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1、10申请公布号CN104119443A43申请公布日20141029CN104119443A21申请号201310146236122申请日20130424C07K19/00200601C12N15/62200601C12N15/63200601C12N1/21200601A61K39/135200601A61K48/00200601A61P31/1420060171申请人中国农业科学院兰州兽医研究所地址730046甘肃省兰州市城关区盐场堡徐家坪1号72发明人邵军军常惠芸陈建文74专利代理机构北京科龙寰宇知识产权代理有限责任公司11139代理人孙皓晨54发明名称牛A型口蹄疫国外流行毒株广谱多表位。
2、重组疫苗及其制备方法和应用57摘要本发明公开了一种牛A型口蹄疫国外流行毒株广谱多表位重组疫苗及其制备方法和应用，属于兽用疫苗研究领域。本发明采用“抗原化抗体”策略以及全新的反向疫苗操作学技术和策略，将与我国接壤国家最近流行的牛A型口蹄疫病毒的代表性毒株的优势抗原表位进行合理的串联后，与牛IGG重链恒定区偶联，克隆入原核表达载体构建重组表达载体，转化大肠杆菌感受态细胞表达重组抗原并采用NINAT层析柱纯化后，经BIORAD蛋白定量试剂盒定量后单独或与重组口蹄疫病毒3D蛋白配伍后制备疫苗，动物免疫试验结果显示，该重组蛋白或配伍后的疫苗均能够刺激机体产生高效价的保护性抗体，同时保护免疫动物抵抗同源病。
3、毒的攻击，具有良好的应用前景。51INTCL权利要求书1页说明书5页序列表6页附图1页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书5页序列表6页附图1页10申请公布号CN104119443ACN104119443A1/1页21一种牛A型口蹄疫国外流行毒株广谱多表位重组抗原，其特征在于所述的重组抗原是将与我国接壤国家最近流行的牛A型口蹄疫病毒的代表性毒株的优势抗原表位进行合理串联后，与牛IGG重链恒定区偶联后构建得到，所述的重组抗原含有以下（A）或（B）所示的氨基酸序列（A）SEQIDNO6所示的氨基酸序列；或（B）将SEQIDNO6所示的氨基酸序列通过一个或多个氨基酸残。
4、基的替换、缺失或插入而获得的仍具有抗原表位功能的蛋白衍生物。2如权利要求1所述的重组抗原，其特征在于所述的重组抗原的氨基酸序列如SEQIDNO6所示。3编码权利要求1所述的重组抗原的核苷酸序列，其特征在于具有以下（A）、（B）或（C）所示的核苷酸序列（A）SEQIDNO5所示的核苷酸序列；或（B）编码SEQIDNO6所示的氨基酸序列的核苷酸序列；或（C）编码具有抗原表位功能的蛋白衍生物的核苷酸序列，该蛋白衍生物通过将SEQIDNO6所示的氨基酸序列的一个或多个氨基酸残基替换、缺失或插入而获得。4如权利要求4所示的核苷酸序列，其特征在于所述的核苷酸序列如SEQIDNO5所示。5一种重组表达载体，。
5、其特征在于含有权利要求3或4所述的核苷酸序列。6一种宿主细胞，其特征在于含有权利要求5所述的重组表达载体。7权利要求1或2所述的多表位重组抗原在制备预防牛A型口蹄疫疫苗中的应用。8权利要求3或4所述的核苷酸序列在制备预防牛A型口蹄疫疫苗中的应用。9一种牛A型口蹄疫国外流行毒株广谱多表位疫苗，其特征在于含有权利要求1或权利要求2所述的多表位重组抗原。10如权利要求9所述的牛A型口蹄疫国外流行毒株广谱多表位疫苗，其特征在于还含有口蹄疫病毒3D蛋白的全长氨基酸序列，所述的口蹄疫病毒3D蛋白的全长氨基酸序列如SEQIDNO8所示。权利要求书CN104119443A1/5页3牛A型口蹄疫国外流行毒株广谱。
6、多表位重组疫苗及其制备方法和应用技术领域0001本发明涉及一种牛A型口蹄疫疫苗及其制备方法和应用，尤其涉及一种牛A型口蹄疫国外流行毒株广谱多表位重组疫苗及其制备方法和应用，属于兽用疫苗研究领域。背景技术0002口蹄疫作为主要经济畜种猪、牛和羊的重大动物疫病不仅严重威胁畜牧业的健康发展，而且涉及动物源性食品安全以及其外贸出口。一旦发生疫情损失惨重，政治影响恶劣。灭活疫苗在防控FMD中发挥十分重要的作用，但由于生产此类疫苗存在生物安全隐患，需要区分疫苗免疫和自然感染动物（DIVA）。为此，1991年后欧盟成员国禁止使用灭活疫苗进行疫情防控，美国也禁止在其本国生产和使用灭活疫苗。0003我国拥有漫长。
