技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种青金桔酵素及其制备方法、用 途。
背景技术
青金桔，海南特产，个头较小，一颗平均在15克左右，每100克果肉内 含维生素C40～50毫克及维生素A、P和芳香油、类胡罗萝卜素等多种物质， 有治疗眼疾、咳嗽、哮喘、高血压、防止动脉硬化等特殊功效。除鲜食外， 金桔还可加工成果汁、蜜饯、罐头、果脯、果酱、果酒等，用途之广实为果 中之王。
青金桔可以美容养颜、止痰润喉、治咳嗽。理气，解郁，化痰，止渴， 消食，醒酒。青金桔能增强机体抗寒能力，可以防治感冒、降低血脂。胸闷 郁结，不思饮食，或伤食饱满，醉酒口渴之人食用；适宜急慢性气管炎，肝 炎，胆囊炎，高血压，直管硬化者食用。脾弱气虚之人不宜多食，糖尿病人 忌食。凡口舌碎痛，齿龈肿痛者忌食。经常食用青金桔，对抗高血压、血管 硬化、冠心病有一定的疗效。
现有的青金桔产品为青金桔粉，青金桔粉采用喷雾干燥进行生产，生产 过程中加入大量的麦芽糊精及其它辅料，口感较酸，比较苦，必须调配才能 饮用。因此，提供一种青金桔酵素及其制备方法具有重要的现实意义。
发明内容
有鉴于此，本发明提供一种青金桔酵素及其制备方法、用途。本发明采 用青金桔为原料进行无糖发酵，即青金桔洗净，打浆，灭菌，接入乳酸菌进 行无氧发酵，发酵过程分两步，分别为前发酵和后发酵，经过两步发酵后， 青金桔酵素口感更加醇厚，产品含有大量的益生菌，具有抗氧化等功效。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种青金桔酵素的制备方法，包括如下步骤：
步骤1：取青金桔打浆收集浆液；取所述浆液与β-环糊精混合脱苦脱涩；
步骤2：取步骤1制得的脱苦脱涩后的浆液经均质、过滤，收集滤液；
步骤3：取步骤2制得的所述滤液加热、降温，制得发酵原液；
步骤4：取乳酸菌制得发酵菌种；
步骤5：将步骤4制得的发酵菌种接种至步骤3制得的发酵原液中，初步 发酵，收集发酵液，澄清、后续发酵。
在本发明的一些具体实施方案中，步骤5中所述接种的接种量为步骤3 制得的发酵原液质量的0.5％～5％。
在本发明的一些具体实施方案中，步骤4制得的发酵菌种的活菌数至少 为106个/mL。
在本发明的一些具体实施方案中，步骤5中所述初步发酵的温度为25℃ ～35℃，所述初步发酵的时间为5～60d。
在本发明的一些具体实施方案中，步骤5中所述初步发酵的温度为25℃ ～35℃，所述初步发酵的时间为5～60d。
在本发明的一些具体实施方案中，步骤5中所述澄清为8000rpm离心 6～10min。
在本发明的一些具体实施方案中，步骤4具体为将乳酸菌接种0.5％～5％ 至灭菌的20％蔗糖溶液中于25℃～35℃恒温培养，制得发酵菌种。
在本发明的一些具体实施方案中，步骤3中所述加热的温度为60℃，所 述加热的时间为5min～10min；所述降温至25℃～35℃。
在本发明的一些具体实施方案中，步骤1中所述浆液与β-环糊精的质量 比为100:(0.01～0.05)；所述混合的时间为5min～20min；
步骤2中所述过滤为经40～100目的筛网进行过滤。
本发明提供了所述制备方法制得的青金桔酵素。
本发明提供的青金桔酵素在制备抗氧化、平衡内分泌、活化细胞、美容 养颜、增强身体抵抗力的药物、食品和/或保健品中的应用。
本发明采用青金桔为原料进行无糖发酵，即青金桔洗净，打浆，灭菌， 接入乳酸菌进行无氧发酵，发酵过程分两步，分别为前发酵和后发酵，经过 两步发酵后，青金桔酵素口感更加醇厚，产品含有大量的益生菌，具有抗氧 化等功效，青金桔酵素加工过程中采用低温加工技术，此加工温度可保证青 金桔的营养成分不流失，更保证了青金桔酵素口感的纯正。本发明的青金桔 酵素可作为食品及保健品。
