技术领域
本发明涉及一种奶牛金黄色葡萄球菌乳房炎的亚单位疫苗的制备方法及应用。属 于生物疫苗制备技术领域。
背景技术
奶牛乳房炎(Mastitis)是成年奶牛最普遍的感染性疾病，主要是奶牛乳腺组织受 到微生物感染而引起的一种炎症，多发生于产后哺乳期，该病广泛存在于世界各地，为奶牛 常见病、多发病，是造成乳制品业经济损失最为严重的疾病。引起奶牛乳房炎的病原微生物 大约有150多种，主要以金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、无乳链球菌为主，这三种细菌引起的 奶牛乳房炎占总发病率的90％以上，其中尤以金黄色葡萄球菌为最。
当前奶牛乳房炎的治疗方法主要是采用抗生素治疗，抗生素用于治疗奶牛乳房炎 已有50多年的历史了，其在奶牛乳房炎的防治中起了一定的作用，但由于长期单一的、大剂 量的不科学使用抗生素，引起了敏感性细菌的消除，耐药性细菌逐渐占了主流，尤其是金黄 色葡萄球菌的耐药问题日益严重，导致了抗生素治疗收效甚微。
用疫苗来防治奶牛乳房炎具有很好的前景，首先，疫苗可以预防奶牛感染病原菌 而引起乳房炎；其次，疫苗有助于降低乳腺感染的严重程度，控制亚临床型乳房炎；第三， 使用疫苗防治乳房炎不会存在乳汁中抗生素残留问题；最后是操作简便，费用低廉。当前， 研制成功的疫苗很少，且大都数为弱毒活菌苗或灭活菌苗，在生产实践中，对乳房炎的防治 有一定作用，然而随着大规模集约化养殖的发展，人工致弱菌株存在着同源重组、自身毒力 返强等潜在可能，而灭活疫苗也存在使用剂量大、免疫期短等不足，为提高传统疫苗的安全 性与免疫保护力，高效、廉价的新型疫苗研制极其重要。
金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus，简称SA)，也称“金葡菌”，是一种革兰氏 染色阳性的球菌，直径0.8μm，在显微镜下排列成葡萄串状，并可以产生金黄色的色素，并 因此而得名。金葡菌是引起慢性/隐性奶牛乳房炎的主要病原菌之一，可以极大的影响牛奶的 产量和质量，给奶制品产业带来巨大的经济损失。有研究表明，金黄色葡萄球菌分泌的β溶 血素是导致奶牛乳房炎的一个致病因子。
金葡菌可产生多种毒素和酶。β溶血素(亦称β-toxin)就是其毒素之一，它具有白 细胞毒性、溶血活性等特性。β溶血素是由330个氨基酸组成的单链多肽，分子量为37～39 kDa，其等电点(pI)高于9。β溶血素是一种镁依赖神经酯酶，具有磷脂酶C(Phospholipase C，PLC)活性，可以分解甘油磷酸胆碱，β溶血素依靠这种酶活性，水解组成细胞膜的磷脂 双分子层，从而破坏细胞膜的完整性，导致细胞裂解，引起溶血。将β溶血素进行定点突变 后，突变体就失去了溶血活性，不具有毒性，但仍然保留完好的免疫原性，可直接用来免疫 动物，是金葡菌亚单位疫苗的重要候选蛋白之一。
发明内容
本发明的目的在于提供一种奶牛金黄色葡萄球菌β-溶血素亚单位疫苗的制备方法 及应用。重组蛋白与合适佐剂混合制备的亚单位疫苗与致病菌的自然感染过程相似，可促进 细胞免疫，诱导免疫记忆和引起广泛的免疫应答，产生很好的交叉保护反应，是一种更加安 全稳定、制备简单、应用方便、价格低廉的新型疫苗。
所述的重组β-溶血素蛋白来自金黄色葡萄球菌，编码该蛋白的核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示。
本发明还提供一种奶牛金黄色葡萄球菌β-溶血素亚单位疫苗的制备方法，主要包 括以下步骤：1)定点突变金黄色葡萄球菌β-溶血素蛋白基因；2)将定点突变的β-溶血素蛋 白基因克隆到pET28a载体中；3)将步骤2)获得的表达载体转化E.coliBL21(DE3)，诱导 表达获得重组β-溶血素蛋白；4)使用镍柱亲和层析纯化步骤3)得到的重组β-溶血素蛋白； 5)将纯化得到的重组β-溶血素蛋白与药学上可接受的佐剂(如ISA206VG佐剂)充分混匀 后得到奶牛金黄色葡萄球菌乳房炎重组亚单位疫苗。
