技术领域
本发明涉及胰高血糖素类似物及其医学用途，例如在治疗过量食物摄 取、肥胖和体重过重及相关病症、以及胆固醇升高中的用途。所述化合物 还可用来改善血糖控制(glycaemic control)和/或用于治疗糖尿病。
背景技术
前胰高血糖素原(preproglucagon)是158个氨基酸的前体多肽，其 在组织中进行差异加工以形成许多结构相关的胰高血糖素原衍生肽 (proglucagon-derived peptide)，包括胰高血糖素(glucagon，Glu)、胰 高血糖素样肽-1(glucagon-like peptide-1，GLP-1)、胰高血糖素样肽-2 (glucagon-like peptide-2，GLP-2)和泌酸调节肽(oxyntomodulin， OXM)。这些分子参与很多种生理功能，包括葡萄糖稳态、胰岛素分泌、 胃排空和肠生长以及对摄食量的调节。
胰高血糖素是29个氨基酸的肽，其对应于前胰高血糖素原的氨基酸 53至81，并且具有以下序列
His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg- Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr
泌酸调节肽(OXM)是37个氨基酸的肽，其包含胰高血糖素的完整29 个氨基酸序列和八肽羧基末端延伸区(前胰高血糖素原的氨基酸82至89， 具有序列Lys-Arg-Asn-Arg-Asn-Asn-Ile-Ala，并且称为“间插肽1(intervening peptide 1)”或IP-1；因此人泌酸调节肽的全序列是
His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg- Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-Lys-Arg-Asn-Arg-Asn-Asn-Ile-Ala)。
GLP-1的主要生物学活性片段是由30个氨基酸的C末端酰胺化的肽产 生，其对应于前胰高血糖素原的氨基酸98至127。
胰高血糖素通过与肝细胞上的胰高血糖素受体结合，引起肝脏通过糖 原分解而释放以糖原形式贮藏的葡萄糖，从而帮助维持血液中的葡萄糖水 平。随着这些贮藏被耗尽，胰高血糖素刺激肝脏通过糖异生合成额外的葡 萄糖。该葡萄糖释放到血流中，阻止低血糖的发生。
OXM响应于食物摄取而释放到血液中，并且与膳食的卡路里含量成 正比。OXM已经显示出在人中抑制食欲和抑制食物摄取(Cohen等， Journal of Endocrinology and Metabolism，88，4696-4701，2003；WO 2003/022304)。除了那些与GLP-1相似的厌食作用，OXM还必须通过另 一种机理影响体重，因为用泌酸调节肽处理的大鼠示出比配对喂养的大鼠 较少的体重增长(Bloom，Endocrinology2004，145，2687)。用OXM处理 肥胖大鼠还改善了其葡萄糖耐量(Parlevliet等，Am J Physiol Endocrinol Metab，294，E142-7，2008)并抑制了体重增长(WO2003/022304)。
OXM激活胰高血糖素和GLP-1受体二者，且对于胰高血糖素受体具 有比GLP-1受体两倍更高的效力，但是与天然胰高血糖素和GLP-1相比 对其各自受体的效力更低。人胰高血糖素也能够激活这两种受体，但是对 于胰高血糖素受体比GLP-1受体有更强的偏爱。另一方面，GLP-1不能 激活胰高血糖素受体。还未很好地了解泌酸调节肽的作用机理。特别是， 不知道该激素的一些肝外作用是否通过GLP-1和胰高血糖素受体介导， 或是否通过一种或更多种尚未确认的受体介导。
已经表明另一些肽结合并激活胰高血糖素受体和GLP-1受体二者 (Hjort等，Journal of Biological Chemistry，269，30121-30124，1994)以 及抑制体重增长和降低摄食量(WO2006/134340；WO2007/100535；WO 2008/10101，WO2008/152403，WO2009/155257和WO2009/155258)。
糖尿病(尤其是2型糖尿病)确立了自己作为21世纪的流行病，估 计5％的世界成年人群患有该疾病。可归于糖尿病的死亡数稳定地增长， 目前估计每年有380万例，反映出用目前可得的治疗不足以实现血糖控 制。因此，需要更有效的血糖控制治疗。
肥胖是全球增长的与多种疾病(特别是心血管疾病(cardiovascular disease，CVD)、2型糖尿病、阻塞性睡眠呼吸暂停、某些类型的癌症和骨 关节炎)相关的健康问题。结果，已发现肥胖降低了寿命期望。根据世界 卫生组织的2005年预测，世界范围有4亿成人(年龄＞15)划分为肥胖。 在美国，现在认为肥胖是在吸烟后第二主要的可预防性死亡(preventable death)原因。
肥胖的上升驱使糖尿病的增长，且大约90％患有2型糖尿病的人被 划分为肥胖。世界范围有2.46亿人患有糖尿病，且到2025年估计将有3.8 亿人患有糖尿病。许多还有心血管风险因素，包括高/异常LDL和甘油三 酯以及低HDL。
另一些病症与代谢疾病相关，例如高血压、致动脉粥样化的血脂异常 (atherogenic dyslipidemia)、动脉粥样硬化、冠心病、卒中和肥胖相关 的炎症。因此，潜在代谢疾病的治疗可对后续病症有积极的影响。
因此，有很强的对于治疗代谢及相关疾病(例如肥胖、血脂异常和糖 尿病)的医药需要。
发明内容
在第一个方面，本发明提供了具有下式的化合物或其可药用盐：
R1-X-Z-R2
其中
R1为H、C1-4烷基、乙酰基、甲酰基、苯甲酰基或三氟乙酰基；
R2为OH或NH2；
X为具有式I的肽：
His-X2-X3-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-X12-Tyr-Leu-Asp-X16-Arg-Arg-Ala-X20-Asp-Phe-lle- X24-Trp-Leu-X27-X28-X29(I)
其中
X2选自Ser、D-Ser和Aib；
X3选自Gln、His和Pro；
X12选自Lys和Y
X16选自Glu和Y；
X20选自Lys和Y；
X24选自Glu和Y；
X27选自Leu和Y；
X28选自Ser和Y或不存在；
X29为Ala或不存在；
其中X12、X16、X17、X20、X27和X28中至少一个是Y；
其中每个残基Y独立地选自Lys、Cys和Orn；
其中至少一个氨基酸残基Y的侧链与具有下式的亲脂性取代基缀合：
(i)Z1，其中Z1是与Y的侧链直接缀合的亲脂性部分；或
(ii)Z1Z2，其中Z1是亲脂性部分，Z2是间隔区，并且Z1通过Z2与Y的 侧链缀合；
并且Z不存在或为1至20个氨基酸单元的序列，所述氨基酸单元独立地 选自Ala、Leu、Ser、Thr、Tyr、Cys、Glu、Lys、Arg、Dbu、Dpr和 Orn。
肽X可具有式Ia：
His-X2-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-X16-Arg-Arg-Ala-X20-Asp-Phe-Ile- X24-Trp-Leu-X27-X28-Ala(Ia)
其中
X2选自Ser、D-Ser和Aib；
X16选自Glu和Y；
X20选自Lys和Y；
X24选自Glu和Y；
X27选自Leu和Y；并且
X28选自Ser和Y。
肽X可具有以下序列：
H-Aib-QGTFTSDYSKYLDKRRAKDFIEWLLSA；
H-Aib-QGTFTSDYSKYLDERRAKDFIEWLLSA；
H-Aib-QGTFTSDYSKYLDERRAKDFIKWLLSA；
HSQGTFTSDYSKYLDERRAKDFIKWLLSA；
H-Aib-QGTFTSDYSKYLDERRAKDFIEWLKSA；或
H-Aib-QGTFTSDYSKYLDERRAKDFIEWLLKA。