7、的国际边界线，与中亚，南亚，东亚等口蹄疫多发地区的国家接壤，这些地区经常发生不同血清型口蹄疫流行，给我国口蹄疫防控造成了巨大的压力，曾发生多起口蹄疫病毒传入我国引起疫情的事例。因此，为了防止国外毒株通过边境交叉放牧，活畜及其产品走私造成外源性病毒的引入，除了加大疫情监控外，研制能防控外来流行毒株的新型疫苗显得尤为重要，为我国防控口蹄疫外来毒株传入提供优质安全高效的新型疫苗储备。0004采用分子生物学，蛋白组学及反向疫苗学等相关技术研发安全高效的新型FMD疫苗已经成为热点课题。迄今，已经通过分子生物学技术研制的口蹄疫新型疫苗并申报国家专利的有猪O型口蹄疫重组疫苗申获了专利（上海复旦大学郑赵鑫教授。
8、研制），并获得农业部颁布的“一类新兽药证书，遗憾的是该产品至今没有商品化。本实验室研制的牛和羊口蹄疫ASIA1型多表位疫苗经动物免疫效力试验证实具有良好的免疫原性，且已申获专利，发明名称分别为“牛口蹄疫病毒ASIA1型重组多表位疫苗及其制备方法”（专利号ZL2009102593636）和”羊口蹄疫病毒ASIA1型多表位疫苗及其制备方法”（专利号ZL2009102240259）。0005如今，利用反向疫苗学技术研制新型疫苗已经成为未来疫苗发展的趋势。传统灭活疫苗生物安全的不确定性加速了研究口蹄疫新型疫苗的进程。值得一提的是，近年来通过增加T细胞表位和自身蛋白分子作为载体蛋白明显改善了重组抗原的免。
9、疫原性，增强了免疫效果。同时解决了多表位广谱抗原基因的多次串联后表达效率低下的技术瓶颈，不仅能获得大量高纯度靶标蛋白，而且也能保证所表达靶标蛋白的免疫原性，这为研制口蹄疫广谱多表位疫苗，防止由于抗原谱单一导致免疫失败提供了很好的技术支持和理论依据。0006本研究采用分子生物学技术以及先进的设计理念，设计涵盖并合成了与我国接壤国家最近分离的牛口蹄疫病毒A型代表毒株的优势抗原表位序列，研制针对外来流行毒株的广谱多表位疫苗，这对于防止国外口蹄疫毒株传入我国具有重要的意义，为我国防控外来毒株疫情提供疫苗战略储备。说明书CN104119443A2/5页4发明内容0007本发明的目的之一在于提供一种牛A型。
10、口蹄疫国外流行毒株广谱多表位重组抗原，该抗原涵盖了与我国接壤国家最近流行的牛A型口蹄疫病毒的代表性毒株的优势抗原表位；0008本发明的目的之二在于提供所述重组抗原在制备牛A型口蹄疫疫苗中的应用；0009本发明的目的之三在于提供一种牛A型口蹄疫国外流行毒株广谱多表位疫苗，其含有本发明所述的重组抗原。0010为了达到所述目的，本发明采用了以下技术方案0011本发明的一种牛A型口蹄疫国外流行毒株广谱多表位重组抗原，其特征在于所述的重组抗原是将与我国接壤国家最近流行的牛A型口蹄疫病毒的代表性毒株的优势抗原表位进行串联后，与牛IGG重链恒定区偶联后构建得到，所述的重组抗原含有以下（A）或（B）所示的氨基。
11、酸序列0012（A）SEQIDNO6所示的氨基酸序列；或0013（B）将SEQIDNO6所示的氨基酸序列通过一个或多个氨基酸残基的替换、缺失或插入而获得的仍具有抗原表位功能的蛋白衍生物。0014在本发明的一个具体实施例中，所述的重组抗原的氨基酸序列如SEQIDNO6所示。0015编码所述的重组抗原的核苷酸序列，其特征在于具有以下（A）、（B）或（C）所示的核苷酸序列0016（A）SEQIDNO5所示的核苷酸序列；或0017（B）编码SEQIDNO6所示的氨基酸序列的核苷酸序列；或0018（C）编码具有抗原表位功能的蛋白衍生物的核苷酸序列，该蛋白衍生物通过将SEQIDNO6所示的氨基酸序列的一个。
12、或多个氨基酸残基替换、缺失或插入而获得。0019在本发明的一个具体实施例中，所述的核苷酸序列如SEQIDNO5所示。0020含有本发明所述的核苷酸序列的重组表达载体以及含有该载体的宿主细胞也在本发明所保护的范围之内。0021进一步的，本发明还提出了本发明所述的多表位重组抗原在制备预防牛A型口蹄疫疫苗中的应用。及0022所述的核苷酸序列在制备预防牛A型口蹄疫疫苗中的应用。0023一种牛A型口蹄疫国外流行毒株广谱多表位疫苗，其特征在于含有本发明所述的多表位重组抗原。0024优选的，所述的多表位疫苗还含有口蹄疫病毒3D蛋白的全长氨基酸序列，所述的口蹄疫病毒3D蛋白的全长氨基酸序列如SEQIDNO8所。
