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1、10申请公布号CN104131027A43申请公布日20141105CN104131027A21申请号201410353302722申请日20140723C12N15/80200601C12Q1/6820060171申请人吉林省农业科学院地址130000吉林省长春市净月开发区彩宇大街1363号72发明人李启云徐文静路杨张佳诗张正坤郑岩隋丽杜茜任金平田志来74专利代理机构北京科亿知识产权代理事务所普通合伙11350代理人汤东凤54发明名称利用玉米黑粉菌MIG25启动子进行球孢白僵菌遗传转化方法57摘要本发明公开了一种利用玉米黑粉菌MIG25启动子进行球孢白僵菌遗传转化方法，包括以下步骤1MIGG。
2、FP质粒载体的构建；2球孢白僵菌DNA提取；3球孢白僵菌原生质体的制备；4PEG介导的遗传转化；5PCR检测；6转化子荧光观察。本发明技术方案获得的原生质体再生率达70以上。51INTCL权利要求书2页说明书5页附图2页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书2页说明书5页附图2页10申请公布号CN104131027ACN104131027A1/2页21一种利用玉米黑粉菌MIG25启动子进行球孢白僵菌遗传转化方法，其特征在于，包括以下步骤1MIGGFP质粒载体的构建利用特异引物以质粒MIGCAR为模板扩增得MIG25全序列，克隆到PUCMT载体上，形成PUCMIG，并测序验证。
3、；然后用XBAI和NCOI双酶切PUCMIG和PF质粒，回收MIG片段，克隆到用相同酶切的PF载体上，形成MIGGFP载体；2球孢白僵菌DNA提取100MG菌粉液氮研磨成粉末；置于预先加入600L提取液的15MLEP管静置2MIN；加入100L10SDS，充分混合后加入300L氯化苄，剧烈振荡混匀；50水浴1H，不用颠倒；加入100L3MNAAC，4放置十分钟后使用，冰浴15MIN后12000R/MIN离心10MIN；吸取上清液转入新的离心管，加入体积比为25241的水饱和酚/氯仿/TRIS饱和酚抽提，12000R/MIN离心10MIN；取上清加入RNA酶，65水浴30MIN；加入体积比为25。
4、241的水饱和酚/氯仿/TRIS饱和酚抽提，12000R/MIN离心10MIN；取上清，加入2倍体积的冰预冷无水乙醇，20冰柜，即加满EP管，温和翻转，室温下沉淀30MIN，12000R/MIN离心10MIN；弃上清，留沉淀，以50100L的70乙醇洗沉淀物，12000R/MIN离心3MIN，洗涤12次；干燥后，加入50LTE溶解DNA，保存于20备用；3球孢白僵菌原生质体的制备将培养好的白僵菌菌液用漏斗过滤到空瓶中，留下滤布中得到的菌丝体；渗透压缓冲液洗涤23遍，并用小勺收集菌丝到6MLEP管中；在EP管中加入4ML的LB液体培养基，8L巯基乙醇，摇菌丝，使菌丝充分混入缓冲液中；28下100。
5、R/MIN培养2025MIN；将EP管第二次过滤，收集菌丝体，并用渗透压缓冲液洗涤两次；用小勺刮下滤布上的菌丝到新的EP管，加入4ML渗透压缓冲液，再加入01G的酶粉振荡；28下100R/MIN培养1H，并镜检观察，此时视野中应得到透明圆球状的原生质体；4PEG介导的遗传转化将得到的原生质体悬液吸取400L到2个新的EP管中，做好标记，分别为CK对照MIGGFP；对应管中分别加入10LMIGGFP质粒，冰浴20MIN；每个管中各加入100LPEG4000溶液，混匀，冰浴20MIN；各加入2MLPEG4000，混匀，常温放置5MIN；加入4ML的07MOL/L山梨醇溶液稀释；吸200L于软琼脂平。
6、板上，封口标记，于28恒温箱培养24H；权利要求书CN104131027A2/2页3将1ML的渗透压缓冲液打在软琼脂平板上，重复吸打；吸出100L均匀涂在带有PPT抗性的查氏培养基上，于28恒温箱培养并观察；5PCR检测首先利用氯化苄法提取白僵菌基因组DNA；1100MG菌粉液氮研磨成粉末；2置于预先加入600L提取液的15MLEP管静置2MIN；3加入100L10SDS，充分混合后加入300L氯化苄，剧烈振荡混匀；50水浴1H，不用颠倒；4加入100L3MNAAC，4放置十分钟后使用，冰浴15MIN后12000R/MIN离心10MIN；5吸取上清液转入新的离心管，加入体积比为25241的水饱。