本发明制得的青金桔酵素是以青金桔味原料，加入乳酸菌进行厌氧发酵 而得，青金桔酵素含有青金桔的原有营养成分，并含有大量益生菌，发酵后 青金桔口感更加醇厚，苦涩味大大减少，青金桔风味较为浓郁，易为人民所 接受，是一种理想的食品及保健品，,青金桔酵素具有平衡内分泌，活化细胞， 美容养颜，提高身体免疫，增强身体抵抗力等功效。
青金桔酵素采用发酵法进行生产，其口感酸甜适中，无苦味，可直接饮 用，益生菌含量达到108以上，维生素C含量达到25mg/100g以上，具有非 常明显的抗氧化功能。
具体实施方式
本发明公开了一种青金桔酵素及其制备方法、用途，本领域技术人员可 以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的 替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发 明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能 在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适 当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明的第一个目的在于提供一种青金桔酵素
本发明的第二个目的还在于提供所述青金桔酵素的用途，可作为食品及 保健品。
一种青金桔酵素及其制备方法，其特征在于：所述青金桔酵素的制备过 程如下：
(1)选取新鲜青金桔，用自来水洗净，用打浆机打浆，收集青金桔浆液， 备用；
(2)青金桔浆液加入0.01-0.05％β-环糊精，搅拌5-20min进行脱苦脱涩 处理，备用；
(4)青金桔浆液过两遍胶体磨，过高压均质机，备用；
(5)青金桔浆液过40-100目的筛网进行过滤，备用；
(6)青金桔浆液加热至60℃，维持5-10min，降温至室温(25～35℃)， 装入灭菌的无菌发酵罐中，备用；
(7)发酵菌种制备：将乳酸菌接种至灭菌的20％蔗糖溶液中进行恒温培 养，制的发酵菌种，备用；
(8)按接种量为青金桔汁重量的0.5-5％的用量接入步骤(7)中制备的 发酵菌种，在室温(25～35℃)条件下发酵5-60天；
(9)发酵结束后对发酵液进行澄清处理，取澄清发酵液体，澄清的发酵 液再装入灭菌的储液罐进行后续发酵，后续发酵时间为5-60天，发酵结束， 得青金桔酵素。
本发明提供的青金桔酵素及其制备方法、用途中所用原料及试剂均可由 市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1
选取新鲜青金桔，用自来水洗净，用打浆机打浆，收集青金桔浆液，备 用；
青金桔浆液加入0.01％(质量比)β-环糊精，搅拌12min进行脱苦脱涩处 理；过两遍胶体磨，过高压均质机，过40目的筛网进行过滤，收集滤液备用；
取滤液加热至60℃，维持8min，降温至20℃，制得青金桔汁，装入灭菌 的无菌发酵罐中；
发酵菌种制备：将乳酸菌接种5％至灭菌的20％蔗糖溶液中进行恒温培 养，培养温度为30℃制得发酵菌种(活菌数至少为106个/mL)，备用；
按接种量为青金桔汁重量的2％(质量百分比)的用量接入制备的发酵菌 种，在20℃条件下发酵30天；
发酵结束后对发酵液进行澄清处理(8000转离心6min)，取澄清发酵液 体，澄清的发酵液再装入灭菌的储液罐进行后续发酵(30℃放置)，后续发酵 时间为5-60天，发酵结束，得青金桔酵素。
实施例2
选取新鲜青金桔，用自来水洗净，用打浆机打浆，收集青金桔浆液，备 用；
青金桔浆液加入0.05％(质量比)β-环糊精，搅拌20min进行脱苦脱涩处 理；过两遍胶体磨，过高压均质机，过70目的筛网进行过滤，收集滤液备用；