例如，肽X可以是：
H-Aib-QGTFTSDYSKYLDK*RRAKDFIEWLLSA；
H-Aib-QGTFTSDYSKYLDERRAK*DFIEWLLSA；
H-Aib-QGTFTSDYSKYLDERRAKDFIK*WLLSA；
HSQGTFTSDYSKYLDERRAKDFIK*WLLSA；
H-Aib-QGTFTSDYSKYLDERRAKDFIEWLK*SA；或
H-Aib-QGTFTSDYSKYLDERRAKDFIEWLLK*A；
其中K*表示与亲脂性取代基缀合的Lys残基。
例如，所述化合物可以是：
H-H-Aib-QGTFTSDYSKYLD-K(十六烷酰基-异Glu)-RRAKDFIEWLLSA-NH2[化合物1]；
H-H-Aib-QGTFTSDYSKYLDERRA-K(十六烷酰基-异Glu)-DFIEWLLSA-NH2[化合物2]；
H-H-Aib-QGTFTSDYSKYLDERRAKDFI-K(十六烷酰基-异Glu)-WLLSA-NH2[化合物3]；
H-HSQGTFTSDYSKYLDERRAKDFI-K(十六烷酰基-异Glu)-WLLSA-NH2[化合物4]；
H-H-Aib-QGTFTSDYSKYLDERRAKDFIEWL-K(十六烷酰基-异Glu)-SA-NH2[化合物5]；或
H-H-Aib-QGTFTSDYSKYLDERRAKDFIEWLL-K(十六烷酰基-异Glu)-A-NH2[化合物6]；
或其可药用盐。
在第二个方面，本发明提供了具有下式的化合物或其可药用盐：
R1-X-Z-R2
其中
R1为H、C1-4烷基、乙酰基、甲酰基、苯甲酰基或三氟乙酰基；
R2为OH或NH2；
X为具有式II的肽：
His-X2-X3-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-X12-Tyr-Leu-Asp-X16-X17-Arg-Ala-X20-Asp-Phe-Ile- X24-Trp-Leu-X27-X28-X29(II)
其中
X2选自Ser、D-Ser和Aib；
X3选自Gln、His和Pro；
X12选自Arg、Lys和Y
X16选自Glu和Y；
X17选自Arg和Y；
X20选自Lys、Arg和Y；
X24选自Glu和Y；
X27选自Leu和Y；
X28选自Ser和Y或不存在；
X29为Ala或不存在；
其中X12和/或X20为Arg；
其中X12、X16、X17、X20、X24、X27和X28中至少一个是Y；
其中每个残基Y独立地选自Lys、Cys和Orn；
其中至少一个氨基酸残基Y的侧链与具有下式的亲脂性取代基缀合：
(i)Z1，其中Z1是与Y的侧链直接缀合的亲脂性部分；或
(ii)Z1Z2，其中Z1是亲脂性部分，Z2是间隔区，并且Z1通过Z2与Y的 侧链缀合；
并且Z不存在或为1至20个氨基酸单元的序列，所述氨基酸单元独立地 选自Ala、Leu、Ser、Thr、Tyr、Cys、Glu、Lys、Arg、Dbu、Dpr和 Orn。
可期望X12为Arg。
肽X可具有式IIa：
His-X2-X3-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Arg-Tyr-Leu-Asp-X16-X17-Arg-Ala-X20-Asp-Phe-Ile- X24-Trp-Leu-Leu-Ser-Ala(IIa)
其中
X2选自Ser、D-Ser和Aib；
X3选自Gln、His和Pro；
X16选自Glu和Y；
X17选自Arg和Y；
X20选自Arg和Lys；并且
X24选自Glu和Y。
肽X可具有式IIb：
His-X2-X3-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Arg-Tyr-Leu-Asp-Glu-X17-Arg-Ala-Arg-Asp-Phe-Ile- Glu-Trp-Leu-Leu-Ser-Ala(IIb)
其中
X2选自Ser、D-Ser和Aib；
X3选自Gln、His和Pro；并且
X17为Y。
肽X可具有以下序列：
HSQGTFTSDYSRYLDEKRARDFIEWLLSA；
H-DSer-QGTFTSDYSRYLDEKRARDFIEWLLSA；
H-Aib-QGTFTSDYSRYLDEKRARDFIEWLLSA；
HSHGTFTSDYSRYLDEKRARDFIEWLLSA；
H-DSer-HGTFTSDYSRYLDEKRARDFIEWLLSA；
H-Aib-GTFTSDYSRYLDEKRARDFIEWLLSA；
HSPGTFTSDYSRYLDEKRARDFIEWLLSA；
H-DSer-PGTFTSDYSRYLDEKRARDFIEWLLSA；
H-Aib-PGTFTSDYSRYLDEKRARDFIEWLLSA；或
H-Aib-QGTFTSDYSRYLDEKRAKDFIEWLLSA。
例如，X可以是：
HSQGTFTSDYSRYLDEK*RARDFIEWLLSA；
H-DSer-QGTFTSDYSRYLDEK*RARDFIEWLLSA；
H-Aib-QGTFTSDYSRYLDEK*RARDFIEWLLSA；
HSHGTFTSDYSRYLDEK*RARDFIEWLLSA；
H-DSer-HGTFTSDYSRYLDEK*RARDFIEWLLSA；
H-Aib-GTFTSDYSRYLDEK*RARDFIEWLLSA；
HSPGTFTSDYSRYLDEK*RARDFIEWLLSA；
H-DSer-PGTFTSDYSRYLDEK*RARDFIEWLLSA；
H-Aib-PGTFTSDYSRYLDEK*RARDFIEWLLSA；或
H-Aib-QGTFTSDYSRYLDEK*RAKDFIEWLLSA。
其中K*表示与亲脂性取代基缀合的Lys残基。
所述化合物可以是：
H-HSQGTFTSDYSRYLDE-K(十六烷酰基-异Glu)-RARDFIEWLLSA-NH2[化合物7]；
H-H-DSer-QGTFTSDYSRYLDE-K(十六烷酰基-异Glu)-RARDFIEWLLSA-NH2[化合物8]；
H-H-Aib-QGTFTSDYSRYLDE-K(十六烷酰基-异Glu)-RARDFIEWLLSA-NH2[化合物9]；
H-HSHGTFTSDYSRYLDE-K(十六烷酰基-异Glu)-RARDFIEWLLSA-NH2[化合物10]；
H-H-DSer-HGTFTSDYSRYLDE-K(十六烷酰基-异Glu)-RARDFIEWLLSA-NH2[化合物11]；
H-H-Aib-HGTFTSDYSRYLDE-K(十六烷酰基-异Glu)-RARDFIEWLLSA-NH2[化合物12]；
H-HSPGTFTSDYSRYLDE-K(十六烷酰基-异Glu)-RARDFIEWLLSA-NH2[化合物13]；
H-H-DSer-PGTFTSDYSRYLDE-K(十六烷酰基-异Glu)-RARDFIEWLLSA-NH2[化合物14]；
H-H-Aib-PGTFTSDYSRYLDE-K(十六烷酰基-异Glu)-RARDFIEWLLSA-NH2[化合物15]；或
H-H-Aib-QGTFTSDYSRYLDE-K(十六烷酰基-异Glu)-RAKDFIEWLLSA-NH2[化合物16]；
或其可药用盐。
在第三个方面，本发明提供了具有下式的化合物或其可药用盐：
R1-X-Z-R2
其中
R1为H、C1-4烷基、乙酰基、甲酰基、苯甲酰基或三氟乙酰基；
R2为OH或NH2；
X为具有式III的肽：
His-X2-X3-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-X12-Tyr-Leu-Asp-X16-X17-Arg-Ala-X20-Asp-Phe-Ile- X24-Trp-Leu-X27-X28-X29(III)
其中
X2选自Ser、D-Ser和Aib；
X3选自Gln、His和Pro；
X12选自Lys和Y
X16选自Glu和Y；
X17选自Arg和Y；
X20选自Lys和Y；
