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1、(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201610027329.6 (22)申请日 2016.01.13 A61K 31/704(2006.01) A61K 31/522(2006.01) A61P 31/20(2006.01) (71)申请人 中国药科大学 地址 211198 江苏省南京市龙眠大道 639 号 (72)发明人 王广基 张经纬 陈倩莹 周芳 (54) 发明名称 一种治疗乙型病毒性肝炎的新型药物组合 (57) 摘要 本技术发明涉及一种新型药物组合， 具体涉 及甘草酸二铵在提高恩替卡韦治疗乙型肝炎疗效 中的应用。药代结果显示分别在整体动物和细胞 /亚细胞水平， 甘。
2、草酸/甘草次酸增加恩替卡韦血 浆 / 肝组织内的药物浓度和肝细胞 / 亚细胞内药 物摄取量。药效学结果也发现在 HBV 转染的体外 细胞模型及 HBV 小鼠模型上甘草酸 / 甘草次酸增 加恩替卡韦抗病毒药效。 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书4页 附图2页 CN 105687220 A 2016.06.22 CN 105687220 A 1.提供一种治疗乙型病毒性肝炎的药物组合物， 其特征在于： 运用药代药效的研究手 段， 从整体动物和细胞/亚细胞两个水平， 阐明恩替卡韦与甘草酸二铵药物联用增效机制。 2.如权利要求1所。
3、述的对治疗乙型病毒性肝炎的药物组合联用增效的机制研究， 其特 征在于： 联用后血浆中恩替卡韦浓度未发生明显变化， 在肝脏组织， 肝细胞及胞浆中恩替卡 韦药物量增加。 药效学结果也发现在HBV转染的体外细胞模型及HBV小鼠模型上甘草酸/甘 草次酸增加恩替卡韦抗病毒药效， 病毒拷贝数与单用组相比降低。 权 利 要 求 书 1/1 页 2 CN 105687220 A 2 一种治疗乙型病毒性肝炎的新型药物组合 技术领域 0001 本发明涉及一种新型药物组合物， 具体涉及中药甘草的主要成分甘草酸在提高核 苷类药物恩替卡韦治疗乙型肝炎疗效中的应用。 背景技术 0002 乙型病毒性肝炎是由乙肝病毒(HBV。
4、)引起、 以肝脏炎性病变为主， 并可引起多器官 损害的一种传染性疾病， 慢性乙肝甚至可导致肝硬化或肝癌。 目前， 乙肝广泛流行于世界各 国， 发病率逐年提高， 肝炎病毒携带者的数目也在不断增加， 成为我国当前流行最为广泛、 危害性最严重的疾病之一。 由于乙肝病毒变异迅速， 容易造成抗乙肝病毒药物的耐药； 同 时， 由于乙肝患者病程长、 用药时间长， 很容易导致肝损伤。 目前有关乙型肝炎的治疗方法 主要是抗病毒治疗 ， 抑制HBV的持续复制以达到延缓疾病进展的目的。 恩替卡韦 (Entecavir， ETV)为抗乙肝病毒的一线药物， 抑制HBV多聚酶的起始、 逆转录及DNA正链合成 过程， 具有。
5、较强的抗病毒效果， 且副作用少， 病毒变异力低， 已经被广泛应用于慢性乙型肝 炎的治疗。 甘草酸是中药甘草有效成分的提取物， 具有一定的抗炎、 保护肝细胞膜及改善肝 功能的作用。 临床数据显示， 当恩替卡韦与甘草酸二铵(Diammonium glycyrrhizinate， GLN)联合使用时， 具有更强的病毒性肝炎治疗作用， 同时改善肝功能及延缓肝纤维化发生。 恩替卡韦作为抗病毒类药物， 甘草酸二铵作为保肝药物， 因研究两药联合应用机制成为进 一步开发病毒性肝炎治疗药物组合的关键之一。 0003 甘草为豆科植物， 性平味甘， 具有补气益脾、 和中缓急、 调和诸药等功效。 甘草酸为 甘草的主要。
6、成分， 是一种五环三萜系列皂苷， 可水解为甘草次酸(Glycyrrhetinic acid， GA)和两分子葡萄糖醛酸， 具有诸多药理活性， 包括抗炎、 免疫调节、 抗肝损伤等作用。 其结 构式如下： 0004 0005 专利CN200610018367.1公开了甘草酸或甘草次酸在制备治疗炎症性肠病药物中 的应用。 甘草酸或甘草次酸可通过抑制炎症反应及抗氧化作用达到抗炎症性肠病的作用。 专利CN200510045377.X公开了一种主要用于肝脏疾病的药物组合物， 由枸杞子、 当归、 甘草 酸制成， 共同发挥治疗病毒性肝炎、 药物性肝损伤、 脂肪肝等功效。 专利CN98805037.4公开 了含。
