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1、10申请公布号CN104131017A43申请公布日20141105CN104131017A21申请号201410362681622申请日20140728C12N15/60200601C12N9/88200601C12N15/10200601C12N15/70200601C12N1/21200601C12P13/22200601C12P7/40200601C12R1/64520060171申请人江南大学地址214122江苏省无锡市蠡湖大道1800号72发明人周哲敏朱龙宝崔文璟周丽74专利代理机构北京爱普纳杰专利代理事务所特殊普通合伙11419代理人何自刚王玉松54发明名称一种粘红酵母苯丙氨酸脱。
2、氨酶基因及其应用57摘要本发明公开了一种粘红酵母苯丙氨酸脱氨酶基因及其应用，属于生物技术领域。苯丙氨酸脱氨酶基因的克隆对采用酶法生物合成L苯丙氨酸具有重要的作用。本发明所述的苯丙氨酸脱氨酶基因是通过提取粘红酵母的RNA，反转录获得全长的苯丙氨酸脱氨酶基因，该基因全长2121BP，编码705个氨基酸。本发明进一步扩大了苯丙氨酸脱氨酶基因资源，为分子改造苯丙氨酸脱氨酶，提高酶的稳定性和催化活性提供了科学依据。51INTCL权利要求书1页说明书4页序列表3页附图3页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书4页序列表3页附图3页10申请公布号CN104131017ACN10。
3、4131017A1/1页21一种苯丙氨酸脱氨酶基因，其特征在于，核苷酸序列如SEQIDNO1所示。2权利要求1所述基因编码的苯丙氨酸脱氨酶。3携带权利要求1所述基因的载体、重组细胞或基因工程菌。4一种获得权利要求1所述基因的方法，其特征在于，以粘红酵母为出发菌株，分离其总RNA，反转录获得苯丙氨酸脱氨酶的CDNA，最终获得全长基因序列。5一种表达权利要求1所述苯丙氨酸脱氨酶基因的基因工程菌，其特征在于，将苯丙氨酸脱氨酶基因与载体PET28A连接，构建重组表达载体PET28APAL，转化ECOLIBL21，筛选获得阳性菌株。6一种表达权利要求1所述苯丙氨酸脱氨酶基因的方法，其特征在于，以大肠杆菌。
4、为宿主，以PET22B、PET23、PET28A或PET20B为表达载体。7根据权利要求6所述的方法，其特征在于，将编码丙氨酸脱氨酶的基因与载体PET28A连接，构建重组表达载体PET28APAL，转化ECOLIBL21后诱导表达该基因。8根据权利要求7所述的方法，其特征在于，将带有PET28APAL的重组大肠杆菌培养至OD600为06时加入诱导剂IPTG至终浓度04MM，于24培养12H后离心收集菌体；用含有10MM的咪唑、150MM氯化钠、PH75的50MM的磷酸缓冲液洗涤，然后超声波破碎细胞后离心收集上清；上清用带有HIS标签的亲和层析柱纯化，用含250MM咪唑、150MMNACL、PH。
5、75的磷酸缓冲液进行洗脱，收集目的蛋白；将收集的目的蛋白脱盐得到纯化后的PAL。9权利要求2所述苯丙氨酸脱氨酶在生产L苯丙氨酸或反式肉桂酸中的应用。10权利要求5所述基因工程菌在生产L苯丙氨酸或反式肉桂酸中的应用。权利要求书CN104131017A1/4页3一种粘红酵母苯丙氨酸脱氨酶基因及其应用技术领域0001本发明涉及一种粘红酵母苯丙氨酸脱氨酶基因及其应用，属于生物技术领域。背景技术0002苯丙氨酸脱氨酶PAL在PH80时催化L苯丙氨酸LPHE脱氨生成反式肉桂酸和氨，PH110时能催化逆向反应合成LPHE，工业上利用这一特性，生产人体必须氨基酸LPHE和甜味剂阿斯巴甜。PAL广泛存在于植物、。