取滤液加热至60℃，维持5min，降温至35℃，制得青金桔汁，装入灭菌 的无菌发酵罐中；
发酵菌种制备：将乳酸菌接种0.5％至灭菌的20％蔗糖溶液中进行恒温培 养，培养温度为25℃制得发酵菌种(活菌数至少为106个/mL)，备用；
按接种量为青金桔汁重量的0.5％(质量百分比)的用量接入制备的发酵 菌种，在35℃条件下发酵5天；
发酵结束后对发酵液进行澄清处理(8000转离心10min)，取澄清发酵 液体，澄清的发酵液再装入灭菌的储液罐进行后续发酵(25℃放置)，后续发 酵时间为5天，发酵结束，得青金桔酵素。
实施例3
选取新鲜青金桔，用自来水洗净，用打浆机打浆，收集青金桔浆液，备 用；
青金桔浆液加入0.03％(质量比)β-环糊精，搅拌5进行脱苦脱涩处理； 过两遍胶体磨，过高压均质机，过100目的筛网进行过滤，收集滤液备用；
取滤液加热至60℃，维持10min，降温至5℃，制得青金桔汁，装入灭菌 的无菌发酵罐中；
发酵菌种制备：将乳酸菌接种3％至灭菌的20％蔗糖溶液中进行恒温培 养，培养温度为35℃制得发酵菌种(活菌数至少为106个/mL)，备用；
按接种量为青金桔汁重量的5％(质量百分比)的用量接入制备的发酵菌 种，在5℃条件下发酵60天；
发酵结束后对发酵液进行澄清处理(8000转离心8min)，取澄清发酵液 体，澄清的发酵液再装入灭菌的储液罐进行后续发酵(35℃放置)，后续发酵 时间为60天，发酵结束，得青金桔酵素。
实施例4本发明提供的青金桔酵素及现有技术中青金桔粉维生素C的含量的 对比：
检测方法：
1、原理
本法用0.1％草酸作为溶剂，提取试样中的维生素C，经高效液相色谱仪 C18柱分离，紫外检测器254nm条件下检测，以维生素C保留时间定性，峰 面积定量。
2、试剂
(1)甲醇色谱纯
(2)水蒸馏水
(3)草酸分析纯
(4)维生素C对照品纯度≥99％
(5)0.1％草酸溶液配制：准确称取1.000g草酸，用蒸馏水溶解，并定容 到1000ml容量瓶中，用0.45um滤膜过滤，即得。
(6)维生素C标准品溶液的配制：精密称取维生素C标准品10.0mg， 置于50ml棕色容量瓶中用0.1％草酸溶液溶解，并定容至刻度，混匀，再稀释 100倍即得每ml含2μg对照品溶液。(临用时配制)
3、仪器
(1)高效液相色谱仪附紫外检测器。
(2)色谱柱C18(以十八烷基键合硅胶填料为填充剂)或具同等性能的 色谱柱。
(3)超声清洗器。
4、色谱分离条件
(1)流动相：0.1％草酸溶液。
(2)流速：0.6ml/min。
(3)柱温：25℃。
(4)检测波长：254nm。
(5)进样量：20ul
5、分析步骤
(1)试样的制备
精密称取供试品1.0g，用0.1％草酸溶液溶解，转移至50ml棕色容量瓶中， 稀释至刻度，超声提取15min，用0.45um滤膜过滤，取滤液再稀释100倍作 为供试液。
(2)测定步骤分别精密吸取维生素C对照品溶液和试样溶液各20ul 注入高效液相色谱，依上述色谱条件，以保留时间定性，用外标法计算试样 中维生素C的含量。
(3)分析结果的计算
按下列公式计算样品维生素C的含量：
X = A 1 × m × N 1 A × m 1 × N × 100 ]]>
式中：
X----式样中维生素C的含量，g/100g；
A----维生素C对照品溶液的峰面积；
m----维生素C对照品的质量，g；
N----维生素C对照品溶液的稀释倍数；
A1----试样溶液中维生素C的峰面积；
m1----试样的质量，g；
N1----试样溶液的稀释倍数。
(4)结果表示
计算结果保留3位有效数字。
(5)允许差
同一样品的两次测定值之差不得超过两次测定平均值的±10％。