7、有甘草酸和至少一种具有抗病毒活性的蛋白质的抗病毒药物组合物。 发明内容 说 明 书 1/4 页 3 CN 105687220 A 3 0006 本发明目的是为乙肝疾病治疗提供甘草酸二铵-恩替卡韦这一新型药物组合， 即 药物联用相对于恩替卡韦自身具有增效作用。 药代结果显示分别在整体动物和细胞/亚细 胞水平， 甘草酸/甘草次酸增加恩替卡韦血浆/肝组织内的药物浓度和肝细胞/亚细胞内药 物摄取量。 药效学结果也发现在HBV转染的体外细胞模型及HBV小鼠模型上甘草酸/甘草次 酸增加恩替卡韦抗病毒药效。 0007 本发明的研究方案是(1)在整体动物水平考察甘草酸二铵-恩替卡韦联合用药后， 恩替卡韦的血浆。
8、药代动力学及组织内浓度的变化， 从整体动物角度判断甘草酸二铵-恩替 卡韦联用增效的可能机制。 (2)运用肝细胞模型， 考察恩替卡韦在肝细胞内的摄取、 亚细胞 分布等细胞药代动力学行为， 以及甘草次酸对上述过程的影响。 (3)运用HBV转染的 HepG2215细胞模型， 考察药物联用后， 细胞上清病毒拷贝数与单用组相比是否降低。 (4)运 用HBV转基因小鼠模型， 考察长期药物联用后， 小鼠血浆中HBV病毒拷贝数与单用组相比是 否降低。 0008 本发明的研究结果主要包括联用甘草酸二铵对恩替卡韦的血浆药代动力学过程 无显著影响， 但恩替卡韦在肝脏组织内的分布量增加； 联用甘草次酸后恩替卡韦在细胞。
9、核 及胞浆内的分布量均得到提高； 体外HepG2215细胞模型及HBV转基因小鼠模型中的病毒拷 贝指标， 联用组与单用组相比均出现降低。 附图说明 0009 图1： 联用甘草酸二铵后恩替卡韦大鼠药代动力学变化 0010 图2： 联用甘草酸二铵后恩替卡韦大鼠组织分布量变化 0011 图3： 甘草次酸对恩替卡韦肝细胞摄取的影响 0012 图4： 联用甘草次酸后恩替卡韦亚细胞分布变化 0013 图5： 联用甘草次酸对恩替卡韦在HepG2215模型上病毒抑制IC50的影响 0014 图6： 长期联用甘草酸二铵对恩替卡韦抑制HBV小鼠病毒复制过程的影响 具体实施方式 0015 实施例1： 测定单次及多次。
10、联用甘草酸二铵后恩替卡韦大鼠血浆药物浓度 0016 主要步骤如下： 0017 雄性SD大鼠20只， 按体重随机分配成分为四组， 每组5只。 1.单次联用给药： 大鼠灌 胃(i.g.)给予0.09mg/kg ETV(control group)， 100mg/kg GLN+0.09mg/kg ETV(test group)2.长期联用给药： 大鼠连续10天， 每天灌胃(i.g.)给予0.09mg/kg ETV(control group)， 100mg/kg GLN+0.09mg/kg ETV(test group)， 第11天正常给药GLN后两组均灌胃给 予0.09mg/kg ETV。 实验过。
11、程中所用采血管预先按1 l/20 l(v/v， 抗凝剂/全血)比例加入肝 素作为血浆抗凝剂。 眼眶静脉丛采集给药前及给药后0.167， 0.5， 1， 1.5， 2， 4， 8， 24h静脉血 200 l至采血管中， 以8000 rpm离心5 min后转移上层血浆， 处理后经LC-MS/MS测定各组血 浆中的恩替卡韦经时浓度并计算主要药代动力学参数， 结果如下： 0018 表1.长、 短期联用甘草酸二铵后恩替卡韦主要药代动力学参数 说 明 书 2/4 页 4 CN 105687220 A 4 0019 0020 实施例2： 测定单次及多次联用甘草酸二铵后恩替卡韦大鼠组织中的药物浓度 0021 。
12、主要步骤如下： 0022 雄性SD大鼠60只， 按体重随机分配成分为十二组， 每组5只。 1.单次联用给药： 大鼠 灌胃(i.g.)给予100mg/kg GLN6h后， 灌胃(i.g.)给予0.09mg/kg ETV(test group)， 或直接 灌胃(i.g.)给予0.09mg/kg ETV(control group)， 再经过1， 2， 4h后将大鼠股动脉放血处 死， 并取组织。 2.长期联用给药： 大鼠连续10天， 每天灌胃(i.g.)给予100mg/kg GLN6h后， 灌 胃(i.g.)给予0.09mg/kg ETV(test group)， 或直接灌胃(i.g.)给予0.09。