7、和酚/氯仿/TRIS饱和酚抽提，12000R/MIN离心10MIN；6取上清加入RNA酶，65水浴30MIN；7加入体积比为25241的水饱和酚/氯仿/TRIS饱和酚抽提，12000R/MIN离心10MIN；8取上清，加入2倍体积的冰预冷无水乙醇，20冰柜，即加满EP管，温和翻转，室温下沉淀30MIN，12000R/MIN离心10MIN；9弃上清，留沉淀，以50100L的70乙醇洗沉淀物，12000R/MIN离心3MIN，洗涤12次；10干燥后，加入50LTE溶解DNA，保存于20备用；利用基因组DNA做模版，以MIG25特异性引物进行PCR及电泳检测；6转化子荧光观察将转化子在PDA平板上划。
8、线26培养3天，挂下菌丝及孢子置于倒置荧光显微镜下观察。2根据权利要求1所述的利用玉米黑粉菌MIG25启动子进行球孢白僵菌遗传转化方法，其特征在于，步骤2和步骤4中所述提取液为1SDS、05MNACL、02MTRISHCL、001MEDTA、PH80。权利要求书CN104131027A1/5页4利用玉米黑粉菌MIG25启动子进行球孢白僵菌遗传转化方法技术领域0001本发明属于生物工程技术领域，涉及一种利用玉米黑粉菌MIG25启动子进行球孢白僵菌遗传转化方法。背景技术0002球孢白僵菌BEAUVERIABASSIANA是一种致病性与适应性很强，且寄主范围广的昆虫病原真菌，已被作为昆虫真菌制剂广泛。
9、用于玉米螟OSTRINIAFURNACALIS的生物防治。在球孢白僵菌功能基因研究及基因工程育种过程中，启动子是外源或内源基因导入效率的重要因素之一。0003目前，球孢白僵菌的遗传转化启动子主要采用来源于构巢曲霉的PGPDA启动子，长度为2000余BP，虽然具有良好的转化效率，但单一的启动子对不同类型基因进行转化时，会受到酶切位点而影响遗传转化载体的构建，其大小也会影响遗传转化载体的构建，并且影响转化效率，因此，开发一种新的高效启动子能够为球孢白僵菌遗传转化载体的构建提供更多的选择，为球孢白僵菌的功能性基因研究及基因工程育种奠定基础。发明内容0004本发明的目的在于克服现有技术中存在的缺陷，提。
10、供一种利用玉米黑粉菌MIG25启动子进行球孢白僵菌遗传转化方法。其具体技术方案为0005一种利用玉米黑粉菌MIG25启动子进行球孢白僵菌遗传转化方法，包括以下步骤00061MIGGFP质粒载体的构建0007利用特异引物以质粒MIGCAR为模板扩增得MIG25全序列，克隆到PUCMT载体上，形成PUCMIG，并测序验证；然后用XBAI和NCOI双酶切PUCMIG和PF质粒，回收MIG片段，克隆到用相同酶切的PF载体上，形成MIGGFP载体；00082球孢白僵菌DNA提取0009100MG菌粉液氮研磨成粉末；0010置于预先加入600L提取液的15MLEP管静置2MIN；0011加入100L10S。
11、DS，充分混合后加入300L氯化苄，剧烈振荡混匀；50水浴1H，不用颠倒；0012加入100L3MNAAC，4放置十分钟后使用，冰浴15MIN后12000R/MIN离心10MIN；0013吸取上清液转入新的离心管，加入体积比为25241的水饱和酚/氯仿/TRIS饱和酚抽提，12000R/MIN离心10MIN；0014取上清加入RNA酶，65水浴30MIN；0015加入体积比为25241的水饱和酚/氯仿/TRIS饱和酚抽提，12000R/MIN离心说明书CN104131027A2/5页510MIN；0016取上清，加入2倍体积的冰预冷无水乙醇，20冰柜，即加满EP管，温和翻转，室温下沉淀30MI。
