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1、(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201410504479.2 (22)申请日 2014.09.26 A61K 35/14(2006.01) A61K 35/28(2006.01) A61K 38/00(2006.01) A61P 31/20(2006.01) A61P 31/04(2006.01) (71)申请人 天津嘉瑞生物科技有限公司 地址 301702 天津市武清区地毯产业园宏旺 道 8 号 (72)发明人 陈庆忠 安同伟 刘芳 (54) 发明名称 抗鸡传染性喉气管炎病毒特异性转移因子的 制备方法 (57) 摘要 本发明涉及一种抗鸡传染性喉气管炎病毒特 异性转移因。
2、子的制备方法。本发明以鸡脾脏或外 周血为原料， 制成淋巴细胞单层， 然后用植物血凝 素和鸡传染性喉气管炎病毒诱导培养淋巴细胞， 体外生产抗鸡传染性喉气管炎病毒特异性转移因 子。本发明所制备的特异性转移因子可以用于预 防和治疗鸡传染性喉气管炎病， 同时可以提高鸡 的免疫力。本发明具有特异性强、 成本低、 产出率 高、 效果好等优点， 是一种较为理想的鸡传染性喉 气管炎病毒转移因子制备方法。 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书4页 CN 105497065 A 2016.04.20 CN 105497065 A 1/1 页 2。
3、 1. 一种抗鸡传染性喉气管炎病毒特异性转移因子的制备方法， 其特征在于， 该制备方 法的步骤如下 ： (1)无菌环境下采取鸡脾脏或鸡血， 用鸡脾脏或外周血制备淋巴细胞单层。 无菌静脉采 取动物全血20-30ml， 加0.8肝素溶液0.3m1抗凝， 静置30-60min， 用带胶球吸管吸取红细 胞层以上的所有血浆， 特别是紧接红细胞层上的白细胞层要尽量吸取， 分装于消毒离心管 内， 用 PBS(pH 为 7.2) 液反复洗涤 2-3 次， 离心速度 800-1200 转 / 分， 然后用含 30犊牛血 清水解乳蛋白 40ml 进行白细胞培养， 混合均匀后分装于容量 100ml 细胞培养瓶中， 。
4、塞紧瓶 塞， 置 37细胞培养箱中， 经 2-3 天， 白细胞均匀贴壁， 即制成淋巴细胞单层。 (2) 将步骤 (1) 制备的淋巴细胞单层进行传代培养。显微镜下观察步骤 (1) 制备的淋 巴细胞单层， 确认其生长状态良好即可进行细胞的传代培养。 (3) 抗鸡传染性喉气管炎病毒特异性转移因子的制备 ： 当步骤 (2) 传代的淋巴细胞 长成单层后， 用植物血凝素 ( 终浓度为 100mg/L) 和鸡传染性喉气管炎病毒 ( 终浓度为 1000-1500血凝单位/ml)诱导培养， 离心培养2-3天后， 8000转/分、 20-30min离心细胞培 养液， 取上清液， 将其置于 4下磁力搅拌透析 18-。
5、24h， 超滤除菌， 即获得体外制备抗鸡传 染性喉气管炎病毒特异性转移因子。 2. 根据如权利要求 1 所述的抗鸡传染性喉气管炎病毒特异性转移因子的制备方法， 其 特征在于 ： 刺激鸡脾细胞和鸡血淋巴细胞增殖的植物血凝素剂的质量浓度为 50-100mg/L。 3. 根据如权利要求 1 所述的抗鸡传染性喉气管炎病毒特异性转移因子的制备方法， 其 特征在于 ： 制备淋巴细胞单层以及细胞培养均在无菌状态下进行。 4. 根据如权利要求 1 所述的抗鸡传染性喉气管炎病毒特异性转移因子的制备方法， 其 特征在于 ： 离心时均需在 4进行。 5. 根据如权利要求 1 所述的抗鸡传染性喉气管炎病毒特异性转移因。