13、示。0025本研究采用“抗原化抗体”策略以及全新的反向疫苗学技术和策略，将与我国接壤国家最近流行的牛A型口蹄疫病毒的代表性毒株的优势抗原表位进行合理的串联后，与牛IGG免疫刺激片断（IGG重链恒定区）偶联，克隆入原核表达载体如PET30A（）构建重组表达载体，转化大肠杆菌感受态细胞（例如BL21,BL21DE3，BL21DE3PLYS系列等）表达重组抗原并采用NINAT层析柱纯化后，经BIORAD蛋白定量试剂盒定量后单独或与重组口蹄疫病毒3D蛋白配伍后制备疫苗，动物免疫试验结果显示，该重组蛋白或疫苗配伍均能够说明书CN104119443A3/5页5刺激机体产生高效价的保护性抗体，同时保护免疫动。
14、物抵抗同源病毒的攻击，因而本发明具有良好的应用前景。附图说明0026图1为重组表位抗原单独或与3D蛋白联合免疫豚鼠效力试验结果；结果显示，在加强免疫后，抗原单独或与3D蛋白联合免疫豚鼠均能诱导机体产生高水平的中和抗体，第二次加强免疫后血清抗体效价进一步升高，显示出该抗原具有良好的免疫原性；0027图2为重组抗原免疫牛实验结果；结果显示，重组抗原能够诱导宿主动物产生口蹄疫特异性中和抗体，加强免疫后，保护性抗体水平进一步升高。具体实施方式0028下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应。
15、该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。0029实施例1牛A型口蹄疫国外流行毒株广谱多表位重组抗原的制备00301、A型口蹄疫病毒VP1基因的生物信息学分析0031口蹄疫病毒结构蛋白VP1是病毒的优势抗原，无论是分离纯化的天然VP1蛋白还是重组表达产物都能诱导机体产生保护性中和抗体，具有型特异性。A型口蹄疫病毒VP1基因全长有639个核苷酸，编码一条213个氨基酸组成的蛋白，其主要抗原表位集中在140160位氨基酸和200213位氨基酸区段。本研究用DNASTAR生物软件对与我国接壤一些国家最近分离的牛A。
16、型口蹄疫病毒代表毒株NCBI登录号FJ755067，HQ666886和AY59371进行序列分析，确定了优势抗原表位为135160位氨基酸，并确定以200213位氨基酸为另外一个B抗原表位，同时添加了VP1区2128位的保守氨基酸序列为T细胞表位。00322、基因克隆及其蛋白表达，纯化0033多表位重组抗原基因的设计及其合成为了防止在构建基因时出现新表位，在相邻两表位之间引入能保证各个表位结构正确展示的间隔子序列GGGS，多表位基因的串联顺序为2128135160（FJ755067）135160（HQ666886）140160（AY59371）200213（FJ755067），并在基因的5端和。
17、3端分别引入特异性酶切位点如BAMH和ECOR，多表位基因委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成，多表位重组抗原基因序列如SEQIDNO1所示，其编码的氨基酸序列如SEQIDNO2所示。将合成的多表位基因和原核表达载体PET30A（）分别用BAMH和ECOR酶切，纯化回收后插入用相应酶线性化PET30A（）载体，构建重组表达载体PRE，转化JM109感受态进行阳性筛选，通过序列测定确定阳性重组子。0034牛IGG重链恒定区基因（CIGG）的PCR扩增用PRIMER50引物软件设计扩增牛IGG重链恒定区基因全长的特异性引物，正链5AAGACGGCCCCATCGGT3，负链5TTTACCCGGA。
18、GTCTTGGA3，获得全长为987KB的目的基因，牛IGG重链恒定区核苷酸序列如SEQIDNO3所示，其编码的氨基酸序列如SEQIDNO4所示，然后用带有酶切位点的特异性引物CATTLEIGGHCHIND，5AAGCTTGCGCCTCCACCACAGCCCCGAAA3；CATTLEIGGHCXHO说明书CN104119443A4/5页615CTCGAGCTTTACCCGCAGACTTAGAGGTGGAC3对目的基因进行扩增、纯化、回收，用HIND/XHOL双酶切后，插入相应酶切线性化的重组表达载体PRE构建重组表达载体PRECIGG，经酶切、PCR及序列测定为阳性后20保存备用。0035重组。
