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1、(10)申请公布号 CN 103636918 A (43)申请公布日 2014.03.19 CN 103636918 A (21)申请号 201310677057.0 (22)申请日 2013.12.13 A23J 3/16(2006.01) (71)申请人 东北农业大学 地址 150030 黑龙江省哈尔滨市香坊区木材 街 59 号 (72)发明人 江连洲 李杨 齐宝坤 冯红霞 于殿宇 王中江 许晶 隋晓楠 赵城彬 (54) 发明名称 一种富含亚油酸的改性分离蛋白制备方法 (57) 摘要 一种富含亚油酸的改性分离蛋白制备方法 属于大豆蛋白加工技术， 该方法包括以下步骤 ： （1） 将亚油酸进行。
2、一系列活化处理得到活化的亚 油酸， 将活化的亚油酸溶解在四氢呋喃溶液中形 成活化的亚油酸溶液 ；（2） 将大豆分离蛋白溶解 在 NaHCO3溶液中形成蛋白溶液 ；（3） 将亚油酸溶 液与蛋白溶液混合后进行水浴加热并不断搅拌 ； （4） 向水浴加热后的混合体系中加入甘氨酸， 然 后进行离心分离、 真空干燥即得改性分离蛋白 ； 本发明方法利用亚油酸酰化改性大豆分离蛋白， 酰化程度高达 61.47%， 改性后的蛋白中富含亚油 酸， 营养价值高， 并且具有高乳化性， 乳化活性为 74.21m2/g， 是未改性蛋白乳化活性的 1.21 倍。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 6 页 附。
3、图 3 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书6页 附图3页 (10)申请公布号 CN 103636918 A CN 103636918 A 1/1 页 2 1. 一种富含亚油酸的改性分离蛋白制备方法， 其特征在于该方法包括以下步骤 ：（1） 将亚油酸与 N- 羟基琥珀酰亚胺脂 （NHS） 等比例混合后加入含有二环己基碳二亚胺 （DCC） 的 四氢呋喃溶液， 然后置于 25下过夜， 再进行过滤处理得滤液， 将滤液真空干燥得干燥物， 将干燥物溶解在乙酸乙酯中， 再用 10%NaCl 溶液洗涤， 然后放入干燥塔中干燥， 干燥后进行 真空蒸发结晶得到活。
4、化的亚油酸， 将活化的亚油酸溶解在四氢呋喃溶液中形成活化的亚油 酸溶液， 所述的亚油酸溶液浓度为 4mg/mL ；（2） 将大豆分离蛋白溶解在 NaHCO3溶液中形成 蛋白溶液， 所述的蛋白溶液浓度为 4mg/mL ；（3） 将亚油酸溶液与蛋白溶液混合得混合体系， 将混合体系置于 25下进行水浴加热， 并不断搅拌， 所述的亚油酸与蛋白质量比为 1-4:1， 混合体系的 pH 为 7-10， 水浴加热时间为 3-7h ；（4） 向水浴加热后的混合体系中加入甘氨 酸， 然后在温度为 4、 离心力为 10000g 下离心分离 20min 得上清液， 将上清液真空干燥即 得改性分离蛋白。 2. 根据权。
5、利要求 1 所述的一种富含亚油酸的改性分离蛋白制备方法， 其特征在于所述 的水浴加热优选参数为 ： 亚油酸与蛋白质量比 2.37:1， 混合体系的 pH 9.3， 水浴加热时间 5.62h。 权 利 要 求 书 CN 103636918 A 2 1/6 页 3 一种富含亚油酸的改性分离蛋白制备方法 技术领域 0001 本发明属于大豆蛋白加工技术领域， 主要涉及一种富含亚油酸的改性分离蛋白制 备方法。 背景技术 0002 众所周知， 大豆蛋白具有很好的营养功能， 大豆蛋白质含量高达 38%， 尤其大豆蛋 白质中富含的氨基酸与牛奶相近， 除蛋氨酸略低外， 其余必需氨基酸含量均较丰富， 是植物 性的。
6、完全蛋白质， 大豆蛋白几十年来已被用来作为亚洲国家的营养源， 目前世界上生产的 含有大豆蛋白的食品已超过了 12000 多种。由于大豆分离蛋白 （SPI） 有乳化性、 吸油性、 吸 水性与保水性、 凝胶性和起泡性等功能特性， 因此大豆分离蛋白质被广泛应用于焙烤食品、 乳品、 肉制品及肉的代用品等食品工业领域， 也使 SPI 功能特性的改善成为目前该领域的 研究热点大豆蛋白的保健功效近年来受到众多科研机构的研究， 并在全世界范围内受到广 泛重视。 但是， 我国的食品企业并没有充分利用大豆蛋白所含有的功能特性， 目前中国大豆 分离蛋白企业存在的问题主要是新产品开发滞后， 品种较为单一， 应用领域窄。