6、子的制备方法， 其 特征在于 ： 超滤除菌所需滤膜为 0.22m 滤膜。 权 利 要 求 书 CN 105497065 A 2 1/4 页 3 抗鸡传染性喉气管炎病毒特异性转移因子的制备方法 技术领域 0001 本发明属于生物制药领域， 尤其是一种抗鸡传染性喉气管炎病毒特异性转移因子 的制备方法。 背景技术 0002 鸡传染性喉气管炎 (ILT) 是由鸡传染性喉气管炎病毒 (ILTV) 引起的鸡的一种急 性接触性呼吸道传染病。鸡传染性喉气管炎按症状表现可分为喉气管炎型和眼型， 雏鸡发 病多表现为眼型。该病发病率接近 100， 死亡率 50 70， 蛋鸡产蛋量明显下降。给养 禽业造成了巨大的损失。
7、， 是集约化养鸡场的重要疫病之一。 0003 鸡传染性喉气管炎主要在秋冬季节和早春极易发生， 多发于成年鸡， 病因极其复 杂。病鸡主要通过呼吸道分泌物排出病毒， 经空气传播 ； 被病毒污染的蛋、 饲料、 饮水、 用具 等也会传染。本病除经水平传播外， 还可经卵垂直传播， 鸡场一旦发生本病， 很容易造成连 年发生。 目前尚无治疗本病的的特效药， 发病鸡群主要以投服抗菌药物为主， 但是该方法不 能起到预防作用。 通过药物提高机体抵抗力或调节免疫力也是一种预防鸡传染性喉气管炎 的有效方法， 在此过程中转移因子可起到非常重要的作用。 0004 转移因子 (Transfer factor,TF) 是 T。
8、 淋巴细胞释放的一种能够转移致敏信息的 可透析小分子物质 - 多肽核苷酸复合物， 它能够特异地将供体的细胞免疫信息转移给受体 正常的淋巴细胞， 从而增强受体的免疫功能。可以抵抗真菌、 病毒等非细菌性感染， 也可以 是否白介素与干扰素作用于免疫应答过程。 TF含多种成分， 分子量小， 无热原， 无抗原性， 无 毒副作用， 是一种新型而又安全的免疫制剂。此外， 转移因子无种属特异性， 动物来源的转 移因子可用于人体。 0005 目前转移因子的生产工艺主要是通过研磨动物脏器等， 反复冻融并经半透膜透析 得到， 工艺复杂， 无特异性， 回收率低。本发明通过体外制备抗鸡传染性喉气管炎病毒特异 性转移因子。
9、特异性强、 产出率高， 对转移因子的大规模工厂化生产以及大范围应用具有很 好的促进作用。 发明内容 0006 本发明的目的是克服现有转移因子技术中制备以及针对疾病没有特异性， 治疗效 果不稳定等缺点， 提供一种体外免疫方法生产特异性强、 成本低、 产出率高、 效果更好的抗 鸡传染性喉气管炎病毒特异性转移因子的制备方法。 0007 本发明的另一个目的在于提供一种抗鸡传染性喉气管炎病毒特异性转移因子的 制备方法。 0008 本发明是通过以下技术方案实现的 ： 0009 一种抗鸡传染性喉气管炎病毒特异性转移因子的制备方法， 其制备方法的步骤如 下 ： 0010 (1)无菌环境下采取鸡脾脏或鸡血， 用。
10、鸡脾脏或外周血制备淋巴细胞单层。 无菌静 说 明 书 CN 105497065 A 3 2/4 页 4 脉采取动物全血20-30ml， 加0.8肝素溶液0.3m1抗凝， 静置30-60min， 用带胶球吸管吸取 红细胞层以上的所有血浆， 特别是紧接红细胞层上的白细胞层要尽量吸取， 分装于消毒离 心管内， 用 PBS(pH 为 7.2) 液反复洗涤 2-3 次， 离心速度 800-1200 转 / 分， 然后用含 30犊 牛血清水解乳蛋白 40ml 进行白细胞培养， 混合均匀后分装于容量 100ml 细胞培养瓶中， 塞 紧瓶塞， 置 37细胞培养箱中， 经 2-3 天， 白细胞均匀贴壁， 即制成。