12、N，12000R/MIN离心10MIN；0017弃上清，留沉淀，以50100L的70乙醇洗沉淀物，12000R/MIN离心3MIN，洗涤12次；0018干燥后，加入50LTE溶解DNA，保存于20备用；00193球孢白僵菌原生质体的制备0020将培养好的白僵菌菌液用漏斗过滤到空瓶中，留下滤布中得到的菌丝体；0021渗透压缓冲液洗涤23遍，并用小勺收集菌丝到6MLEP管中；0022在EP管中加入4ML的LB液体培养基，8L巯基乙醇，摇菌丝，使菌丝充分混入缓冲液中；002328下100R/MIN培养2025MIN；0024将EP管第二次过滤，收集菌丝体，并用渗透压缓冲液洗涤两次；0025用小勺刮下。
13、滤布上的菌丝到新的EP管，加入4ML渗透压缓冲液，再加入01G的酶粉振荡；002628下100R/MIN培养1H，并镜检观察，此时视野中应得到透明圆球状的原生质体；00274PEG介导的遗传转化0028将得到的原生质体悬液吸取400L到2个新的EP管中，做好标记，分别为CK对照MIGGFP；0029对应管中分别加入10LMIGGFP质粒，冰浴20MIN；0030每个管中各加入100LPEG4000溶液，混匀，冰浴20MIN；0031各加入2MLPEG4000，混匀，常温放置5MIN；0032加入4ML的07MOL/L山梨醇溶液稀释；0033吸200L于软琼脂平板上，封口标记，于28恒温箱培养2。
14、4H；0034将1ML的渗透压缓冲液打在软琼脂平板上，重复吸打；吸出100L均匀涂在带有PPT抗性的查氏培养基上，于28恒温箱培养并观察；00355PCR检测0036首先利用氯化苄法提取白僵菌基因组DNA；00371100MG菌粉液氮研磨成粉末；00382置于预先加入600L提取液的15MLEP管静置2MIN；00393加入100L10SDS，充分混合后加入300L氯化苄，剧烈振荡混匀；50水浴1H，不用颠倒；00404加入100L3MNAAC，4放置十分钟后使用，冰浴15MIN后12000R/MIN离心10MIN；00415吸取上清液转入新的离心管，加入体积比为25241的水饱和酚/氯仿/T。
15、RIS饱和酚抽提，12000R/MIN离心10MIN；00426取上清加入RNA酶，65水浴30MIN；00437加入体积比为25241的水饱和酚/氯仿/TRIS饱和酚抽提，12000R/MIN离说明书CN104131027A3/5页6心10MIN；00448取上清，加入2倍体积的冰预冷无水乙醇，20冰柜，即加满EP管，温和翻转，室温下沉淀30MIN，12000R/MIN离心10MIN；00459弃上清，留沉淀，以50100L的70乙醇洗沉淀物，12000R/MIN离心3MIN，洗涤12次；004610干燥后，加入50LTE溶解DNA，保存于20备用；0047利用基因组DNA做模版，以MIG2。
16、5特异性引物进行PCR及电泳检测；00486转化子荧光观察0049将转化子在PDA平板上划线26培养3天，挂下菌丝及孢子置于倒置荧光显微镜下观察。0050优选地，步骤2和步骤4中所述提取液为1SDS、05MNACL、02MTRISHCL、001MEDTA、PH80。0051与现有技术相比，本发明的有益效果为本发明技术方案获得的原生质体再生率达70以上。应用来源于玉米黑粉菌的MIG25启动子进行球孢白僵菌遗传转化，其转化效率达到21个转化子/GDNA。附图说明0052图1是MIGGFP载体图谱0053图2是制备的原生质体0054图3是MIGGFP转化子及对照图片；图3A是转化子图片，图3B是对照。
17、图片；0055图4是转化子PCR检测图片，泳道M为分子量MARKER，泳道1为阴性对照，泳道2为阳性对照，泳道3为空白对照，泳道411为转MIGGFP基因样品检测；0056图5是转MIGGFP质粒转化子荧光显微检测结果图，其中，图5A为荧光下；图5B为白光下；图5C为合成光下。具体实施方式0057下面结合附图和具体实施例对本发明的技术方案作进一步详细地说明。00581实验方法005911遗传转化载体的构建将来源于玉米黑粉菌MIG25启动子构建到以抗草胺磷基因BAR为筛选标记，绿色荧光蛋白GFP为标记基因，TTRPC为终止子的遗传转化载体上，构建MIGGFP转化载体。006012球孢白僵菌原生质。