X24选自Glu和Y；
X27选自Leu和Y；
X28选自Ser和Y或不存在；
X29为Ala或不存在；
其中当X2为Ser或Aib时，X3为His或Pro，且当X3为Gln时X2为 D-Ser；
其中X12、X16、X17、X20、X24、X27和X28中至少一个是Y；
其中每个残基Y独立地选自Lys、Cys和Orn；
其中X的至少一个氨基酸残基Y的侧链与具有下式的亲脂性取代基缀合：
(i)Z1，其中Z1是与Y的侧链直接缀合的亲脂性部分；或
(ii)Z1Z2，其中Z1是亲脂性部分，Z2是间隔区，并且Z1通过Z2与Y的 侧链缀合；
并且Z不存在或为1至20个氨基酸单元的序列，所述氨基酸单元独立地 选自Ala、Leu、Ser、Thr、Tyr、Cys、Glu、Lys、Arg、Dbu、Dpr和 Orn。
肽X可具有下式IIIa：
His-X2-X3-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-X12-Tyr-Leu-Asp-X16-X17-Arg-Ala-X20-Asp-Phe-Ile- X24-Trp-Leu-Leu-Ser-Ala(IIIa)
其中
X2选自Ser、D-Ser和Aib；
X3选自Gln、His和Pro；
X12选自Lys和Y
X16选自Glu和Y；
X17选自Arg和Y；
X20选自Lys和Y；并且
X24选自Glu和Y。
肽X可具有式IIIb：
His-X2-X3-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Glu-X17-Arg-Ala-Lys-Asp-Phe-Ile- Glu-Trp-Leu-Leu-Ser-Ala(IIIb)
其中
X2选自Ser、D-Ser和Aib；
X3选自Gln、His和Pro；并且
X17为Y。
肽X可具有以下序列：
H-DSer-QGTFTSDYSKYLDEKRAKDFIEWLLSA；
HSHGTFTSDYSKYLDEKRAKDFIEWLLSA；
H-DSer-HGTFTSDYSKYLDEKRAKDFIEWLLSA；
HSPGTFTSDYSKYLDEKRAKDFIEWLLSA；或
H-DSer-PGTFTSDYSKYLDEKRAKDFIEWLLSA。
肽X可以是：
H-DSer-QGTFTSDYSKYLDEK*RAKDFIEWLLSA；
HSHGTFTSDYSKYLDEK*RAKDFIEWLLSA；
H-DSer-HGTFTSDYSKYLDEK*RAKDFIEWLLSA；
HSPGTFTSDYSKYLDEK*RAKDFIEWLLSA；或
H-DSer-PGTFTSDYSKYLDEK*RAKDFIEWLLSA；
其中K*表示与亲脂性取代基缀合的Lys残基。
所述化合物可以是：
H-H-DSer-QGTFTSDYSKYLDE-K(十六烷酰基-异Glu)-RAKDFIEWLLSA-NH2[化合物17]；
H-HSHGTFTSDYSKYLDE-K(十六烷酰基-异Glu)-RAKDFIEWLLSA-NH2[化合物18]；
H-H-DSer-HGTFTSDYSKYLDE-K(十六烷酰基-异Glu)-RAKDFIEWLLSA-NH2[化合物19]；
H-HSPGTFTSDYSKYLDE-K(十六烷酰基-异Glu)-RAKDFIEWLLSA-NH2[化合物20]；或
H-H-DSer-PGTFTSDYSKYLDE-K(十六烷酰基-异Glu)-RAKDFIEWLLSA-NH2[化合物21]；
或其可药用盐。
在本发明上面的任何方面中，可期望肽X仅含有一个Y残基。
无论肽X含有一个或多于一个Y残基，该Y残基或每个Y残基可以 是Lys。
本发明还提供了分离的核酸(其可以是DNA或RNA)，其编码上述 的本发明三个方面中任一所定义的肽X-Z，即，在将亲脂性取代基添加至 任何残基Y前编码任何本发明这些化合物的肽主链。(当然，这可能在仅 当X-Z中的每个残基为20个自然氨基酸之一时是适当的，所述氨基酸可 通过核酸翻译整合到蛋白质中。)还提供了包含这种核酸的表达载体 (expression vector)以及含有这种核酸或表达载体的宿主细胞。
在第四个方面中，本发明提供了以下化合物：
H-H-Aib-QGTFTSDYSKYLDE-K(十八烷酰基-异Glu)-RAKDFIEWLLSA-NH2[化合物22]；
H-H-Aib-QGTFTSDYSKYLDE-K(十六烷酰基-异Glu)-RAKDFIEWLLSA-OH[化合物23]；和
H-H-Aib-QGTFTSDYSKYLDE-K(十八烷酰基-异Glu)-RAKDFIEWLLSA-OH[化合物24]。
本发明还提供了包含与载剂(carrier)混合的本发明之化合物、核酸、 表达载体或宿主细胞的组合物。在一些优选的实施方案中，所述组合物为 可药用组合物且所述载剂为可药用的载剂。所述组合物可含有本发明化合 物的可药用盐。
此外，本发明提供了上述的本发明任何方面的化合物或组合物，其用 于医药治疗方法。
所描述的化合物可特别地用于防止体重增长或促进体重减轻。“防止” 意指当与治疗不存在时相比抑制或降低，且不一定意指体重增长的完全停 止。肽可引起摄食量的降低和/或能量消耗的提高，从而产生对于体重所 观察到的效果。
独立于它们对体重的作用，本发明的化合物可具有对循环胆固醇水平 有益的作用，能够降低循环LDL水平并提高HDL/LDL比值。
独立于它们对体重的作用，所述化合物还可具有对血糖控制有益的作 用。设想这样的化合物可治疗性地用于不直接与体重过重或肥胖相关或者 由体重过重或肥胖引起的病症(例如I型糖尿病和妊娠糖尿病)。
当然，不能排除它们在根本上由肥胖或体重过重引起或加剧之病症中 的用途。确实，它们对于葡萄糖控制和体重的作用可使得其特别适合于治 疗这样的病症。
因此，本发明的化合物可用于任何由体重过重引起或为特征之病症的 直接或间接治疗，例如肥胖、病态肥胖、肥胖相关炎症、肥胖相关胆囊疾 病、肥胖诱发的睡眠呼吸暂停的治疗和/或预防。它们还可用于预防代谢 综合征、I型糖尿病、II型糖尿病、高血压、致动脉粥样化的血脂异常、 动脉粥样硬化、动脉硬化、冠心病或卒中。它们在这些病症中的作用可以 是其对于体重之作用的结果或与之相关，或者可以是与其相独立的。
因此，本发明提供了用于在有此需要的个体中防止体重增长或促进体 重减轻的方法中的本发明化合物。还提供了本发明的化合物在制造用于在 个体中防止体重增长或促进体重减轻之药物中的用途。还提供了在有此需 要的个体中防止体重增长或促进体重减轻的方法，其包括向所述个体施用 本发明的化合物。
本发明还提供了用于在有此需要的个体中降低循环LDL水平和/或提 高HDL/LDL比值之方法中使用的本发明的化合物。还提供了提供了本发 明的化合物在制造用于在个体中降低循环LDL水平和/或提高HDL/LDL 比值之药物中的用途。还提供了在有此需要的个体中降低循环LDL水平 和/或提高HDL/LDL比值的方法，其包括向所述个体施用本发明的化合 物。
本发明还提供了用于预防或治疗由体重过重引起或以其为特征之病 症的方法的本发明化合物。还提供了本发明的化合物在制造用于预防或治 疗由体重过重引起或以其为特征的病症的药物中的用途。还提供了在有此 需要的个体中预防或治疗由体重过重引起或以其为特征之病症的方法，其 包括向所述个体施用本发明的化合物。
本发明还提供了用于在有此需要的个体中预防和/或治疗肥胖、病态 肥胖、术前病态肥胖、肥胖相关炎症、肥胖相关胆囊疾病、肥胖诱发的睡 眠呼吸暂停、I型糖尿病、II型糖尿病、代谢综合征、高血压、致动脉粥 样化的血脂异常、动脉粥样硬化、动脉硬化、冠心病、外周动脉疾病、卒 中或微血管疾病的方法中的本发明化合物。还提供了本发明的化合物在制 造用于预防或治疗这样的疾病的药物中的用途。还提供了在有此需要的个 体中预防或治疗这样的疾病的方法，其包括向所述个体施用本发明的化合 物。