11、淋巴细胞单层。 0011 (2) 将步骤 (1) 制备的淋巴细胞单层进行传代培养。显微镜下观察步骤 (1) 制备 的淋巴细胞单层， 确认其生长状态良好即可进行细胞的传代培养。 0012 (3) 抗鸡传染性喉气管炎病毒特异性转移因子的制备 ： 当步骤 (2) 传代的淋巴细 胞长成单层后， 用植物血凝素 ( 终浓度为 100mg/L) 和鸡传染性喉气管炎病毒 ( 终浓度为 1000-1500血凝单位/ml)诱导培养， 离心培养2-3天后， 8000转/分、 20-30min离心细胞培 养液， 取上清液， 将其置于 4下磁力搅拌透析 18-24h， 超滤除菌， 即获得体外制备抗鸡传 染性喉气管炎病毒。
12、特异性转移因子。 0013 一种抗鸡传染性喉气管炎病毒特异性转移因子的制备方法， 刺激鸡脾细胞和鸡血 淋巴细胞增殖的植物血凝素剂的质量浓度为 50-100mg/L。 0014 一种抗鸡传染性喉气管炎病毒特异性转移因子的制备方法， 制备淋巴细胞单层以 及细胞培养均在无菌状态下进行。 0015 一种抗鸡传染性喉气管炎病毒特异性转移因子的制备方法， 离心时均需在 4进 行。 0016 一种抗鸡传染性喉气管炎病毒特异性转移因子的制备方法， 超滤除菌所需滤膜为 0.22m 滤膜。 0017 本发明的优点及有益效果是 ： 0018 (1) 本发明所需鸡脾脏或外周血等原料较少， 用植物血凝素和鸡传染性喉气管。
13、炎 病毒诱导培养诱导淋巴细胞单层即可体外生产出大量抗鸡传染性喉气管炎病毒特异性转 移因子的混合体。 0019 (2) 本发明的方法制备的抗鸡传染性喉气管炎病毒特异性转移因子无需进一步的 提纯， 直接将混合体用于禽类。 0020 (3) 本发明所得到的特异性转移因子即可起到抗鸡传染性喉气管炎病毒及抗菌的 作用， 同时又可以提高禽类的免疫力。 0021 (4) 本发明具有特异性强、 成本低、 产出率高、 效果好等优点， 是一种较为理想的鸡 传染性喉气管炎病毒转移因子制备方法。 具体实施方式 0022 本发明通过以下实施例进一步详述。 需要说明的是 ： 下述实施例是说明性的， 不是 限定性的， 不能。
14、以下述实施例来限定本发明的保护范围。 0023 实施例 1 0024 一种体外制备抗鸡传染性喉气管炎病毒特异性转移因子的制备方法 ： 0025 (1)无菌环境下采取鸡脾脏或鸡血， 用鸡脾脏或外周血制备淋巴细胞单层。 无菌静 脉采取动物全血30ml， 加0.8肝素溶液0.3m1抗凝， 静置60min， 用带胶球吸管吸取红细胞 层以上的所有血浆， 特别是紧接红细胞层上的白细胞层要尽量吸取， 分装于消毒离心管内， 说 明 书 CN 105497065 A 4 3/4 页 5 用 PBS(pH 为 7.2) 液反复洗涤 3 次， 离心速度 1200 转 / 分， 然后用含 30犊牛血清水解乳 蛋白40。
15、ml进行白细胞培养， 混合均匀后分装于容量100ml细胞培养瓶中， 塞紧瓶塞， 置37 细胞培养箱中， 经 3 天， 白细胞均匀贴壁， 即制成淋巴细胞单层。 0026 (2) 将步骤 (1) 制备的淋巴细胞单层进行传代培养。显微镜下观察步骤 (1) 制备 的淋巴细胞单层， 确认其生长状态良好即可进行细胞的传代培养。 0027 (3) 抗鸡传染性喉气管炎病毒特异性转移因子的制备。当步骤 (2) 的淋巴细胞长 成单层后， 用植物血凝素 ( 终浓度为 100mg/L) 和鸡传染性喉气管炎病毒 ( 终浓度为 1250 血凝单位 /ml) 诱导培养， 离心培养 3 天后， 8000 转 / 分、 30m。