7、， 产品附加值 低 ； 产品质量远低于国际水平， 尽管价格较低， 但销量仍然无法提高， 竞争能力偏弱。为此， 研究大豆蛋白的功能性质及改性就显得十分重要。在过去的几十年里， 不同的改性技术已 被用来改变蛋白质结构， 改变它的物理性质和化学性质， 因此影响其结构的功能特性。 0003 到目前为止， 国内外对植物蛋白改性的研究深入而广泛， 但多集中在对亲水性质 的改善上， 对疏水性的改善研究相对较少， 而疏水性是决定蛋白质表面活性的主要因素之 一， 疏水改性是形成表面活性蛋白的主要途径之一。蛋白质的脂酰化改性就是用化学法或 酶法使不同长度的脂肪酸 (C6-C18) 结合到亲水性蛋白质分子上， 提高。
8、蛋白质分子的表面 疏水性， 从而改善其表面活性， 脂酰化是蛋白质最有效的疏水改性之一。 0004 亚油酸被称为是一种必需脂肪酸， 必须从食物中获得， 自身无法合成或合成很少。 医药上亚油酸具有降低血脂、 软化血管、 降低血压、 促进微循环的作用， 可预防或减少心血 管病的发病率， 特别是对高血压、 高血脂、 心绞痛、 冠心病、 动脉粥样硬化、 老年性肥胖症等 的防治极为有利， 能起到防止人体血清胆固醇在血管壁的沉积， 有 “血管清道夫” 的美誉， 具 有防治动脉粥样硬化及心血管疾病的保健效果。 0005 目前人们对多种功能性食品或成分的要求逐渐提高， 本发明从增加营养成并同时 提高大豆蛋白的两。
9、亲性质方面考虑， 用化学方法使亚油酸与亲水的大豆蛋白在碱的催化下 共价交联， 制备一种富含亚油酸的大豆分离蛋白， 同时改性后的蛋白乳化性显著提高， 为大 豆蛋白作为食品配料和功能性食品配方的使用开拓了更好的前景。因此， 对于开发一种富 含亚油酸的大豆分离蛋白的制备， 该研究意义重大。 发明内容 0006 本发明的目的是通过一系列化学手段使亚油酸与大豆分离蛋白交联， 开发一种富 含亚油酸的高营养价值蛋白产品， 不但使蛋白里富含亚油酸同时改善蛋白功能性， 改性后 说 明 书 CN 103636918 A 3 2/6 页 4 的蛋白营养价值高， 乳化性好。 0007 本发明所要解决的技术问题是通过以。
10、下技术方案来实现的 ： 一种富含亚油酸的改性分离蛋白制备方法， 该方法包括以下步骤 ：（1）将亚油酸与 N- 羟基琥珀酰亚胺脂 （NHS） 等比例混合后加入含有二环己基碳二亚胺 （DCC） 的四氢呋喃溶 液， 然后置于 25下过夜， 再进行过滤处理得滤液， 将滤液真空干燥得干燥物， 将干燥物溶 解在乙酸乙酯中， 再用 10%NaCl 溶液洗涤， 然后放入干燥塔中干燥， 干燥后进行真空蒸发结 晶得到活化的亚油酸， 将活化的亚油酸溶解在四氢呋喃溶液中形成活化的亚油酸溶液， 所 述的亚油酸溶液浓度为 4mg/mL ；（2） 将大豆分离蛋白溶解在 NaHCO3溶液中形成蛋白溶液， 所述的蛋白溶液浓度为。
11、 4mg/mL ；（3） 将亚油酸溶液与蛋白溶液混合得混合体系， 将混合体 系置于 25下进行水浴加热， 并不断搅拌， 所述的亚油酸与蛋白质量比为 1-4:1， 混合体系 的 pH 为 7-10， 水浴加热时间为 3-7h ；（4） 向水浴加热后的混合体系中加入甘氨酸， 然后在 温度为4、 离心力为10000g下离心分离20min得上清液， 将上清液真空干燥即得改性分离 蛋白。 0008 所述的水浴加热优选参数为 ： 亚油酸与蛋白质量比 2.37:1， 混合体系的 pH 9.3， 水浴加热时间 5.62h。 0009 本发明是通过使亚油酸与分离蛋白结合， 即提高蛋白营养价值同时提高了蛋白乳 化。
12、性， 为大豆蛋白的加工和应用开拓了更好的前景， 具有设计新颖合理、 蛋白营养价值高、 蛋白乳化性好等特点。 附图说明 0010 图 1 本发明方法的工艺路线图 图 2 亚油酸与蛋白质量比对酰化程度的影响 图 3 体系 pH 对酰化程度的影响 图 4 加热时间对酰化程度的影响 图 5 加热时间与亚油酸与蛋白质量比交互对酰化程度的响应面 图 6 体系 pH 与加热时间交互对酰化程度的响应面。 具体实施方式 0011 下面结合附图对本发明具体实施例进行详细描述 ： 一种富含亚油酸的改性分离蛋白制备方法， 该方法包括以下步骤 ：（1）将亚油酸与 N- 羟基琥珀酰亚胺脂 （NHS） 等比例混合后加入含有。