与现有技术相比，本发明具有的优点和效果如下：奶牛乳房炎亚单位疫苗即利用 致病菌主要的保护性免疫原制成不含有核酸、能诱发机体产生抗体的疫苗，将其直接注入机 体而激活免疫系统，以达到预防和治疗疾病的目的。重组蛋白与合适佐剂混合制备的亚单位 疫苗与致病菌的自然感染过程相似，可促进细胞免疫，诱导免疫记忆和引起广泛的免疫应答， 产生很好的交叉保护反应，是一种更加安全稳定、制备简单、应用方便、价格低廉，且省时 省力具有显著疗效的新型疫苗。
附图说明
图1、β-溶血素分段PCR产物琼脂糖凝胶电泳结果，M：MarkerDL2,000；1是β 溶血素定点突变片段1(509bp)，2是β溶血素定点突变片段2(468bp)。
图2、β-溶血素定点突变重叠PCR琼脂糖凝胶电泳结果，M：MarkerDL5,000；1 是β溶血素定点突变重叠PCR产物(936bp)。
图3、β-溶血素定点突变重组质粒酶切鉴定琼脂糖凝胶电泳结果，M：Marker DL5,000；1是pET28a-β溶血素定点突变3号质粒(NdeI/XhoI)，2是pET28a-β溶血素定点 突变4号质粒(NdeI/XhoI)。
图4、β-溶血素镍柱亲和层析纯化结果，FT：flowthrough；50mM：50mM咪唑； 100mM：100mM咪唑；150mM：150mM咪唑。
图5、重组β-溶血素蛋白复性结果。
图6、ELISA检测β-溶血素亚单位疫苗免疫小鼠后效价结果。
图7、免疫攻毒后小鼠存活率实验结果。
具体实施方式
实施例1表达载体pET28a-β-溶血素定点突变的构建
以临床分离到的奶牛金黄色葡萄球菌基因组为模板，将β-溶血素分成两段进行 PCR，结果如图1所示。
1.1加样体系为(50μl)：
1.2PCR扩增程序：
1.3胶回收DNA片段：
(1)将步骤1.2的反应液进行0.8％琼脂糖凝胶电泳(110V30min)；
(2)在紫外灯下，切胶回收DNA片段于1.5mlEP管中；
(3)向步骤(2)中的1.5mlEP管中加入500μlPCbuffer，50℃，水浴10min；
(4)将步骤(3)中溶液移至吸附柱中心，静置2min，离心，12,000rpm，30s；
(5)弃废液，向吸附柱中心加入600μlPWbuffer，静置3min，12,000rpm，30s；
(6)重复步骤(5)；
(7)空吸附柱离心，12,000rpm，1min；
(8)向吸附柱中心加入30μlddH2O，静置3min，离心(12,000rpm，2min)；
(9)收集步骤(8)DNA样品进行电泳。
1.4重叠PCR，将β-溶血素进行定点突变，结果如图2所示：
加样体系为(50μl)：
PCR扩增程序：
1.5双酶切反应(50μl体系)：
在1.5mlEP管中按照步骤1.5进行加样、混匀，而后将这两个50μl反应液置于 37℃恒温水浴锅中，水浴3h。
1.6胶回收DNA片段：
(1)将步骤1.5的反应液进行0.8％琼脂糖凝胶电泳(110V30min)；
(2)在紫外灯下，切胶回收DNA片段于1.5mlEP管中；
(3)向步骤(2)中的1.5mlEP管中加入500μlPCbuffer，50℃，水浴10min；
(4)将步骤(3)中溶液移至吸附柱中心，静置2min，离心，12,000rpm，30s；
(5)弃废液，向吸附柱中心加入600μlPWbuffer，静置3min，12,000rpm，30s；
(6)重复步骤(5)；
(7)空吸附柱离心，12,000rpm，1min；
(8)向吸附柱中心加入30μlddH2O，静置3min，离心(12,000rpm，2min)；
(9)收集步骤(8)DNA样品进行电泳。
1.7连接反应(10μl体系)：
在1.5mlEP管中按照上述体系进行加样、混匀，而后将上述反应液置于16℃，水 浴16h后取出，65℃，水浴15min后进行灭活，将样品4℃保存。
1.8转化实验：
(1)取出步骤1.7的反应液，向其中添加100μlE.coliDH5β感受态细胞，混匀；
(2)冰浴30min；
(3)42℃，水浴100s；