本发明还提供了与用于治疗肥胖、血脂异常、糖尿病或高血压的药剂 一起使用的本发明化合物。还提供了本发明化合物在制造与用于治疗肥 胖、血脂异常、糖尿病或高血压的药剂一起使用的药物中的用途。还提供 了治疗方法，其包括将本发明的化合物与用于治疗肥胖、血脂异常、糖尿 病或高血压的药剂一起向有此需要的个体施用。还提供了包含本发明的化 合物和用于治疗肥胖、血脂异常、糖尿病或高血压之药剂的药物组合物。
用于治疗肥胖的药剂可以是胰高血糖素样肽受体1激动剂、肽YY受 体激动剂或其类似物、大麻素受体(cannabinoid receptor)1拮抗剂、脂 肪酶抑制剂、黑皮质素受体4激动剂或黑色素聚集激素(melanin concentrating hormone)受体1拮抗剂。
用于治疗高血压的药剂可以是血管紧张素转化酶抑制剂、血管紧张素 II受体阻断剂、利尿剂、β-阻断剂或钙通道阻断剂。
用于治疗血脂异常的药剂可以是他汀类(statin)、贝特类(fibrate)、 烟酸类(niacin)和/或胆固醇吸收抑制剂。
用于治疗糖尿病的药剂可以是二甲双胍、磺酰脲类、格列奈类 (glinide)、DPP-IV抑制剂、格列酮类(glitazone)、GLP-1激动剂、胰 岛素或胰岛素类似物。
如已经描述的，本发明扩展至包含上述核酸序列的表达载体(任选地 与序列组合以指导其表达)以及含有所述表达载体的宿主细胞。优选地， 所述宿主细胞能够表达并分泌本发明的化合物，或本发明化合物的肽主链 X-Z。在另一方面中，本发明提供了生产所述化合物的方法，所述方法包 括在适合于表达所述化合物的条件下培养宿主细胞并纯化如此产生的化 合物。所述方法可包括在适当的氨基酸位置添加亲脂性取代基的进一步步 骤。
本发明还提供了在医学治疗方法中使用的本发明核酸、本发明表达载 体或能够表达和分泌本发明化合物的宿主细胞。应了解，所述核酸、表达 载体和宿主细胞可用于治疗本文中描述的任何病症，其可用本发明的化合 物本身治疗。因此提及包含本发明化合物的治疗性组合物、本发明化合物 的施用或其任何治疗性用途应当解释为涵盖本发明的核酸、表达载体或宿 主细胞的等价用途(equivalent use)，上下文另有要求的除外。
发明详述
在整个本说明书中，使用天然氨基酸的常规单字母和三字母代码以及 另一些氨基酸的普遍接受的三字母代码，例如Aib(α-氨基异丁酸)、Orn (鸟氨酸)、Dbu(2，4二氨基丁酸)、D-Ser(D型Ser)和Dpr(2，3-二氨 基丙酸)。
术语“天然胰高血糖素”指具有以下序列的天然人胰高血糖素：
H-His-Ser-Gln- Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu- Met-Asn-Thr-OH(SEQ ID NO：1)。
本发明提供了如上所定义的化合物。为了避免疑惑，在本文提供的定 义中，通常意指肽X的序列仅可在规定允许变化的那些位置变化，且仅 在规定的选项内变化。可认为序列X中的氨基酸以常规的N端至C端方 向从1至29连续编号。因此提及X中的“位置”应解释为应参照天然人 胰高血糖素和其他分子中的位置。
不希望受任何特定理论束缚，在天然胰高血糖素位置27、28和29 的残基似乎提供了肽对于胰高血糖素受体的显著选择性。
在本发明化合物这些位置上出现的残基可提高GLP-1受体的效力和/ 或对GLP-1受体的选择性，而潜在地没有胰高血糖素受体效力的显著降 低。
替换位置27处天然的Met残基(例如，用Leu或Lys，尤其是用Leu) 还降低氧化的可能性，从而提高化合物的化学稳定性。
替换位置28处天然的Asn残基(例如，用Ser、Arg或Ala)也降低 在酸溶液中脱酰胺的可能性，从而提高化合物的化学稳定性。
替换位置20和24处天然的Gln残基中的一个或两个也降低在酸溶 液中脱酰胺的可能性，从而提高化合物的化学稳定性。
用合适的氨基酸Y替换位置12、16、17、20、24、27和28处天然 的氨基酸中的一个或更多个能够使得与亲脂性取代基缀合。在这些位置处 的残基Y可独立地是Cys、Orn或Lys。更特别地，这些残基的一个或更 多个可以是Cys。此外，在这些位置处的一个或更多个残基可以是Lys。 在化合物含有多于一个残基Y时，它们可以相同(都为Cys、都为Orn 或都为Lys)或不同。在一些实施方案中，可期望每个X仅含有一个残基 Y。所述残基Y或每个残基Y可以是Lys。
如已经公开的，本发明的化合物可包含1至20个氨基酸的C端肽序 列Z，例如来稳定胰高血糖素类似物肽的构象和/或二级结构，以及来使 得胰高血糖素类似物肽对酶促水解更有抗性，例如在WO99/46283中所描 述的。
当存在时，Z表示1至20个氨基酸残基的肽序列，例如在1至15的 范围中，更优选地在1至10的范围中，特别在1至7个氨基酸残基的范 围中，例如1、2、3、4、5、6或7个氨基酸残基(例如6个氨基酸残基)。 在肽序列Z中的每个氨基酸残基可独立地选自Ala、Leu、Ser、Thr、Tyr、 Cys、Glu、Lys、Arg、Dbu(2，4二氨基丁酸)、Dpr(2，3-二氨基丙酸) 和Orn(鸟氨酸)。优选地，所述氨基酸残基选自Ser、Thr、Tyr、Glu、 Lys、Arg、Dbu、Dpr和Orn，更优选地仅选自Glu、Lys和Cys。上面 提到的氨基酸可具有D-或L-构型，但优选地具有L-构型。特别优选地序 列Z为3、4、5、6或7个连续的赖氨酸残基序列(即Lys3、Lys4、Lys5、 Lys6或Lys7)，且特别地为5或6个连续赖氨酸残基。Z的另一些示例性 序列在WO01/04156中示出。作为替代地，序列Z的C端残基可以是 Cys残基。这可协助化合物的修饰(例如PEG化或与白蛋白的缀合)。在 这些实施方案中，序列Z可以是例如仅一个氨基酸的长度(即Z＝Cys) 或可以是2、3、4、5、6或甚至更多个氨基酸长度。因此另一些氨基酸在 肽X和末端Cys残基间作为间隔区。
肽序列Z与对应的人OXM IP-1部分的序列(其具有序列 Lys-Arg-Asn-Arg-Asn-Asn-Ile-Ala)具有不超过25％的序列同一性。
给定肽或多肽序列相对于另一个多肽序列(例如IP-1)的“氨基酸序 列同一性百分比(％)”作为以下计算：当二者与另一条比对时，特定肽 序列中氨基酸残基与另一条肽的对应序列中对应位置的氨基酸残基同一 的百分比，如若需要的话为了最佳比对引入空位(gap)。可使用 WU-BLAST-2确定同一性百分比值(Altschul等，Methods in Enzymology， 266：460-480(1996))。WU-BLAST-2使用数个检索参数，其中多数设定为 默认值。用以下值设定可调参数：重叠范围＝1、重叠分数＝0.125、字节阈 值(T)＝11。氨基酸序列同一性值的A％通过以下方式确定：将由 WU-BLAST-2确定的匹配同一残基数量除以参比序列残基的总数(通过 WU-BLAST-2引入参比序列以最大化比对分数的空位被忽略)，乘以100。
因此，当Z最佳地与8个氨基酸的IP-1比对时，其有不超过两个氨 基酸与IP-1对应的氨基酸同一。
在一些实施方案中，Z在本发明的化合物中不存在。
肽X的氨基酸残基Y中的一个或更多个侧链与亲脂性取代基Z1或 Z1Z2缀合。因此亲脂性取代基Z1可与氨基酸侧链中的原子直接共价键合， 或者作为替代地可包含通过间隔区Z2与氨基酸侧链缀合的亲脂性部分 Z1。如果期望的话，亲脂性取代基Z1或Z1Z2可另外与氨基酸侧链缀合， 所述氨基酸为肽Z的一部分。
不希望受任何特定理论束缚，认为亲脂性取代基结合血流中的白蛋 白，因此防护本发明的化合物免于酶促降解，并因此提高了所述化合物的 半衰期。当间隔区存在时，其用来提供化合物与亲脂性取代基间的间隔。
亲脂性取代基(或部分，视情况而定)可连接至氨基酸侧链或通过酯、 磺酰基酯、硫酯、酰胺或磺酰胺连接至间隔区。
因此，应了解，优选的亲脂性取代基包括酰基、磺酰基、N原子、O 原子或S原子，其形成酯、磺酰基酯、硫酯、酰胺或磺酰胺的一部分。优 选地，亲脂性取代基中的酰基形成具有氨基酸侧链或间隔区的酰胺或酯的 一部分。