18、体的制备及转化0061原生质体的获得00621将培养好的白僵菌菌液用漏斗过滤到空瓶中，留下滤布中得到的菌丝体；00632渗透压缓冲液洗涤23遍，并用小勺收集菌丝到6MLEP管中；00643在EP管中加入4ML的LB液体培养基，8L巯基乙醇，摇菌丝，使菌丝充分混入缓冲液中；0065428下100R/MIN培养2025MIN；00665将小管第二次过滤，收集菌丝体，并用渗透压缓冲液洗涤两次；说明书CN104131027A4/5页700676用小勺刮下滤布上的菌丝到新的EP管，加入4ML渗透压缓冲液，再加入01G的酶粉振荡；0068728下100R/MIN培养1H左右，并镜检观察，此时视野中应得到透。
19、明圆球状的原生质体。0069PEG介导的遗传转化体系建立00701将得到的原生质体悬液吸取400L到三个新的EP管中，做好标记，分别为CK对照和MIGGFP质粒；00712对应管中分别加入10LMIGGFP质粒MIGGFP质粒浓度564UG/L冰浴20MIN；00723每个管中各加入100LPEG4000溶液，混匀，冰浴20MIN；00734各加入2MLPEG4000，混匀，常温放置5MIN；00745加入4ML的07MOL/L山梨醇溶液稀释；00756吸200L于软琼脂平板上，封口标记，于28恒温箱培养24H；00767将1ML的渗透压缓冲液打在软琼脂平板上，重复吸打。吸出100L均匀涂在带。
20、有PPT抗性的查氏培养基上，于28恒温箱培养并观察。0077平均转化效率分析00781对MIGGFP载体进行球孢白僵菌原生质体遗传转化，每个载体转化5个平板；00792转化后对每个转化平板进行转化子数量的统计，取平均值，进行统计分析；008013转化子的PCR检测及荧光观察00811利用灭菌环将查氏培养基上的转化子小心挑出，在提前准备的PDA平板上画多个“Z”字，分别标记为转MIGGFP和CK。00822将划好的平板置于26恒温培养箱恒温培养3D。00833此时得到转化子第一代，继续挑出孢子划线在新的PDA培养基上，培养3D得到第二代孢子；00844同上述过程，得到第三代转化子孢子，在超净工作。
21、台中挑出，置于SDY培养基中摇23D。0085PCR检测利用氯化苄法提取球孢白僵菌转化子基因组DNA，然后利用基因组做模版，利用GFP基因特异性引物，进行PCR及电泳检测。0086荧光观察菌丝从PDA上刮下后置于SDAY培养基中摇三天，将实验控制在相同的培养条件及时间，在培养第48H置于倒置荧光显微镜下观察。00872研究结果008821载体MIGGFP构建如图1所示。008922转化子的获得及转化效率评价00901获得的原生质体再生率达70以上。00912转化子的获得0092利用PEG法将制得的HSP70F质粒转入原生质体后均匀涂在带有PPT抗性的查氏培养基上，恒温培养后结果如图所示。图3A。
22、为转入MIGGFP质粒的球孢白僵菌培养基，相比于图3B的对照组，图3A可看到明显的球孢白僵菌菌落，证明原生质体转化得到阳性转化子。说明书CN104131027A5/5页800933转化效率分析0094每个转化后原生质体悬液均匀涂在5个查氏培养基上，筛选培养34D后，MIGGFP的转化子个数平均值分别为21个/GDNA。009523PCR检测及荧光观察00961PCR检测0097对经过三代继代培养后的转化子，提取总DNA后，利用MIG25特异性引物进行PCR检测。由图4可知，转化子的PCR条带大小与MIG25基因大小相符。00982荧光观察0099菌丝从PDA上刮下后置于SDAY培养基中摇三天，得到的菌丝体由于有GFP荧光基因的表达，所以得到的白僵菌菌丝及孢子中均有荧光出现，具体如图5所示。0100以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，本发明的保护范围不限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，可显而易见地得到的技术方案的简单变化或等效替换均落入本发明的保护范围内。说明书CN104131027A1/2页9图1图2图3说明书附图CN104131027A2/2页10图4图5说明书附图CN104131027A10。