(4)冰浴2min；
(5)取出，向EP管中加入600μl液体LB培养基，37℃，水浴1h；
(6)取出，离心(8,000rpm，2min)，去掉600μl，剩余100μlLB重悬菌体；
(7)取菌液铺板于LK平板中(Kan浓度为50μg/ml)，将LK平板置于生化恒温 培养箱中，37℃培养12h。
1.9重组质粒提取及酶切鉴定：
(1)从转化平板中挑取单克隆至3mlLK液体培养基中，37℃，260rpm摇菌过 夜；
(2)取1ml菌液至1.5mlEP管中，离心(12,000rpm，2min)，弃上清；
(3)向步骤(2)中的EP管中加入250μlP1buffer，重悬菌体；
(4)向步骤(3)溶液中加入250μlP2buffer，温和混匀，静置2min；
(5)向步骤(4)溶液中加入350μlP3buffer，温和混匀；
(6)将步骤(5)溶液，离心(12,000rpm，10min)；
(7)将步骤(6)中的上清溶液移至吸附柱中心，离心(8,000g，30s)；
(8)弃废液，向吸附柱中心加入500μlwashbuffer，离心(9,000g，30s)；
(9)重复步骤(8)；
(10)空吸附柱离心(9,000g，1min)；
(11)吸附柱中加入30μlElutionbuffer，静置2min，离心(12,000rpm，2min)；
(12)收集步骤(11)DNA样品进行电泳；
(13)如步骤1.5所示，对提取到的质粒进行酶切鉴定，而后进行0.8％琼脂糖凝 胶电泳。
重组质粒酶切鉴定结果见图3。
实施例2转化大肠杆菌BL21
吸取1μl质粒加入100μlBL21感受态细胞中，冰浴30min；
42℃热激90s；
冰浴2min；
在超净台内加入900μl无抗性的LB培养液；
37℃180rpm摇1h；
吸取100μl菌液涂卡那抗性LB平板，37℃过夜培养。
实施例3大量诱导表达
挑菌：挑取单克隆至50ml卡那抗性LB培养液中，37℃过夜培养；
转接：按1∶100比例转接菌液至500ml卡那抗性LB培养液，共摇3.5L，37℃220 rpm培养2-2.5h至OD600值到0.6；
诱导：菌液OD600值到0.6后，加入500μlIPTG(1M)至IPTG终浓度为1mmol/L， 37℃220rpm诱导培养4h；
菌体收集：菌液6,000rpm离心10min，收集菌体；用40mlPBS清洗菌体，6,000 rpm离心10min，收集菌体，置于-20℃保存；
实施例4β-溶血素蛋白包涵体制备
(1)菌体破碎：用裂解液(50mMNaH2PO4，500mMNaCl，pH8.0)重悬菌体，用 注射器将菌体吹打均匀，避免块状沉淀物产生；用细胞破碎机Avestin裂解菌液；破碎后离心 菌体，12,000rpm，4℃离心30min，弃上清，保留沉淀物；
(2)将沉淀物重浮于25ml溶液中(裂解液，100μMPMSF，10mMEDTA，10mM Benzamidine，0.01％NaN3)；12,000rpm，4℃，离心20min，弃上清，保留沉淀物；
(3)重复步骤(2)一次；
(4)将沉淀物重悬于25ml溶液中(裂解液，100μMPMSF、10mMMgCl，10mM Benzamidene，0.01％NaN3)；12,000rpm，4℃，离心20min，弃上清，保留沉淀物；
(5)称沉淀物重量，按1g/管分装于1.5mlEP管，-20℃保存。
实施例5镍柱亲和层析纯化重组β-溶血素蛋白
取1g包涵体加到30ml变性溶液中(50mMNaH2PO4，500mMNaCl，8M尿素， pH8.0)，室温下搅拌过夜；12,000rpm，22℃，离心20min，取上清，吸取20μl样品待SDS-PAGE 检测；
柱平衡：取4mlNi-agarose装柱，用变性溶液平衡10个柱体积，排出缓冲液，使 液面高于填料1mm，以免干柱；
结合：平衡好的填料与样品液混合，冰上摇晃1h；
结合完成后，混合液加入到空柱中，收集Flowthrough，留20μl样品检测；