6、微生物中，微生物主要有霉菌和酵母菌，尤其是红酵母属中。其中粘红酵母RHODOTORULAGLUTINIS可以在廉价的原料如玉米粉，糖浆，糖蜜，豆粕，味精废水等工业废料上生长，容易实现大规模的培养，已经成功应用于食品、制药等工业领域。但是由于该酶是诱导酶，在对数生长期酶活达到峰值后，酶活下降较快，稳定性差。0003为进一步提高酶活和稳定性，需要采用分子生物手段对酶进行分子改造，但到目前为止，仅仅获得PAL的部分CDNA，缺少5端的基因序列。由于该基因的5端序列的GC含量高，容易形成发夹结构，传统的反转录很难成功。0004为此，本发明提供了一种粘红酵母PAL全长的基因序列，经表达，获得42U/MG。
7、PAL。发明内容0005本发明的目的是提供一种粘红酵母苯丙氨酸脱氨酶基因，其核苷酸序列如SEQIDNO1所示。0006所述苯丙氨酸脱氨酶基因是以工业生产用菌株粘红酵母为出发菌株，分离其总RNA，反转录获得苯丙氨酸脱氨酶的CDNA，最终获得全长为2121BP的基因序列，编码706个氨基酸，酶活达到42U/MG，是目前已报到的最高酶活。0007苯丙氨酸脱氨酶基因编码的苯丙氨酸脱氨酶可用于催化生产L苯丙氨酸或反式肉桂酸。0008本发明要解决的第二个技术问题是提供一种表达所述苯丙氨酸脱氨酶的基因工程菌。优选以大肠杆菌为宿主，以PET22B、PET23、PET28A或PET20B为表达载体。进一步优选将。
8、获得的基因与载体PET28A连接，构建重组表达载体PET28APAL，转化ECOLIBL21。0009本发明要解决的第三个技术问题是提供一种表达所述基因获得苯丙氨酸脱氨酶的方法。优选以大肠杆菌为宿主，以PET22B、PET23、PET28A或PET20B为表达载体。进一步优选将获得的基因与载体PET28A连接，构建重组表达载体PET28APAL，转化ECOLIBL21后诱导表达该基因。0010所述方法进一步优选将带有PET28PAL的重组大肠杆菌培养至OD600为06时加入诱导剂IPTG至终浓度04MM，于24培养12H后离心收集菌体，用含有10MM的咪唑、150MM氯化钠，PH75的50MM。
9、的磷酸缓冲液洗涤2次，然后采用超声破碎细胞30MIN后离心说明书CN104131017A2/4页4收集上清，上清用带有HIS标签的亲和层析柱纯化，用含250MM咪唑、150MMNAC，PH75的磷酸缓冲液进行洗脱，收集目的蛋白。将收集的目的蛋白用脱盐柱脱盐得到纯化后的PAL。0011本发明提供了一种完整的新的粘红酵母苯丙氨酸脱氨酶基因，编码的苯丙氨酸脱氨酶酶活达到42U/MG，是目前已报到的最高酶活。该基因的获得为进一步利用分子生物学手段对酶进行改造，以提高酶活及其稳定性提供了基础。所得苯丙氨酸脱氨酶及相应基因工程菌都可以应用于生产L苯丙氨酸或反式肉桂酸。附图说明0012图1为粘红酵母总RNA。
10、的电泳图。0013图2为反转录后PCR扩增全长基因的电泳图。0014图3为粘红酵母苯丙氨酸脱氨酶的阅读框及翻译的氨基酸序列。0015图4为重组酶的表达；M，蛋白MARKER；1，不带重组质粒PET28PAL的ECOILBL21全细胞电泳；2，带重组质粒PET28PAL，未用IPTG诱导的ECOILBL21全细胞电泳；3，带重组质粒PET28PAL，IPTG诱导的ECOILBL21全细胞电泳。0016图5SDSPAGE检测纯化的蛋白；M，为蛋白MARKER；1，全细胞电泳；2，采用HIS纯化柱纯化后获得的PAL。0017图605MM反式肉桂酸标样的HPLC图出峰时间为635MIN。0018图7重。