亲脂性取代基(或部分)可以是或可包括具有4至30个C原子的烃 链。优选地其具有至少8或12个C原子且优选地其具有24个或更少的C 原子或者20个或更少的C原子。所述烃链可以是直链或支链的且可以是 饱和或不饱和的。应了解，烃链优选地经形成与氨基酸侧链或间隔区连接 之一部分的部分(例如酰基、磺酰基、N原子、O原子或S原子)取代。 最优选地，烃链经酰基取代，并因此所述烃链可以是烷酰基的一部分，例 如癸酰基(己酰基)、十二烷酰基(月桂酰基)、十四烷酰基(肉豆蔻酰基)、 十六烷酰基(棕榈酰基)、十七烷酰基、十八烷酰基(硬脂酰基)、二十烷 酰基或二十二烷酰基。
因此，Z1或每个Z1可以是或可包含癸酰基(己酰基)、十二烷酰基(月 桂酰基)、十四烷酰基(肉豆蔻酰基)、十六烷酰基(棕榈酰基)、十七烷 酰基、十八烷酰基(硬脂酰基)、二十烷酰基或二十二烷酰基基团。
因此，亲脂性取代基可具有以下所示的式：
A可以是例如酰基、磺酰基、NH、N-烷基、O原子或S原子，优选为酰 基。n为3至29的整数，优选地至少为7或至少为11，且优选地为23或 更少，更优选地为19或更少。
烃链可被进一步取代。例如，其还可经多至三个选自NH2、OH和 COOH的取代基取代。若烃链经进一步取代，则其优选地仅被一个取代 基进一步取代。作为替代或补充，烃链可包括环烷或杂环烷，例如如以下 所示：
优选地，环烷或杂环烷为六元环。更优选地，其为哌啶。
或者，亲脂性取代基可基于环戊菲骨架，其可以是部分或完全不饱和 或饱和的。骨架中的碳原子各自可被Me或OH取代。例如，亲脂性取代 基可以是胆酰基(cholyl)、脱氧胆酰基或石胆酰基。
如上所提到，亲脂性取代基可通过间隔区与氨基酸侧链缀合。存在时， 间隔区连接至亲脂性取代基并与氨基酸侧链相连接。间隔区可通过酯、磺 酰基酯、硫酯、酰胺或磺酰胺独立地与亲脂性取代基相连接并与氨基酸侧 链相连接。因此，其可包括两个独立地选自酰基、磺酰基、N原子、O原 子或S原子的部分。所述间隔区可具有下式：
其中B和D各自独立地选自酰基、磺酰基、NH、N-烷基、O原子或S原 子，优选地选自酰基和NH。优选地，n为1至10的整数、优选地为1 至5。间隔区可任选地被一个或更多个选自C0-6烷基、C0-6烷基胺、C0-6烷基羟基和C0-6烷基羧基的取代基进一步取代。
或者，间隔区可具有两个或更多个上式的重复单元。对于每一重复单 元，B、D及n各自独立地选择。相邻重复单元可由其各自的B及D部分 彼此共价连接。例如，相邻重复单元的B和D部分可一起形成酯、磺酰 基酯、硫酯、酰胺或磺酰胺。每一间隔区末端处的游离B和D单元与如 上所述的氨基酸侧链和亲脂性取代基相连接。
间隔区优选地具有5个或更少、4个或更少或者3个或更少的重复单 元。间隔区最优选地具有两个重复单元或为单个单元。
间隔区(或若其具有重复单元，则为一个或更多个间隔区重复单元) 可以是例如天然或非天然氨基酸。应了解，对于具有官能化侧链的氨基酸， B和/或D可以是氨基酸侧链中的部分。间隔区可以是任何天然或非天然 的氨基酸。例如，间隔区(或若其具有重复单元，则为一个或更多个间隔 区重复单元)可以是Gly、Pro、Ala、Val、Leu、Ile、Met、Cys、Phe、 Tyr、Trp、His、Lys、Arg、Gln、Asn、α-Glu、γ-Glu、Asp、Ser、Thr、 Gaba、Aib、β-Ala、5-氨基戊酰基、6-氨基己酰基、7-氨基庚酰基、8-氨 基辛酰基、9-氨基壬酰基或10-氨基癸酰基。
例如，间隔区可以是选自γ-Glu、Gaba、β-Ala和α-Glu的单个氨基 酸。
亲脂性取代基与Lys、Cys或Orn残基的氨基酸侧链缀合。优选地， 亲脂性取代基与Lys缀合。
亲脂性取代基和间隔区的一个实例在下式中显示：
其为十六烷酰基-异-谷氨酸。
此处，本发明化合物中的Lys残基经由酰胺部分与γ-Glu(间隔区) 共价连接。十六烷酰基(棕榈酰基)经由酰胺部分与γ-Glu间隔区共价连 接。
作为替代或补充，本发明化合物中的一个或更多个氨基酸侧链可与聚 合物部分缀合，例如以提高溶解性和/或体内(例如在血浆中)的半衰期 和/或生物利用度。还已知这样的修饰降低治疗性蛋白质和肽的清除率(例 如肾清除率)。
聚合物部分优选地为水溶的(两亲的或亲水的)、无毒的且呈药学上 惰性的。合适的聚合物部分包括聚乙二醇(PEG)、PEG的均聚物或共聚 物、PEG的单甲基取代的聚合物(mPEG)或聚氧乙烯甘油(POG)。参 见例如Int.J.Hematology 68：1(1998)；Bioconjugate Chem.6：150(1995)； 以及Crit.Rev.Therap.Drug Carrier Sys.9：249(1992)。
另一些合适的聚合物部分包括聚氨基酸，例如聚赖氨酸、聚天冬氨酸 和聚谷氨酸(参见例如Gombotz等，(1995)，Bioconiugate Chem.，第6卷： 332-351；Hudecz等，(1992)，Bioconiugate Chem.，第3卷，49-57；Tsukada 等，(1984)，J.Natl.Cancer Inst.，第73卷：721-729；以及Pratesi等，(1985)， Br.J.Cancer，第52卷：841-848)。
聚合物部分可以是直链或分支的。其可具有500至40,000Da，例如 500至10,000Da、1000至5000Da、10,000至20,000Da或20,000至40,000 Da的分子量。
本发明的化合物可包含两个或更多个这些部分，在此情形下所有这些 部分的总分子量通常将在上文提供的范围内。
聚合物部分可与氨基酸侧链的氨基、羧基或巯基基团偶联(通过共价 连接)。优选的实例为Cys残基的巯基和Lys残基的ε氨基。还可使用Asp 和Glu残基的羧基。
技术人员将充分知晓可用来进行偶联反应的合适技术。例如，带有甲 氧基的PEG部分可使用购自Nektar Therapeutics AL的试剂，通过马来 酰亚胺基连接与Cys巯基偶联。合适化学的详情也参见WO2008/101017 以及上文引用的参考文献。
在另一个方面中，本发明化合物中的一个或更多个氨基酸侧链(例如 在肽X中)与聚合物部分缀合。
在另一个方面中，本发明提供了含有与载剂混合的本文所述之本发明 化合物或者其盐或衍生物的组合物。
术语“其衍生物”指任何一种化合物的衍生物。衍生物包括化合物的 所有化学修饰、所有保守性变体(conservative variant)、所有前药和所 有代谢物。
本发明还提供了本发明的化合物在制备用于治疗下面所述病症之药 物中的用途。
本发明还提供了组合物，其中所述组合物为可药用的组合物，且载剂 为可药用的载剂。
肽合成
本发明的化合物可通过标准合成方法、重组表达系统或任何其他现有 技术方法来制造。因此，胰高血糖素类似物可由多种方式来合成，包括例 如包括以下的方法：
(a)通过固相或液相方法逐步或通过片段组装合成肽，且分离并纯化最终 肽产物；或
(b)在宿主细胞中表达编码肽X-Z(即本发明化合物的肽主链)的核酸构 建体并自宿主细胞培养物回收表达产物；或
(c)影响编码肽X-Z(即本发明化合物的肽主链)之核酸构建体的无细胞体 外表达，并回收表达产物；
或通过方法(a)、(b)和(c)的任意组合来获得肽的片段，随后连接这些片段 以获得肽，并回收肽。通常，在合成后，方法(b)和(c)将通过在肽主 链的适当位置上添加亲脂性取代基补充。在方法(a)中，可在合成期间 直接整合衍生出的氨基酸，或可随后添加亲脂性取代基。
优选地通过固相或液相肽合成手段来合成本发明的类似物。在本文 中，可参考WO98/11125和Synthetic Peptides(第2版)中的Fields，G.B. 等，2002，“Principles and Practice of Solid-Phase Peptide Synthesis”等， 以及本文中的实施例。
对于重组表达，本发明的核酸片段通常将插入合适的载体以形成带有 本发明核酸片段的克隆或表达载体；这些新型的载体也是本发明的一部 分。取决于应用的目的和类型，所述载体可呈现质粒、噬菌体、黏粒、微 染色体(mini-chromosome)或病毒的形式，而且仅在某些细胞中瞬时表 达的裸露DNA是重要的载体。本发明优选的克隆和表达载体(质粒载体) 能够自动复制，因此能够有用于接下来克隆的高水平表达或高水平复制之 目的的高拷贝量。