13、二环己基碳二亚胺 （DCC） 的四氢呋喃溶 液， 然后置于 25下过夜， 再进行过滤处理得滤液， 将滤液真空干燥得干燥物， 将干燥物溶 解在乙酸乙酯中， 再用 10%NaCl 溶液洗涤， 然后放入干燥塔中干燥， 干燥后进行真空蒸发结 晶得到活化的亚油酸， 将活化的亚油酸溶解在四氢呋喃溶液中形成活化的亚油酸溶液， 所 述的亚油酸溶液浓度为 4mg/mL ；（2） 将大豆分离蛋白溶解在 NaHCO3溶液中形成蛋白溶液， 所述的蛋白溶液浓度为 4mg/mL ；（3） 将亚油酸溶液与蛋白溶液混合得混合体系， 将混合体 系置于 25下进行水浴加热， 并不断搅拌， 所述的亚油酸与蛋白质量比为 1-4:1，。
14、 混合体系 的 pH 为 7-10， 水浴加热时间为 3-7h ；（4） 向水浴加热后的混合体系中加入甘氨酸， 然后在 温度为4、 离心力为10000g下离心分离20min得上清液， 将上清液真空干燥即得改性分离 说 明 书 CN 103636918 A 4 3/6 页 5 蛋白。 0012 所述的水浴加热优选参数为 ： 亚油酸与蛋白质量比 2.37:1， 混合体系的 pH 9.3， 水浴加热时间 5.62h。 0013 实施例 0014 1 材料与方法 1.1 材料、 试剂 脱脂豆粉 哈高科 大豆卵磷脂 青岛天新食品添加剂公司 亚油酸 上海金伴药业有限公司 大豆调和油 金龙鱼 1.2 试验设。
15、备 高速冷冻离心机 日本 真空干燥机 德国 超高压设备 内蒙古包头市文天有限责任公司 pHS-25 型酸度计 上海伟业仪器厂 电子分析天平 梅勒特 - 托利多仪器 ( 上海 ) 有限公司 精密电动搅拌机 江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司 电热恒温水浴锅 余姚市东方电工仪器厂 722S 分光光度计 上海精密科学仪器有限公司 微量取样器 上海荣泰生化工程有限公司 1.3 试验方法 1.3.1 工艺流程 （见图 1） 1.3.2 亚油酸含量的测定 亚油酸含量通过酰化程度测定， 采用三硝基苯磺酸法 (TNBS)， 取浓度为 0.1% 的蛋白 质溶液 (0.05mol/L NaCl， 0.29% SDS。
16、， pH 9.0) 1mL， 加入 0.05mol/L Na2HPO4 1mL， 0.1% 的 TNBS 1mL， 于 60水浴 ( 黑暗 ) 中反应 2h， 然后迅速冷却至室温， 再加入 10% 的 SDS 1mL， 1mol/L 的 HCL 0.5mL， 立即在 335nm 下比色测定 OD 值， 相同条件下不加蛋白的样品作为空 白。以酰基化蛋白溶液反应后测得的 OD 值的减少量和同浓度未酰化大豆蛋白溶液的 OD 值 之比作为酰基化程度。 0015 1.3.3 乳化性能测定 精确称取 1g 左右样品， 溶解于 100mL 磷酸钠缓冲溶液中， 室温下 1000r/min 搅拌 1h。 取 1。
17、5mL 蛋白溶液与 5mL 大豆油混合， 在高速乳化均质机下 13500r/min 乳化 2min 后倒入 25mL 烧杯中， 分别于 0min， 30min 在烧杯底部取样 20uL 乳状液与 5mL0.1% 的 SDS 溶液均匀 混合， 在 500nm 处测定其吸光值。 0016 1.3.4 计算公式 说 明 书 CN 103636918 A 5 4/6 页 6 其中， T=2.303， N ： 稀释倍数 （250） ， C ： 乳化液形成前蛋白质水溶液中蛋白质浓度 (g/ mL)， ： 乳化液中油相体积分数 (0.25)。 0017 2. 结果与讨论 2.1 蛋白与亚油酸比例的选择 按 。
18、1.3.1 所述方法， 亚油酸与蛋白质量比为 1:1、 2:1、 3:1、 4:1， 体系 pH 为 9， 加热时间 为 6h。考察亚油酸与蛋白质量比对酰化程度的影响， 结果见图 2。如图 2 可以看出， 当亚 油酸与蛋白质量比低于 2:1 时， 酰化程度升高， 亚油酸含量逐渐升高， 亚油酸与蛋白质量比 继续增加时， 亚油酸含量保持不变， 所以在下面的响应面设计中亚油酸与蛋白质量比选择 1.5:1-2.5:1。 0018 2.2 体系 pH 的选择 按 1.3.1 所述方法， 亚油酸与蛋白质量比为 2:1， 体系 pH 为 7、 8、 9、 10， 加热时间为 6h。 考察体系 pH 对酰化程。