6、检测结果
产品检测结果见表1：
表1产品检测结果
青金桔酵素及青金桔粉质量评价结果见表2：
表2青金桔酵素及青金桔粉质量评价结果
实施例5
产品益生菌检验：
一、检验方法：
1、主题内容与适用范围
本方法适应益生菌的检测。
2、原理
细菌经过一定倍数的稀释后，能在典型的培养基上培养长成，典型的菌 落，通过计数，可以得到每1ml本产品中活菌数的量。
3、设备和器材
万分之一电子天平，电子称，震荡器，恒温培养箱，高压灭菌锅，超净 工作台，平皿(直径为9cm)，试管(18*180mm)，吸管(1ml)，三角瓶 (250ml)，酒精灯，试管架，移液枪(量程为1000μl)。
4、试剂与溶液
0.9％灭菌生理盐水，营养琼脂，纯化水。
5、操作步骤：
(1)采样
采样时必须特别注意样品的代表性和避免采样的污染。首先准备好灭菌 容器和采样工具。采样后应尽快检验，否则将样品放在低温干燥处保存。
(2)试样的稀释及培养
①准确称取本产品1.0g(精确至0.0002g)，加入内装99ml的灭菌生理 盐水和几棵玻璃珠的三角瓶中，在震荡器上以(200r/min)震荡30min，使样 品充分混匀，制成1：100的均匀稀释液。
②吸取上述的稀释液1ml，加入装有9ml无菌生理盐水的试管中，(注 意管尖端不要触及管内稀释液)振荡摇匀，制成1：1000稀释液。
③按1.2操作至样品溶液稀释到1×10-6备用。每一次操作必须用无菌吸 管，吸管不可重复使用。
④准确吸取上述1×10-6样品溶液0.1ml，接种在事先制成的营养琼脂平 板培养基上，再用无菌接种环在平板上涂抹均匀。做3个平行样和一个空白 对照样。将涂抹好的平板放与超净工做台上30分钟，使菌液渗透于培养基内， 然后将平板倒置，在37℃培养箱内培养24小时至长出典型菌落即可计数。
(3)菌落计数方法
做平板菌落计数时，可用肉眼观察，必需时借助放大镜检查，以防遗漏。 在计数出各平板菌数后，求出同一稀释级的平板的平均数。
(4)菌落计数的报告
以三个重复的菌落数相差不悬殊，每个平皿菌落数在30-300之间来确定 此操作的准确性，否则需要重新操作。最终菌落总数取三个平皿中的菌落总 数的平均数。以上均在无菌条件下操作。
(5)稀释度的选择
应选择平均菌落数在30-300之间的稀释度，乘以稀释倍数报告之。
如果有两个稀释度，其生长的菌落数都在30-300之间，视两者的比值 来确定，如果其比值小于2，应报告其平均数；如果小于2，则报告其中较小 的数字。
如果所有的稀释度平均菌落数均大于300，则应按照稀释度最高的平均 菌落数乘以稀释倍数报告。
如果所有的稀释度平均菌落数均小于30，则应按照稀释度最低的平均菌 落数乘以稀释倍数报告。
如所有稀释度均无菌落生长，则以小于1乘以最低稀释倍数报告之。
如所有稀释度平均菌落数均不在30-300之间，其中一大部分大于300 或小于30时，则以最接近300或30的平均菌落数乘以稀释倍数报告之。
(6)结果报告
菌落在100以内时，按其实有数报告；大于100时，采用两位有效数 字，其后面数值，以四舍五入的方法计算。为了缩短数字后面的零数，也可 采用10的指数来表示。
6、计算公式
X＝A×10B
其中：
X-----每毫升样品中益生菌落数
A------最终计数的菌落总数
B-------稀释倍数
二、检验结果见表3：
表3检验结果
顺序 项目 数目(个) 1 保加利亚乳杆菌 108 2 双歧杆菌 107
实施例6青金桔酵素功效试验：
一、抗氧化功能试验
1.材料与方法
1.1实验材料与仪器
D-半乳糖(Sigma，美国)，青金桔酵素(海南南派实业有限公司，中国，产 品批号：151006)。