概述地说，表达载体包含以5’→3’方向并有效连接的以下特征：用于 驱动本发明之核酸片段表达的启动子，任选地编码使得能够分泌(至胞外 相或合适的话进入周质)之前导肽的核酸序列，编码本发明肽的核酸片段 以及任选地编码终止子的核酸序列。它们可包含额外的特征，例如可选择 的标志物和复制起点。当用表达载体在生产菌株(producer strain)或细 胞系中操作时，可优选所述载体能够整合到宿主细胞基因组中。技术人员 非常熟悉合适的载体，且能够根据他们的具体需要设计载体。
使用本发明的载体来转化宿主细胞以产生本发明的化合物。这些经转 化的细胞(其也是本发明的一部分)可以是用于繁殖(propagation)本 发明核酸片段和载体的培养的细胞或细胞系，或用于本发明肽之重组生产 的培养的细胞或细胞系。
本发明优选的经转化细胞为微生物，例如细菌[例如物种埃希氏菌 (Escherichia)(例如大肠杆菌(E.coli))、芽孢杆菌属(Bacillus)(例如 枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis))、沙门菌属(Salmonella)或分枝杆菌 属(Mycobacterium)(优选非病原的，例如牛分枝杆菌BCG(M.bovis BCG))]、酵母(例如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和巴斯德毕 赤酵母(Pichia pastoris))以及原生动物。或者，经转化的细胞可来自于 多细胞生物体，即，其可以是真菌细胞、昆虫细胞、海藻细胞、植物细胞 或动物细胞(例如哺乳动物细胞)。为了克隆和/或优化表达，优选经转化 的细胞能够复制本发明的核酸片段。表达核片段的细胞是本发明可用的实 施方案；它们可用于本发明肽之小规模或大规模的制备。
当通过经转化的细胞生产本发明的肽时，虽然远不是必不可少的，其 对于将表达产物分泌到培养基中是方便的。
将了解X-Z的重组表达仅当X-Z中的每个残基为20个自然氨基酸之 一时是适当的，所述氨基酸可通过常规核酸翻译整合到蛋白质中。然而， 如果期望的话，可使用已知的经修饰翻译系统，其可引入非常规的氨基酸。
下面说明了本发明化合物的一种示例性合成途径。本领域技术人员将 能够如所需的调整示出的程序，为了优化所选择的任何化合物的过程。
效力
可使用相关化合物与GLP-1受体或胰高血糖素(Glu)受体的结合作 为激动剂活性的指标，但是一般优选使用测量由化合物与相关受体结合引 起之细胞内信号传导的生物测定。例如，通过胰高血糖素激动剂活化胰高 血糖素受体将刺激细胞的环AMP(cyclic AMP，cAMP)形成。类似地， 通过GLP-1激动剂活化GLP-1受体将刺激细胞的cAMP形成。因此，可 使用表达这两种受体中的一种的合适细胞中cAMP的产生来监测相关受 体的活性。使用合适的一对细胞类型(其各自表达一种受体而不表达另一 种)可因此用于确定对两种类型受体的激动剂活性。
技术人员将知晓合适的测定形式，并且下面提供了实例。GLP-1受 体和/或胰高血糖素受体可具有如实例中所述的受体序列。例如，可使用 具有初级登录号(primary accession number)GI：4503947的人胰高血糖 素受体(胰高血糖素-R)和/或初级登录号GI：166795283的人胰高血糖素 样肽1受体(GLP-1R)进行测定。(其中提到了前体蛋白质的序列，并 且当然应理解的是，测定可利用缺少信号序列的成熟蛋白质)。
可使用EC50值作为对给定受体的激动剂效力的数值量度。EC50值是 在特定测定中实现化合物最大活性一半所需化合物浓度的量度。因此，例 如，在特定测定中，可认为EC50[GLP-1]比胰高血糖素的EC50[GLP-1]低 的化合物具有比胰高血糖素更高的GLP-1受体激动剂效力。
在本说明书中描述的化合物通常是Glu-GLP-1双重激动剂，因为通 过观察确定它们能够刺激胰高血糖素受体和GLP-1受体二者的cAMP形 成。可在独立测定中测量对每种受体的刺激，随后彼此进行比较。
通过比较给定化合物的胰高血糖素受体的EC50值(EC50[胰高血糖素 -R])和GLP-1受体的EC50值(EC50[GLP-1R])，可如下得到所述化合 物的相对胰高血糖素选择性(％)：
相对胰高血糖素-R选择性[化合物]＝(1/EC50[胰高血糖素-R])×100/ (1/EC50[胰高血糖素-R]+1/EC50[GLP-1R])
可类似地得到相对GLP-1R选择性：
相对GLP-1R选择性[化合物]＝(1/EC50[GLP-1R])×100/(1/EC50[胰高 血糖素-R]+1/EC50[GLP-1R])
化合物的相对选择性允许将其对GLP-1受体或胰高血糖素受体的作 用直接与其对其他受体的作用进行比较。例如，化合物的相对GLP-1选 择性越高，所述化合物对GLP-1受体(与对胰高血糖素受体相比)越有 效。
使用下文所述测定，我们已经发现人胰高血糖素的相对GLP-1选择 性为大约5％。
本发明的化合物具有比人胰高血糖素更高的相对GLP-1R选择性， 对于特定水平的胰高血糖素-R激动剂活性，所述化合物将表现出比胰高 血糖素更高水平的GLP-1R激动剂活性(即，对GLP-1受体更高的效力)。 应理解的是，特定化合物对胰高血糖素受体和GLP-1受体的绝对效力可 能大于、小于或近似等于天然人胰高血糖素的效力，只要实现合适的相对 GLP-1R选择性即可。
不过，本发明的化合物可具有比人胰高血糖素低的EC50[GLP-1R]。 所述化合物可具有比胰高血糖素低的EC50[GLP-1R]，同时保持EC50[胰 高血糖素-R]不高于人胰高血糖素的10倍，不高于人胰高血糖素的5倍， 或不高于人胰高血糖素的2倍。
本发明的化合物可具有小于人胰高血糖素2倍的EC50[胰高血糖素 -R]。所述化合物可具有小于人胰高血糖素2倍的EC50[胰高血糖素-R]和 小于人胰高血糖素一半、小于人胰高血糖素五分之一、或小于人胰高血糖 素十分之一的EC50[GLP-1R]。
化合物的相对GLP-1R选择性可以是5％至95％。例如，化合物可 具有5-20％、10-30％、20-50％、30-70％、或50-80％的相对选择性；或 30-50％、40-60％、50-70％或75-95％的相对选择性。
本发明的化合物还可具有对另一些B类GPCR受体的作用，例如但 不限于降钙素基因相关肽1(CGRP1)、促肾上腺皮质素释放因子l和2 (CRF1和CRF2)、胃抑多肽(gastric inhibitory polypeptide，GIP)、胰 高血糖素样肽1和2(GLP-1和GLP-2)、胰高血糖素(GCGR)、胰泌素、 促性腺素释放激素(GnRH)、甲状旁腺激素1和2(PTH1和PTH2)、 血管活性肠肽(VPAC1和VPAC2)。
治疗用途
本发明的化合物可以是特别地是代谢疾病(包括肥胖、血脂异常和糖 尿病)提供具吸引力的治疗选择。
代谢综合征的特征在于在一个人中的一组代谢风险因素。它们包括腹 部肥胖(腹部内部器官周围过多的脂肪组织)、致动脉粥样硬化的血脂异 常(血脂病症，包括高甘油三酯水平、低HDL胆固醇和/或高LDL胆固 醇，其促进动脉壁中的斑积聚(plaque build-up))、血压升高(高血压)、 胰岛素抗性和葡萄糖耐量、血栓前状态(prothrombotic state)(例如血液 中的高血纤维蛋白原或纤维蛋白溶酶原活化因子抑制剂-1)和促炎性状态 (例如血液中C-反应性蛋白升高)。
患有代谢综合征的个体有提高的冠心病和其他与另一些动脉硬化表 现(例如卒中和外周动脉疾病)相关疾病的风险。对于此综合征主要的潜 在风险因素似乎是腹部肥胖。