19、度的影响， 结果见图 3。如图 3 可以看出， 当 pH 低于 9 时， 亚油酸含量 呈上升趋势， pH 继续增加时， 亚油酸含量开始下降， 所以在下面的响应面设计中 pH 水平选 择 8.5-9.5。 0019 2.3 加热时间的选择 按 1.3.1 所述方法， 亚油酸与蛋白质量比为 2:1， 体系 pH 为 9， 加热时间为 3h、 4h、 5h、 6h、 7h， 考察加热时间对酰化程度的影响， 结果见图 4。由图 4 结果可以看出， 随着时间的增 加， 亚油酸含量显著上升， 当达到 6h 时， 亚油酸含量接近最大值， 超过 6h 时， 亚油酸含量变 化不明显趋于稳定。所以在下面的响应面设。
20、计中反应时间选择 5.5h-6.5h。 0020 2.4 亚油酸含量响应面试验设计 2.4.1 实验因素水平编码表 在单因素研究的基础上， 确定各因素的水平值范围， 采用响应面中心组和实验设计， 研究反应参数对考察指标的影响规律。选取亚油酸与蛋白质量比， 加热时间， 体系 pH3 个因素， 以酰化程度为响应值， 优化蛋白改性的工艺的最佳参数。对试验结果数据采用 Design-Expert 8.0.5 软件进行分析， 响应面因素水平表见表 1。 0021 表 1 响应面试验因素水平表 2.4.2 响应面试验安排及结果 在单因素实验的基础上， 确定各因素的最佳水平值范围， 采用响应面中心组和试验设。
21、 计， 研究各参数对考察指标的影响规律， 并得到反应的最佳条件。 以各工艺参数亚油酸与蛋 白质量比 （A） 、 加热时间 （B） 、 体系 pH （C） 为自变量， 以酰化程度为响应值。响应面实验方案 说 明 书 CN 103636918 A 6 5/6 页 7 及结果见表 2。 0022 表 2 响应面设计方案及结果 2.4.3 响应面实验结果分析 利用 Design- Expert8.0.5 软件对试验结果进行二次回归拟合， 以酰化程度 （Y） 为响 应值， 得到酰化程度的回归方程模型为 ： Y=59.73+0.92 A-0.95 B+2.29C-0.46A B-0.12A C-0.87 。
22、B C-1.42 A2-1.45B2-0.97 C2 对酰化程度的试验数据进行方差分析并进行显著性检验， 结果如表 3 所示。交互相显 著的响应面分析见图 5- 图 6。 0023 表 3 酰化程度的试验结果方差分析表 注 ： p 值 0.1000 不显著。 0024 由表 3 的方差分析结果可以看出， 所得回归方程极显著 （p0.8000） R2Adj=97.43%， 说明 99.08% 的变化能通过这个模型解释， 试验误差较小， 模型成 立， 可以通过此模型可以对富含亚油酸的蛋白改性进行预测和分析。 0025 由表 3 中的各项系数的显著性检验可知， 一次项 A、 B、 C， 二次项 AB。
23、、 AC、 BC、 A2、 B2、 C2对酰化程度有显著的影响 （p 体系 pH 加热时间。 0026 2.4.4 乳化活性的测定 根据1.3.3乳化活性的测定方法， 未改性蛋白乳化性由1.3.4公式计算为61.23 m2/g， 改性后富含亚油酸的蛋白乳化活性为 74.21 m2/g。改性的蛋白乳化活性提高， 是未改性的 1.21 倍。 0027 3. 试验结论 利用响应面分析方法对富含亚油酸的蛋白制备工艺参数进行优化。 建立了相应的数学 模型为以后的中试以及工业化生产提供理论基础， 最佳工艺条件为 ： 亚油酸与蛋白质量比 2.37:1， 体系 pH 9.3， 加热时间 5.62h， 在此最佳工艺条件下酰化程度为 61.47%。试验所得 结果较为理想， 为制备富含亚油酸的蛋白提供了理论基础。 说 明 书 CN 103636918 A 8 1/3 页 9 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 103636918 A 9 2/3 页 10 图 3 图 4 说 明 书 附 图 CN 103636918 A 10 3/3 页 11 图 5 图 6 说 明 书 附 图 CN 103636918 A 11 。