蛋白质羰基(PC)试剂盒(A087)、还原性谷胱甘肽(GSH)试剂盒(A006-1)、 丙二醛(MDA)试剂盒(A003-1)、超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒(A001-1)，总蛋 白定量试剂盒(AS045-2)(南京建成生物研究所，中国)。
冷冻离心机；二氧化碳培养箱；pro型多功能酶标仪；饮水瓶，灌胃针， 动物电子秤，手术剪，眼科镊，高压灭菌锅，水浴锅；振荡培养箱。
2.动物与实验方法
雄性小鼠，年龄3-4个月大，体重25-30g。
3.实验分组
实验前，小鼠适应性饲养一周。将小鼠随机分为5组，每组10只：
①正常组(n＝10)：给予正常饮食，小鼠颈背部注射生理盐水(0.1mL/10g)， 连续注射72天，第43天开始灌胃给予生理盐水(20mL/kg)，灌胃30天。
②模型组(n＝10)：小鼠颈背部注射D-半乳糖(D-半乳糖浓度，注射剂量 ＝400mg/kg，0.1mL/10g)，连续注射72天，第43天开始灌胃给予生理盐水(20 mL/kg)，灌胃30天。
③试验组(n＝10)：小鼠颈背部注射D-半乳糖(D-半乳糖浓度，注射剂量 ＝400mg/kg，0.1mL/10g)，连续注射72天，第43天开始灌胃给予实施例1制 备的青金桔酵素(30mL/kg)，灌胃30天。
4.实验方法
小鼠末次给药1h后处死动物，取肝脏和血清，分别根据试剂盒方法测 定血清中MDA含量、GSH含量、SOD活力以及肝脏中PC含量。
判定标准：MDA、PC、SOD、GSH四项指标中三项阳性，可判定该受 试样品抗氧化功能动物实验结果阳性。
5.数据处理
试验数据采用方差分析进行统计处理。p<0.05为差异显著，有统计学意 义。
6.试验结果及分析见表4：
表4青金桔酵素对小鼠体重增重和脾指数的影响
组别 动物数(只) 初始体重(g) 体重增加(g/72d) 脾指数(mg/g) 正常组 10 27.2±1.0 25.6±6.5＊ 12.45±0.93＊ 模型组 10 27.5±1.5 19.1±1.9 11.36±0.65 实验组 10 27.0±1.2 15.3±3.6＊ 13.21±1.10＊
*P<0.05。与模型组相比。
研究表明，D-半乳糖会引起活性氧的积累，导致氧化应激、减少寿命。 在D-半乳糖诱导的小鼠实验中，给予青金桔酵素后，上调了脾指数，提高了 机体抗氧化水平。
表5青金桔酵素对D-半乳糖氧化损伤小鼠MDA,GSH,PC含量和SOD酶活力 的影响
组别 MDA(nmol/g) GSH(g/L) SOD(U/mg) PC(nmol/g) 正常组 7.41±1.90＊ 4.25±1.74＊ 55.53±9.62＊ 2.78±0.60＊ 模型组 12.23±4.31 2.51±0.62 37.16±3.16 4.65±1.14 实验组 7.97±1.56＊ 4.01±1.06＊ 52.10±6.85＊ 4.42±0.87＊
*P<0.05，与模型组相比。
考察了酵素对小鼠机体的抗氧化功能的影响，试验结果表明，青金桔酵 素可以显著下调小鼠血清丙二醛和肝脏中蛋白质羰基水平，上调小鼠血清中 谷胱甘肽和超氧化物歧化酶的水平，青金桔酵素具有显著的抗氧化功能。
取实施例2、实施例3制备的青金桔酵素进行上述试验，试验结果与实施 例1制备的青金桔酵素的结果无显著差异(P＞0.05)。表明本发明制备的青 金桔酵素具有抗氧化功能。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普 通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润 饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。