19、蛋白的表达及其生物活性鉴定将阳性重组表达载体转化BL21（DE3）（NOVAGEN），挑选单克隆接种LB培养液（KAN）经IPTG诱导表达及表达形式鉴定后，大规模化表达重组蛋白，即从LAB平板上挑单菌落接种5ML含卡那霉素的LB培养液，于37培养箱220RMP过夜培养，将过夜培养物按1加入新制备的无菌LB培养液中（KAN），于37培养箱220RMP培养至OD6000406时，于超净台无菌条件下加入04MM的IPTG诱导表达46小时，2000RPM离心30MIN收获培养物，按原培养物体积的20加入蛋白裂解液，冰浴条件下进行超声破碎处理（30MIN），20000G离心20MIN收集沉淀（4），弃上。
20、清。按照NINTA组氨酸纯化柱（NOVAGEN）说明书纯化蛋白，纯化蛋白经SDSPAGE电泳及WESTERNBLOTTING分析，重组蛋白RECIGG大小与预期相符，能与FMDV（A型）感染血清及辣根过氧化物酶标记的兔抗牛IGG发生免疫反应，说明表达的重组蛋白具有生物活性。0036表达的重组蛋白即为本发明所述的牛A型口蹄疫国外流行毒株广谱多表位重组抗原，其氨基酸序列如SEQIDNO6所示，编码该氨基酸序列的核苷酸序列如SEQIDNO5所示。0037实施例2牛A型口蹄疫国外流行毒株广谱多表位疫苗的制备及免疫效力分析00381、疫苗制备0039纯化蛋白经BIORAD定量试剂盒定量后稀释成适当的浓度。
21、，单独或与纯化的3D蛋白全长片段（氨基酸序列如SEQIDNO8所示，编码其的核苷酸序列如SEQIDNO7所示）与重组抗原按12（V/V）配置后，加入等体积的油佐剂ISA206（FRANCE）乳化成疫苗制剂。00402、豚鼠免疫效力试验0041用制备的疫苗，按每只豚鼠02ML经肌肉途径接种豚鼠（20G抗原或20G抗原10G3D蛋白）分别免疫5只豚鼠，免疫实验结果显示，无论是重组抗原单独还是与3D蛋白联合免疫豚鼠均能刺激机体产生特异性抗体和高效价的FMDV保护性抗体，值得注意的是，加强免疫后14天，血清特异性抗体效价和中和抗体效价明显升高，提示具有良好的免疫效果，第二次加强免疫后血清特异性中和抗体。
22、效价继续升高（图1）。用1000ID50WH/09毒株进行攻击，结果4/5动物完全保护。提示该疫苗能够针对国内毒株提供免疫保护，具有良好的免疫效果。00423、牛体免疫效力试验0043用制备的疫苗，按每头份2ML经肌肉途径接种免疫牛（500G抗原或500G抗原250G3D蛋白）分别免疫5头无口蹄疫特异性抗体及非结构蛋白抗体健康牛。结果显示，无论是重组抗原单独还是与3D蛋白联合免疫豚鼠均能刺激机体产生特异性抗体和高效价的FMDV保护性抗体，加强免疫后14天，血清特异性抗体效价和中和抗体效价明显升高，提示具有良好的免疫效果（图2）。免疫动物注射部位没有出现红肿、发热等现象，也没有出现接种不良反应，。
23、食欲正常，精神状态良好，提示我们制备的牛A型口蹄疫多表位疫苗具有良好的免疫原性，免疫豚鼠体后能够产生高水平的保护性抗体，接种后对免疫动物安全无害，是一种具有广阔前景的新型疫苗，将对我国牛A型口蹄疫防控提供物质储备及技术支撑，具有重要的意义。说明书CN104119443A5/5页700444、病毒中和试验0045根据OIE（陆生动物手册2005版本）微量中和试验方案，测定牛免疫血清中和本实验保存多株A型毒株（WH/09,XJKT58以及A型标准毒株）的效能，结果显示，免疫血清能够中和多种毒株，中和抗体效价为阳性（164），根据国家标准，提示该疫苗具有良好的免疫效力和较好的广谱性。说明书CN104119443A1/6页800010002序列表CN104119443A2/6页90003序列表CN104119443A3/6页100004序列表CN104119443A104/6页110005序列表CN104119443A115/6页120006序列表CN104119443A126/6页13序列表CN104119443A131/1页14图1图2说明书附图CN104119443A14。