13、mg/kg ETV (control group)， 第11天正常给药GLN后两组均灌胃给予0.09mg/kg ETV。 实验过程中所用 采血管预先按1 l/20 l(v/v， 抗凝剂/全血)比例加入肝素作为血浆抗凝剂， 收集全血以 8000rpm离心5min后转移上层血浆， 测定各组血浆及组织中的恩替卡韦浓度。 0023 实施例3： 测定甘草次酸对恩替卡韦肝细胞摄取的影响 0024 主要步骤如下： 0025 在37， 含5CO2的环境中， 选用HepG2细胞培养于高糖DMEM培养基中， 含10胎 牛血清(FBS)， 青霉素100U/ml， 链霉素100 g/ml， 当细胞达90融合时， 消化。
14、并接种于24孔 板中。 24孔板上的细胞培养达90融合后， 分别加入含药ETV(20 M)， GA(10 M)+ETV(20 M)。 计时， 置37摇床中分别孵育0.167， 0.33， 0.5， 1， 2， 4h。 细胞超声破碎后， 运用LC-MS/MS方 法测定药物浓度并取细胞悬液以BCA法定蛋白。 药物的吸收通常用细胞中每毫克蛋白质吸 收的药物量表示。 0026 实施例4： 联用甘草次酸后恩替卡韦亚细胞分布量变化 0027 主要步骤如下： 0028 T-75培养瓶内接种HepG2细胞， 当细胞达90融合后给药。 联合给药组预给含甘草 次酸(10 M)的Hank s液， 30 min后吸干。
15、重新加入含甘草次酸(10 M)+恩替卡韦(20 M)的 Hank s液， 同时给予相同浓度恩替卡韦单独给药组作为平行对照(n3)， 置37摇床中分 别孵育0.167， 0.33， 0.5， 1， 2， 4h。 细胞收集后转移至离心管中， 1000rpm*5min离心收集。 在 细胞沉淀中加入裂解液， 之后按细胞核/线粒体分离试剂盒(凯基生物)说明书操作， 分离出 细胞核， 线粒体及胞浆， 置-80冰箱保存。 LC-MS/MS方法测定药物浓度并取细胞核， 线粒体 和胞浆悬液以BCA法定蛋白。 0029 实施例5： 联用甘草次酸对恩替卡韦在HepG2215模型上病毒抑制IC50的影响 0030 主。
16、要步骤如下： 0031 在37， 含5CO2的环境中， 选用HepG2215细胞培养于高糖DMEM培养基中， 含10 胎牛血清(FBS)， 青霉素100U/ml， 链霉素100 g/ml， 当细胞达90融合时， 消化并接种于48 说 明 书 3/4 页 5 CN 105687220 A 5 孔板中。 48孔板上的细胞培养达90融合后， 分别加入含药不同浓度恩替卡韦(0.01， 0.1， 0.5， 1， 5， 20 M)， 甘草次酸(10 M)+恩替卡韦(0.01， 0.1， 0.5， 1， 5， 20 M)的培养基各0.5ml， 于细胞培养箱中孵育72h后， 迅速收集细胞上清0.2ml， 根据。
17、DNA提取试剂盒(Takara)要求提 取总DNA， 纯化后进行荧光定量PCR分析， 比较各组病毒拷贝数并计算IC50值。 0032 实施例6： 长期联用甘草酸二铵对恩替卡韦抑制HBV小鼠病毒复制过程的影响 0033 主要步骤如下： 0034 选用HBV转基因小鼠30只， 按病毒拷贝数不同随机分配成分为六组， 每组5只。 组别 包括空白对照组， 恩替卡韦单用组(0.15mg/kg)， 甘草酸二铵单用组(200mg/kg)， 恩替卡韦 联用低剂量甘草酸二铵组(100mg/kg)， 恩替卡韦联用高剂量甘草酸二铵组(200mg/kg)， 连 续22天， 给药组中恩替卡韦每天灌胃(i.g.)给药， 甘草酸二铵隔天给药。 在给药后第0， 3， 7， 15， 22天收集少量眼眶血， 根据DNA提取试剂盒(Takara)说明提取总DNA， 荧光定量PCR法测 定血浆中病毒拷贝数。 实验过程中所用采血管预先按1 l/20 l(v/v， 抗凝剂/全血)比例加 入肝素作为血浆抗凝剂， 收集全血以8000rpm离心5min后转移上层血浆。 说 明 书 4/4 页 6 CN 105687220 A 6 图1 图2 说 明 书 附 图 1/2 页 7 CN 105687220 A 7 图3 图4 图5 图6 说 明 书 附 图 2/2 页 8 CN 105687220 A 8 。