 和 AS2407 节节麦 AS2399 和 AS2407 的愈伤生长情。
21、况分别 如图 1A 和图 2A 所示。 0029 1.4 分化培养 0030 将 1.3 中获得的成熟胚愈伤组织， 转入 AtS 分化培养基中， 置于 25 C， 光照 16 小 时 / 天， 光照强度为 4000-6000lux。培养 3 周后， 开始出现绿苗。节节麦 AS2399 的绿苗分 化情况如图 4A 所示 ; 节节麦 AS2399 和 AS2407 的绿苗分化情况分别如图 3A 和图 4A 所示。 0031 1.5 生根培养 0032 当节节麦 6 种基因型 (AS2386、 AS2393、 AS2399、 AS2404、 AS2405 和 AS2407) 各自 成熟胚愈伤组织分化。
22、出的再生芽高度达 2-3cm 时， 转入生根培养基中培养， 2-3 周后长出不 定根， 当不定根长度达到 3-4cm 时， 取出植株， 将根部培养基洗净， 移入土壤中培养。分别 测定每个材料的成熟胚的再生率 ( 成熟胚再生率 = 再生植株 / 接种愈伤数 )。6 种节节麦 基因型 AS2386、 AS2393、 AS2399、 AS2404、 AS2405 和 AS2407 的成熟胚再生率分别为 52.7%、 41.3%、 56.3%、 52.6%、 61.7%、 60.8%。 0033 实施例 2 利用本发明方法对不同年份收获的种子进行成熟胚组织培养的情况比较 0034 1.1 按照实施例 。
23、1 中方法对分别于 2009 年、 2010 和 2011 年收获的 6 种基因型 (AS2386、 AS2393、 AS2399、 AS2404、 AS2405 和 AS2407) 的节节麦进行种子处理、 诱导培养、 分 化培养及生根培养。 0035 1.2 不同年份收获的种子成熟胚组织培养的情况比较结果如表 1 所示 ： 0036 表 1 不同年份收获的种子成熟胚组织培养的情况比较 0037 说 明 书 CN 102668983 B 7 5/6 页 8 0038 从表 1 可以看出， 不同年份收获的 6 种不同基因型的节节麦成熟胚接种在本发 明的愈伤诱导培养基上后， 其胚性愈伤出愈率和出苗。
24、率均无明显差异， 其中以 AS2405 和 AS2407 出愈率最高， 达到了 80% 以上， 使得二者的出苗率也表现最好， 达到 58% 以上。 0039 实施例 3 本发明的节节麦成熟胚的组织培养方法与常规组培方法的对比 0040 1.1 利用本发明方法进行节节麦成熟胚的组织培养再生 0041 选取 6 种节节麦基因型 (AS2386、 AS2393、 AS2399、 AS2404、 AS2405 和 AS2407)， 按实施例 1 的节节麦成熟胚培养再生方法进行操作， 待分化出绿苗转入生根培养基后进行结果分析。 0042 1.2 利用现有麦类成熟胚组织培养再生方法进行节节麦成熟胚组织培养。
25、再生 0043 1.2.1 种子处理 ： 同样选取上述6种基因型的节节麦成熟种子， 将浸泡处理后的种 说 明 书 CN 102668983 B 8 6/6 页 9 子， 再用 25% 次氯酸钠振荡消毒 15min， 无菌水冲洗三次后， 用刀片将成熟胚从种子中分离， 并切除胚尖， 按胚轴向上接种在常规诱导培养基上， 每皿接种 40 粒成熟胚。将接种于诱导 培养基的成熟胚置于 25 C, 暗培养 15 天后培养出愈伤组织。其中， 常规诱导培养基组成 为 ： MS 基本培养基 +KT 1.0mg/L+2,4-D 3mg/L+ 蔗糖 40g/L+ 琼脂 7.5g/L， pH 6.0。分别统 计胚性愈伤。
26、出愈率 ( 成熟胚胚性愈伤出愈率 = 胚性愈伤数 / 接种胚数其中， 节节麦 AS2399 和 AS2407 的愈伤生长情况分别如图 1B 和图 2B 所示。 0044 1.2.2 分化培养 ： 将 1.2.1 中获得的成熟胚愈伤组织， 分别转入常规分化培养基。 置于 25 C 下培养， 光照 16 小时 / 天， 光照强度为 4000-6000lux。培养三周后， 开始出现 绿苗。节节麦 AS2399 和 AS2407 的绿苗分化情况分别如图 3B 和图 4B 所示。 0045 其中， 常规分化培养基组成为 ： MS 基本培养基 +KT1.0mg/L+6-BA 0.5mg/L+IAA 1.0。
27、mg/L+ 蔗糖 40g/L+ 琼脂 7g/L， pH 6.0。 0046 1.2.3 生根培养 ： 当节节麦 6 种基因型 (AS2386、 AS2393、 AS2399、 AS2404、 AS2405 和 AS2407) 各自成熟胚愈伤组织分化出的再生芽高度达 2-3cm 时， 转入生根培养基中， 2-3 周后长出不定根， 当不定根长度达到 3-4cm 时， 取出植株， 将根部培养基洗净， 移入土壤中 培养。分别测定 6 个基因型的成熟胚的再生率 ( 成熟胚再生率 = 再生植株 / 接种愈伤数 )。 0047 1.2.4 两种方法对节节麦成熟胚组织进行培养的结果如表 2 所示 ： 0048。
28、 表 2 两种方法对节节麦成熟胚组织进行培养的结果 0049 0050 从表 2 可以看出， 6 种不同基因型的节节麦成熟胚接种在不同的愈伤诱导培养基 上， 胚性愈伤出愈率和最终的再生率存在较大的差异， 采用本发明的方法， 节节麦的成熟胚 愈伤出愈率比常规方法平均提高 13.4%， 无需继代即可获得大量的胚性愈伤， 且获得的胚性 愈伤质地致密、 表面光洁， 愈伤质量高， 最终使利用本发明方法的节节麦成熟胚再生率比现 有技术显著提高 ( 再生率平均提高 13.3%)。 0051 虽然， 上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述， 但在 本发明基础上， 可以对之作一些修改或改进， 这对本领域技术人员而言是显而易见的。因 此， 在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进， 均属于本发明要求保护的范围。 说 明 书 CN 102668983 B 9 1/2 页 10 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 102668983 B 10 2/2 页 11 图 3 图 4 说 明 书 附 图 CN 102668983 B 11 。