糖尿病包括一组代谢疾病，其特征为由胰岛素分泌、胰岛素作用或二 者的缺陷所致的高血糖。糖尿病的急性体征包括尿液产生过多、随之发生 的代偿性口渴和流体摄入提高、视力模糊、不明原因的体重减轻、嗜睡及 能量代谢变化。糖尿病的慢性高血糖与多种器官(特别是眼睛、肾、神经、 心脏和血管)的长期损伤、功能障碍及衰竭有关。糖尿病可基于发病特征 分为1型糖尿病、2型糖尿病和妊娠糖尿病。
1型糖尿病占所有糖尿病病例的5-10％且由分泌胰岛素之胰β细胞的 自身免疫破坏引起。
2型糖尿病占糖尿病病例的90-95％且为代谢病症复杂集合的结果。2 型糖尿病是内源性胰岛素产生变得不足以将血浆葡萄糖水平维持在诊断 阈值以下的结果。
妊娠糖尿病指在怀孕期间鉴定的任何程度的葡萄糖不耐受。
前驱糖尿病包括削弱的空腹葡萄糖和削弱的葡萄糖耐量，且指在血糖 水平升高但低于关于临床诊断糖尿病所确立的水平时发生的那些状态。
大部分患有2型糖尿病及前驱糖尿病的人由于另外代谢风险因素的 高普遍性而存在发病率及死亡率提高的风险，这些代谢风险因素包括腹部 肥胖(腹部内部器官周围过多的脂肪组织)、致动脉粥样硬化的血脂异常 (血脂病症，包括高甘油三酯水平、低HDL胆固醇和/或高LDL胆固醇， 其促进动脉壁中的斑积聚)、血压升高(高血压)、血栓前状态(例如血液 中的高血纤维蛋白原或纤维蛋白溶酶原活化因子抑制剂-1)和促炎性状态 (例如血液中C-反应性蛋白升高)。
相反地，肥胖使得发生前驱糖尿病、2型糖尿病、以及例如某些类型 的癌症、阻塞性睡眠呼吸暂停和胆囊疾病的风险提高。
血脂异常与心血管疾病的风险提高有关。由于血浆高密度脂蛋白 (High Density Lipoprotein，HDL)浓度与动脉粥样硬化疾病风险之间存 在负相关性，因此HDL具有临床重要性。动脉粥样硬化斑中储存的大部 分胆固醇源自低密度脂蛋白(Low Density Lipoprotein，LDL)，因此LDL 的浓度升高与动脉粥样硬化密切相关。HDL/LDL比值是特别用于评估动 脉粥样硬化和冠状动脉粥样硬化之临床风险的指标。
不希望受任何特定理论束缚，认为本发明的化合物作为GluGLP-1 双重激动剂发挥作用。所述双重激动剂将胰高血糖素对脂肪代谢的作用与 GLP-1对食物摄取的作用组合。因此，它们可以以协同方式作用来加速 消除过量脂肪沉积并诱发可持续的体重减轻。描述的某些化合物还可具有 对葡萄糖控制直接的作用，而不依赖于对体重的任何作用。
双重GLuGLP-1激动剂的协同作用还可造成心血管风险因素(例如 高胆固醇和LDL)的降低，其可完全不依赖于其对体重的作用。
因此，本发明的化合物可用作用于防止体重增长、促进体重减轻、降 低体重过重或治疗肥胖(例如通过控制食欲、进食、食物摄取、热量摄取 和/或能量消耗)，包括病态肥胖以及由体重过重引起或以其为特征的相关 疾病和健康状况的药剂。这些包括但不限于肥胖、病态肥胖、术前病态肥 胖、肥胖相关炎症、肥胖相关胆囊疾病和肥胖诱发的睡眠呼吸暂停。本发 明的化合物还可用于治疗代谢综合征、高血压、II型糖尿病、致动脉粥样 化的血脂异常、动脉粥样硬化、动脉硬化、冠心病、外周动脉疾病、卒中 和微血管疾病。这些都是与肥胖相关的病症。然而，本发明的化合物对这 些病症的作用可经由对体重的作用而整体或部分介导，或可与其相独立。 此外，通过它们对葡萄糖控制的直接作用，本发明的化合物可用于治疗任 何以上的病症以及其他不一定由体重过重引起或与其相关的病症(包括I 型糖尿病和妊娠糖尿病)。
本发明的化合物还可用作用于降低循环LDL水平和/或提高 HDL/LDL比值的药剂。
组合治疗
如上所述，应了解下文中提及本发明的化合物还延伸至其可药用盐或 溶剂合物以及包含一种以上不同本发明化合物的组合物。
本发明的化合物可作为组合治疗的一部分与用于治疗肥胖、高血压、 血脂异常或糖尿病的药剂一起施用。
在这些情况下，两种活性剂可一起或分开给予，且作为相同药物制剂 中的一部分或作为单独制剂。
因此，化合物或其盐还可与抗肥胖剂组合使用，其包括但不限于胰高 血糖素样肽受体1激动剂、肽YY或其类似物、大麻素受体1拮抗剂、脂 肪酶抑制剂、黑皮质素受体4激动剂或黑色素聚集激素受体1拮抗剂。
本发明的化合物或其盐可与抗高血压剂组合使用，其包括但不限于血 管紧张素转化酶抑制剂、血管紧张素II受体阻断剂、利尿剂、β-阻断剂 或钙通道阻断剂。
本发明的化合物或其盐可与抗血脂异常剂组合使用，其包括但不限于 他汀类、贝特类、烟酸类和/或胆固醇吸收抑制剂。
此外，本发明的化合物或其盐可与抗糖尿病剂组合使用，其包括但不 限于二甲双胍、磺酰脲类、格列奈类、DPP-IV抑制剂、格列酮类、不同 的GLP-1激动剂或胰岛素。在一个优选的实施方案中，化合物或其盐与 胰岛素、DPP-IV抑制剂、磺酰脲类或二甲双胍(特别是磺酰脲类或二甲 双胍)组合使用，用于实现充分的血糖控制。在一个甚至更优选的实施方 案中，化合物或其盐与胰岛素或胰岛素类似物组合使用，用于实现充分的 血糖控制。胰岛素类似物的实例包括但不限于Lantus、Novorapid、 Humalog、Novomix和Actraphane HM。
药物组合物
本发明的化合物或其盐可配制成准备用于储存或施用的药物组合物， 其通常在可药用载剂中包含治疗有效量的本发明的化合物或其盐。
这些组合物包括全部固体形式的那些以及全部糊状(pasteous)或液 体形式的那些，其可根据特定的施用途径和/或患者的需要选择并最优化。 这些形式本身为本领域技术人员已知。
本发明的化合物的治疗有效量将根据施用途径、被治疗的哺乳动物类 型和特定哺乳动物身体特性进行考虑。决定该量的这些因素及其关系是医 学领域技术人员公知的。可调节该量和施用方法以达到最佳效力，并且可 取决于医药领域技术人员公知的因素，例如体重、饮食、合并用药 (concurrent medication)及其他因素。可通过本发明得到的结果指导最 适合人用的剂量大小和给药方案，并且可在适当设计的临床试验中验证。
可通过常规手段确定有效剂量和治疗方案，在实验动物中从低剂量开 始，然后提高剂量的同时监测效果，并且还系统地改变给药方案。在决定 给定对象的最佳剂量时，临床医生可考虑多种因素。这样的考虑是本领域 技术人员已知的。
术语“可药用载剂”包括任何标准药用载剂。用于治疗用途的可药用 载剂是药物领域中公知的，描述于例如Remington′s Pharmaceutical Sciences，Mack Publishing Co.(A.R.Gennaro edit.1985)中。例如，可使 用无菌盐水和微酸性或生理pH的磷酸盐缓冲盐水。pH缓冲剂可以是磷 酸盐、柠檬酸盐、醋酸盐、三(羟甲基)氨基甲烷(TRIS)、N-三(羟甲基) 甲基-3-氨基丙磺酸(TAPS)、碳酸氢铵、二乙醇胺、组氨酸(其是优选 的缓冲剂)、精氨酸、赖氨酸、或醋酸盐，或者其混合物。所述术语还涵 盖美国药典中所列举的任何用于动物(包括人)的试剂。
术语“可药用盐”指任一化合物的盐。盐包括可药用盐，例如酸加成 盐和碱式盐。酸加成盐的实例包括盐酸盐、柠檬酸盐和醋酸盐。碱式盐的 实例其中包括阳离子选自碱金属(例如钠和钾)、碱土金属(例如钙)和 铵离子+N(R3)3(R4)的盐，其中R3和R4独立地表示任选取代的C1-6烷基、 任选取代的C2-6烯基、任选取代的芳基、或任选取代的杂芳基。可药用盐 的另一些实例描述于″Remington′s Pharmaceutical Sciences″，第17版. Ed.Alfonso R.Gennaro(Ed.)，Mark Publishing Company，Easton，PA， U.S.A.，1985和更新的版本，以及Encyclopaedia of Pharmaceutical Technology。
“治疗”是得到有益的或期望的临床结果的方法。对于本发明的目的 而言，有益的或期望的临床结果包括但不限于缓和症状、降低疾病程度、 稳定(即，未恶化)疾病状态、延迟或减慢疾病的进展、改善或减轻疾病 状态和可检测或不可检测的缓解(无论部分地或全部地)。“治疗”还可意 指与如果不接受治疗时预期的生存相比延长生存。“治疗”是旨在防止病 症发展或改变病症的病理状况而进行的干预。因此，“治疗”指治疗性治 疗和预防性措施二者。需要治疗的对象包括已经患有病症的那些以及待预 防病症的那些。