用30倍柱体积的溶液(50mMNaH2PO4，500mMNaCl，8M尿素，0.1％Triton X114，pH8.0)洗柱至流出液检测不到蛋白为止，随后再用10倍柱体积的变性溶液洗柱，留 20μl检测；
洗脱：变性溶液中加入咪唑，配制50mM、100mM和150mM的咪唑洗脱液，每 次用5ml咪唑洗脱液进行洗脱，每个浓度进行5次洗脱；
SDS-PAGE分析；结果如图4所示。
实施例6重组β-溶血素蛋白的复性
剪取合适长度透析袋，用透析液(50mMNaH2PO4，150mMNaCl，pH7.4)浸润， 先用透析夹子夹住一端，再将待复性样品液加入到透析袋中，透析夹子夹住顶端，放置于2L 透析液中，4℃透析12h；
弃去透析液，再加入2L新鲜的透析液，继续透析2h；透析结束后12,000rpm，4℃， 离心10min，取上清；
BCA法测定蛋白浓度后分装并保存于-80℃；SDS-PAGE分析结果如图5所示。
实施例7重组β-溶血素蛋白亚单位疫苗制备
按照实验需要，计算疫苗溶液各成分的量，使疫苗中重组β-溶血素蛋白终浓度为 25μg/ml，其中重组β-溶血素蛋白与佐剂ISA206VG体积比为46∶54；
将稀释混匀好的重组β-溶血素蛋白溶液及ISA206VG佐剂放置在恒温水浴锅内加 热至32℃±1℃，待温度稳定后将抗原加入到佐剂管中，震荡器震荡10min进行预乳化；
将预乳化完的疫苗放置于盛满冰的烧杯中，固定在预先处理好的超声波细胞破碎 仪上进行乳化；
乳化结束后，观察乳化效果：取部分疫苗置于离心管中，3,000rpm离心15min， 疫苗不分层为合格；
检测合格的疫苗分装到15ml离心管中，标记，封口膜封口，置于4℃保存。
实施例8小鼠免疫实验
将疫苗拿到室温(25℃)放置，使疫苗温度恢复到常温；
给小鼠称重、分组并标记，一组为免疫试验组(n＝6)，免疫β-容血素亚单位疫苗； 另一组为对照组(n＝6)，免疫PBS，并记录数值；
用1ml注射器吸取1ml疫苗，左右后腿各注射50μl疫苗。
实施例9小鼠免疫后攻毒实验
挑取SA单菌落(菌株为本实验室保存的HB0911-3菌株)于5ml液体肉汤培养基 中，220rpm、37℃摇菌过夜；
按百分之一的体积(1ml)将摇过夜的细菌接种于100ml新鲜液体肉汤培养基中， 220rpm、37℃摇菌过夜；
将100ml菌液装入到500ml离心瓶中，8,000rpm离心10min，吸去培养基，菌 体用100mlPBS重悬，重复上述步骤3次，最后用5mlPBS重悬混匀；
将菌液做10,000倍稀释后计数。根据菌液的浓度，将原菌液稀释到5×108CFU/ml (2MLD50)；
给免疫组和对照组小鼠称重，一组为免疫试验组(n＝6)，另一组为对照组(n＝6) 记录数值；
用1ml注射器吸取菌液，按照各浓度细菌对应的小鼠进行尾静脉注射，注射量为 200μl/20g小鼠。
连续观察小鼠的生存状况，记录每一只小鼠的死亡时间；攻毒后小鼠存活率结果如 图7所示。
实施例10ELISA检测β-溶血素抗体效价
(1)包被：用包被液(50mM碳酸盐缓冲液，pH9.5)稀释纯化的检测用蛋白至 0.5μg/ml，酶标板上每孔加入100μl，封口膜封好后4℃冰箱放置过夜；
(2)洗涤：从冰箱取出酶标板后，放入洗板机中洗涤，洗涤液用PBST；
(3)封闭：每孔加入200μl封闭液(5％脱脂奶)，封口膜封好后37℃孵育2h；
(4)样品准备：按已知的信息和需要用量，用封闭液将血清进行适度稀释；
(5)洗涤：同(2)；
(6)加样：加入稀释血清，同时用封闭液做阴性对照，37℃孵育1h；
(7)洗涤：同(2)；
(8)加二抗：每孔加入适度稀释的HRP标记的二抗100μl，37℃孵育0.5h；
(9)洗涤：同(2)；
(10)显色：避光条件下每孔加入100μl的TMB显色液，37℃孵育10min；
(11)终止：每孔加入50μl终止液(2M的H2SO4)，终止反应；
(12)检测：于450nm波长测定样品OD值，分析数据；
(13)结果分析：判断抗体阳性的标准：P/N≥2.1，OD450≥0.1。