16、in 离心细胞培养液， 取上清液， 将其置于 4下磁力搅拌透析 24h， 超滤除菌， 即获得体外制备抗鸡传染性喉气管炎病毒特 异性转移因子。 0028 实施例 2 0029 一种体外制备抗鸡传染性喉气管炎病毒特异性转移因子的制备方法 ： 0030 (1)无菌环境下采取鸡脾脏或鸡血， 用鸡脾脏或外周血制备淋巴细胞单层。 无菌静 脉采取动物全血20ml， 加0.8肝素溶液0.3m1抗凝， 静置30min， 用带胶球吸管吸取红细胞 层以上的所有血浆， 特别是紧接红细胞层上的白细胞层要尽量吸取， 分装于消毒离心管内， 用 PBS(pH 为 7.2) 液反复洗涤 2-3 次， 离心速度 800 转 / 。
17、分， 然后用含 30犊牛血清水解乳 蛋白40ml进行白细胞培养， 混合均匀后分装于容量100ml细胞培养瓶中， 塞紧瓶塞， 置37 细胞培养箱中， 经 2 天， 白细胞均匀贴壁， 即制成淋巴细胞单层。 0031 (2) 将步骤 (1) 制备的淋巴细胞单层进行传代培养。显微镜下观察步骤 (1) 制备 的淋巴细胞单层， 确认其生长状态良好即可进行细胞的传代培养。 0032 (3) 抗鸡传染性喉气管炎病毒特异性转移因子的制备。当步骤 (2) 的淋巴细胞长 成单层后， 用植物血凝素 ( 终浓度为 100mg/L) 和鸡传染性喉气管炎病毒 ( 终浓度为 1000 血凝单位 /ml) 诱导培养， 离心培养。
18、 2 天后， 8000 转 / 分、 20min 离心细胞培养液， 取上清液， 将其置于 4下磁力搅拌透析 18h， 超滤除菌， 即获得体外制备抗鸡传染性喉气管炎病毒特 异性转移因子。 0033 对本发明所述工艺制备的抗鸡传染性喉气管炎病毒特异性转移因子的检测 0034 对实施例 1 所述工艺制备的抗鸡传染性喉气管炎病毒转移因子 ( 下称 “本品” ) 进 行以下检测 : 0035 (1) 标准液为黄色澄明液体， pH 值在 6.1-7.0 之间。 0036 (2) 多肽含量测定 ： 本品经双缩脉法测定多肽含量为 0.51mg/ml。 0037 (3) 核酸含量测定 ： 本品经地衣酚法测定核酸。
19、含量为 0.34mg/ml。 0038 (4) 细菌学检测 ： 本品中无需氧、 厌氧、 腐生菌和真菌存在。 0039 (5)取健康小白鼠10只， 口服本品浓缩液， 相当于正常口服液剂量的20倍， 观察小 白鼠的生存能力变化， 结果 ： 无任何毒性反应， 也无死亡现象出现， 说明本品是安全的， 无任 何毒性和副作用。 0040 (6) 用 PPD 做家兔皮试实验， 发现本品具有转移免疫活性的功能。 0041 (7) 用鸡传染性喉气管炎病毒抗原做皮试检测， 有微弱的阳性反应， 说明本品具有 良好的转移活性和特异性。 0042 应用实例 ： 说 明 书 CN 105497065 A 5 4/4 页 。
20、6 0043 选取 200 只 15 日龄黄羽肉鸡 ( 经过健康检查无菌 )， 随机分为 A， B， C， D， E 共 5 组， B， C， D， E 组经过人工感染 0.3m1 鸡传染性喉气管炎病毒强毒攻毒后作实验。A 组为健康组， 不感染病毒， 不给药 ； B 组阴性对照组， 感染病毒， 不给药 ； C 组为本发明药物低剂量组， 按禽 0.3m1/ 只鸡 / 天肌肉注射 ； D 组为本发明药物高剂量组， 按禽 0.6ml/ 只鸡 / 天注射饲喂 ； E 组为双黄连口服液 ( 天津中敖生物科技有限公司 )， 按禽 1ml/ 只鸡 / 天灌服。结果表明， 采 用本发明药物治疗鸡传染性喉气管炎病毒病有着明显的疗效。 0044 本发明抗鸡传染性喉气管炎病毒特异性转移因子实验结果如下 : 0045 0046 上述试验结果表明， 该药物低、 高剂量治疗组与对照组差异非常显著 (P0.01)。 说 明 书 CN 105497065 A 6 。