11、组酶催化L苯丙氨酸后HPLC分析在625MIN出现产物峰，与标样出峰时间一致。具体实施方式0019实施例1提取粘红酵母总RNA00201以工业生产用菌株粘红酵母RHODOTORULAGLUTINISCCTCCNOM2011490为出发菌株，从粘红酵母平板上挑取单菌落至5ML的种子培养基中于30培养24H后，取50L的种子液至装有50ML培养基的250ML三角瓶中，30培养1820H至OD60010，1500G离心5MIN收集菌体，用冷水将菌体洗涤2次，弃上清。00212用400L的TES10MMTRISHCI，10MMEDTA，05SDS,PH75缓冲液重悬细胞，加入400L酸性酚，剧烈震荡1。
12、0SEC，65温育1H，不时用涡旋振荡器短暂震荡。00223冰育5MIN，于4，12000G离心5MIN。00234将水相移至另一15ML的离心管中，加入400L酸性酚，剧烈震荡10SEC，重复步骤3。00245将水相移至另一15ML的离心管中，加入氯仿，剧烈震荡10SEC，于4，12000G离心5MIN。00256将水相移到新的15ML离心管中，加入40L的3MNAAC及1ML冰冷的无水乙醇，于4，12000G离心5MIN。00267加入1ML，75乙醇快速震荡洗涤RNA沉淀。00278沉淀于无菌操作台上风吹15MIN至酒精挥发完全，加入经DEPC处理的无菌水50L重悬，80保藏备用，采用琼。
13、脂糖凝胶电泳检测总RNA质量图1。0028实施例2反转录获得CDNA说明书CN104131017A3/4页500291于05ML的离心管中加入50NG总RNA，1L5CDS5T25VNNA,C,G,T；VA,G,C3和1LSMARTERIIAOLIGONUCLEOTIDE5AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACGGGGG3，加水至475L混匀。0030272温育3MIN后于42温育2MIN，1500G离心10SEC。00313加入2L5BUFFER250MMTRISHCL,375MMKCL,30MMMGCL2，1L的DTT20MM，1LDNTP10MM，025LRNASE抑制剂和1。
14、LSMARTERTM反转录酶，42温育90MIN后于70变性10MIN，冷却至室温加入20L无菌水，获得CDNA。0032实施例3获得PAL5端的序列00331往025ML的离心管加入1LCDNA、5LMIX引物5CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT3；5CTAATACGACTCACTATAGGGC3，1LGSP特异性引物5GGTGATGCCGTGGTTGAGGAAGTT3，5L10BUFFER，5LDNTP2MM，05LPFUDNA聚合酶，3LMGSO425MM，加去离子水至50L。00342进行PCR扩增，PCR扩增条件94预变性4MI。
15、N，94变性1MIN，58退火30SEC，72延伸60SEC，25个循环，琼脂糖凝胶电泳检测。00353往025ML的离心管中加入5LPCR产物，1L10TAQBUFFER，1LDATP2MM，1LTAQ酶5U/L加水至10L，70反应30MIN后酚仿抽提，乙醇沉淀，无菌操作台风吹15MIN至酒精挥发完全，用10L无菌水重悬。00364取上一步反应液5L，加入1L连接BUFFER，1L50PEG，1LPUCMT载体，1LT4连接酶，加去离子水至10L，于16过夜连接。00375取连接产物10L，10L5KCM05MKCL，015MCACL2,025MMGCL2，去离子水30L，加至50L的EC。
16、OLIJM109感受态中，冰浴30MIN，42热击90SEC，冰浴2MIN，加入100L的新鲜LB培养基，37培养3060MIN，取100L涂布含有氨苄青霉素50UG/ML的LB平板，37培养10H，挑取单菌落，接入5ML含50UG/ML的氨苄青霉素LB培养基中37培养10H，取2ML菌液提质粒进行测序，获得5端的序列如SEQIDNO2所示。0038实施例4构建克隆载体PUCMTPAL00391根据步骤3获得的5端序列，设计一对特异性引物PRIMERF5GGAATTCCATATGATGGCCCCCTCCGTCGACTCGATC3；PRIMERR5CGGAATTCCTAGTATGGTCTACGT。