药物组合物可以是单位剂型。在这样的形式中，所述组合物被分成包 含合适量的活性组分的单位剂量。单位剂型可以是包装的制剂，所述包装 包括离散量的制剂，例如在小瓶或安瓿中包装的片剂、胶囊剂和散剂。单 位剂型本身还可以是胶囊剂、扁囊剂(cachet)或片剂，或者其可以是合 适数量的任意这些包装的形式。其可以以单剂量注射形式提供，例如笔剂 (pen)的形式。在某些实施方案中，为了使用，包装的形式包含标签或 与说明书插页。组合物可配制成用于任何合适的施用途径和方式。可药用 载剂或稀释剂包括用于配制合适的经口、经直肠、经鼻、局部(包括口腔 和舌下)、阴道或胃肠外(包括皮下、肌内、静脉内、皮内和透皮)施用 的那些。所述制剂可常规地呈现为单位剂型，并且可通过药学领域中任何 公知的方法制备。
皮下或透皮施用方式可特别适合于本文中描述的化合物。
本发明的组合物还可通过例如共价、疏水和静电相互作用混合或附接 在药物载剂、药物递送系统和高级药物递送系统上以进一步提高化合物的 稳定性、提高生物利用度、提高溶解度、降低副作用、实现本领域技术人 员公知的时间治疗(chronotherapy)和提高患者顺从性或其任意组合。 载剂、药物递送系统和高级药物递送系统的实例包括但不限于：聚合物， 例如纤维素及衍生物；多糖，例如葡聚糖及衍生物、淀粉及衍生物；聚(乙 烯醇)，丙烯酸及甲基丙烯酸聚合物，聚乳酸和聚乙醇酸及其嵌段共聚物， 聚乙二醇；载体蛋白质，例如白蛋白；凝胶，如热凝胶系统(thermogelling system)，例如本领域技术人员公知的嵌段共聚系统；胶束(micelle)、脂 质体、微球、纳米颗粒、液晶及其分散体、脂质-水系统中相特性(phase behavior)领域技术人员公知的L2相及其分散体、聚合物胶束、复合乳 剂(multiple emulsion)、自乳化、自微乳化、环糊精及其衍生物、以及树 状聚合物(dendrimer)。
方法
胰高血糖素类似物的一般合成
使用在聚苯乙烯树脂(TentaGel S Ram)上于NMP中的标准Fmoc 策略在微波辅助合成器上进行固相肽合成(Solid phase peptide synthesis， SPPS)。使用HATU与作为碱的DIPEA一起作为偶联试剂。将哌啶(在 NMP中20％)用于去保护。适用时，使用假脯氨酸：Fmoc-Phe-Thr(.ψ. Me，Me Pro)-OH和Fmoc-Asp-Ser(.ψ.，Me，Me Pro)-OH(购自 NovaBiochem)。
采用的缩写如下：
ivDde：1-(4，4-二甲基-2，6-二氧代亚环己基)3-甲基-丁基
Dde：1-(4，4-二甲基-2，6-二氧代亚环己基)-乙基
DCM：二氯甲烷
DMF：N，N-二甲基甲酰胺
DIPEA：二异丙基乙胺
EtOH：乙醇
Et2O：乙醚
HATU：N-[(二甲氨基)-1H-1，2，3-三唑[4，5-b]吡啶-1-基亚甲基]-N-甲基甲铵 六氟磷酸盐/酯N-氧化物
MeCN：乙腈
NMP：N-甲基吡咯烷酮
TFA：三氟乙酸
TIS：三异丙基硅烷
切割：
通过用TFA/TIS/水以95/2.5/2.5％(v/v)在室温(r.t.)下处理2小时使粗 制肽自树脂切割。对于在序列中有甲硫氨酸的肽，使用TFA/EDT95/5％ (v/v)的混合物。在减压下移除大部分TFA，并使粗制肽沉淀且用乙醚 洗涤，并允许在环境温度下干燥至恒重。
酰化的胰高血糖素类似物的一般合成
对于胰高血糖素类似物的一般合成，如上所述合成肽主链，只是其在 赖氨酸残基的侧链上酰化而肽仍连接在树脂且侧链基团被完全保护(除了 待被酰化的赖氨酸上的ε胺)。待酰化的赖氨酸与Fmoc-Lys(ivDde)-OH 或Fmoc-Lys(Dde)-OH的使用整合。使用NMP中的Boc2O用Boc基 团保护肽的N端。当肽仍连接在树脂上时，使用NMP中5％的水合肼选 择性地切割ivDde保护基团。然后，未保护的赖氨酸侧链首先与的间隔区 氨基酸偶联为如Fmoc-Glu-Otbu，其用哌啶去保护并使用如上所述的标准 肽偶联方法用脂肪酸酰化。或者，在N端的组氨酸可从开始整合为 Boc-His(Boc)-OH。如上所述进行从树脂的切割和纯化。
一种替代的策略是使用Fmoc-Lys(十六烷酰基-异Glu(tBu))-OH 来容易地整合脂肪酸和作为标准合成程序一部分的接头。
表达人胰高血糖素受体和GLP-1受体之细胞系的产生
分别从cDNA克隆BC104854(MGC：132514/IMAGE：8143857)或 BC112126(MGC：138331/IMAGE：8327594)中克隆编码人胰高血糖素受 体(胰高血糖素-R)(初级登录号P47871)或人胰高血糖素样肽1受体 (GLP-1R)(初级登录号P43220)的cDNA。通过使用编码用于亚克隆 之末端限制性位点的引物的PCR扩增编码胰高血糖素-R或GLP-1-R的 DNA。5′末端引物还编码近似Kozak共有序列以确保高效的翻译。通过 DNA测序确认编码胰高血糖素-R或GLP-1-R之DNA的保真度。将编码 胰高血糖素-R或GLP-1-R的PCR产物亚克隆到包含新霉素(G418)抗 性标记的哺乳动物表达载体中。
通过标准磷酸钙转染法将编码胰高血糖素-R或GLP-1-R的哺乳动物 表达载体转染到HEK293细胞中。转染48小时后，接种细胞以有限稀释 克隆，并且用1mg/ml G418在培养基中选择。三周后，挑选表达胰高血 糖素-R或GLP-1-R的细胞的12个存活克隆，繁殖并且如下文所述在胰 高血糖素-R和GLP-1-R效力测定中进行测试。选择一个表达胰高血糖素 -R的克隆和一个表达GLP-1-R的克隆用于化合物分析(compound profiling)。
胰高血糖素受体和GLP-1受体效力测定
将表达人胰高血糖素-R或人GLP-1-R的HEK293细胞以每孔40,000 个细胞接种在用0.01％聚L-赖氨酸包被的96孔微量滴定板中并且在100 μl生长培养基的培养物中生长1天。在分析的当天，除去生长培养基并且 用200μl Tyrode缓冲液洗涤一次。将细胞在包含升高浓度的测试肽、100 μM IBMX和6mM葡萄糖的100μl Tyrode缓冲液中于37℃孵育至多15 分钟。通过添加25μl0.5M HCl使反应停止，并且在冰上孵育60分钟。 使用获自Perkin-Elmer的cAMP试剂盒根据生产厂商的说明 估测cAMP含量。通过计算机辅助曲线拟合估算EC50以及与参比化合物 (胰高血糖素和GLP-1)相比的相对效力。
实施例1：化合物1的合成
H-H-Aib-QGTFTSDYSKYLD-K(十六烷酰基-异Glu)-RRAKDFIEWLLSA-NH2(化合物1)
在CEM Liberty肽合成器上使用TentaGel S Ram树脂(1.04g；0.25 mmol/g)和如上所述的使用Fmoc-Phe-Thr(ψ-Me，Me-Pro)-OH的Fmoc 化学合成所述肽。且使用396mg溶解于DMF/DCM(2∶1，8ml)的 Fmoc-Lys(十六烷酰基-异Glu(tBu))-OH(Corden Pharma)与HATU (190mg)人工偶联。将所述溶液添加至树脂，然后添加DIEA(86μl)。 温和地摇晃树脂4小时，然后用DMF(8×2分钟)洗涤。
所述肽如上所述地从树脂切割。粗制肽在Gemini-NX柱(5×25cm； 10μm；C18)上用缓冲液A(0.1％TFA；水溶液)和缓冲液B(0.1％TFA； 90％MeCN；水溶液)混合物的35ml/分钟流进行纯化。用20％至70％ 缓冲液B的线性梯度洗脱产物47分钟，并用级分收集器收集级分(9ml)。 通过分析型HPLC和MS分析相关级分，汇集并冻干以产生白色粉末(88 mg；95％)。如由MS所确定，质量为3826.03Da(计算值3826.05Da)。
实施例2：胰高血糖素受体和GLP-1受体的活性
表1.在表达GLP-1受体或胰高血糖素受体的HEK293细胞中cAMP 之产生的EC50值