17、CCAAAGG3，025ML的离心管加入1LCDNA，PRIMERF和R各1L，5L10BUFFER，5LDNTP2MM，05LPFUDNA聚合酶，加去离子水至50L。00402进行PCR扩增，PCR扩增条件94预变性4MIN，94变性1MIN，58退火30SEC，72延伸2MIN，25个循环，琼脂糖凝胶电泳检测图2。00413参照实施例3，将扩增到全长基因序列与PUCMT连接，转入ECOLIJM109，涂布含有氨苄青霉素的LB平板，挑单菌落至LB培养基中37培养10H，取2ML菌液提质粒进行测序，获得全长的序列，采用PCR验证构建的PUCMTPAL，分析阅读框图3，从图中可知该酶的阅读框全长。
18、2121BP，编码706个氨基酸。0042实施例5构建表达载体PET28APAL表达PAL0043NDEL和ECORL分别对PUCMTPAL和空载体PET28A进行双酶切，胶回收后于16连接过夜，转化ECOLIJM109，在含有卡那霉素抗性的LB平板挑阳性重组子，提取重组质粒并进行PCR和双酶切验证，阳性克隆即PET28APAL。说明书CN104131017A4/4页60044取1LPET28APAL，转入ECOLIBL21，取100L涂布含有卡那霉素50G/ML的LB平板，37培养10H，挑取单菌落至5ML的LB培养基中37培养10H，取1ML培养液至100ML的LB培养基中37培养至OD6。
19、00为06时加入终浓度为04MM的IPTG，26诱导表达12H后离心收集菌体，进行SDSPAGE检测表达情况，结果见图4，从图中可知，该基因成功表达。目的条带的分子量70KD左右，与理论分子量大小一致。0045实施例6重组PAL的纯化0046将带有PET28APAL的重组大肠杆菌培养至OD600为06时加入诱导剂IPTG至终浓度04MM，于24培养12H后离心收集菌体，用50MM的磷酸缓冲液含有10MM的咪唑，150MM氯化钠，PH75洗涤2次，然后采用超声破碎细胞30MIN后离心收集上清，上清用带有HIS标签的亲和层析柱HISTRAPFFCRUDECOLUMN1ML纯化，用含583咪唑的磷酸。
20、缓冲液250MM咪唑,150MMNAC，PH75进行洗脱，收集目的蛋白。将收集的目的蛋白用脱盐柱HIPREP26/10DESALTINGCOLUMN脱盐。SDSPAGE检测纯化的蛋白，结果如图5，从图中可知，获得高纯度的PAL蛋白，蛋白的大小与理论一致。0047实施例7HPLC测定酶的活性0048取适量的实施例6得到纯酶与40MM的L苯丙氨酸于40下反应30MIN后加入50的甲醇终止反应，反应结束后用022M的纤维素膜过滤后进行HPLC分析。HPLC测定条件日立C18柱，50甲醇作为流动相，流速05ML/MIN，进样10L。标准样品及酶催化后的HPLC图谱如图6和7，从图中可知，该重组酶具有催。
21、化苯丙氨酸生成肉桂酸的功能。纯酶的比酶活达到42U/MG，是目前已报道的最高活性。0049虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。说明书CN104131017A1/3页700010002序列表CN104131017A2/3页80003序列表CN104131017A3/3页9序列表CN104131017A1/3页10图1图2图3说明书附图CN104131017A102/3页11图4图5图6说明书附图CN104131017A113/3页12图7说明书附图CN104131017A12。