发明领域
本发明涉及免疫学领域，并且特别地涉及用于制备针对呼吸道合胞病毒(RSV)的疫苗的免疫原性制剂。该制剂包含有在缓冲盐水溶液中稳定化的至少一种重组且减毒的活分枝杆菌(Mycobacterium)菌株，优选地卡介菌(Calmette-Guérin bacillus，BCG)菌株，其关于一种或多种RSV免疫原性蛋白质或片段而言是重组的。
发明简述
本发明包括免疫原性制剂，其在哺乳动物中诱导针对由呼吸道合胞病毒(RSV)引起的感染的保护和/或减弱由该病毒引起的病理学状态。本发明的免疫原性制剂可以用于制备疫苗，并且包含一定的菌落形成单位(CFU)(例如，1×104-1×09CFU/剂)的活的重组且减毒的分枝杆菌菌株，优选地卡介菌(BCG)菌株，所述菌株重组地或异源地表达一种或多种RSV免疫原性蛋白质或片段，并且在其使用前通过冷冻干燥(在4℃至25℃的温度范围内)或者在稳定化盐水溶液中(在-80℃至4℃的温度范围内)进行保存。例如，将免疫原性制剂重悬浮在稀释的Sauton SSI溶液(125μg MgSO4，125μg K2HPO4，1mg L-天冬酰胺，12.5μg柠檬酸铁铵，18.4mg 85％甘油，0.5mg柠檬酸，1ml注射用水)中，并且保存于4℃；给在PBS(137mM NaCl，2.7mMKCl；4.3mM Na2HPO4；1.47mM KH2PO4，pH 7.4)中的免疫原性制剂补充以0.02％Tween 80和20％甘油，并且保存于-80℃；或者将免疫原性制剂重悬浮在25体积％的乳糖溶液以及补充有葡萄糖和Tween 80的Proskauer and Beck Medium(PBGT：0.5g天冬酰胺；5.0g磷酸 二氢钾；1.5g柠檬酸镁；0.5g硫酸钾；0.5ml Tween 80；和10.0g葡萄糖/升蒸馏水)中，冷冻干燥，并且保存于4℃至25℃的温度范围下。
本发明的免疫原性制剂的重组且减毒的分枝杆菌细菌包含一个或多个编码来自RSV亚型RSV A或RSV B或两者的至少一种蛋白质或免疫原性片段的基因。这些RSV蛋白质或免疫原性片段与来自RSV的蛋白NS1、NS2、N、P、M、SH、M2(ORF1)、M2(ORF2)、L、F或G相对应，并且以一个或多个拷贝插入到细菌基因组或染色体外质粒中，并且它们的表达受组成型或诱导型内源或外源BCG启动子控制。这些RSV蛋白质或免疫原性片段可以由BCG或其他减毒的分枝杆菌菌株表达为胞质可溶的、分泌至细胞外的或细胞膜结合的蛋白质。
本发明中公开的免疫原性制剂可以连同包含其他减毒的分枝杆菌或BCG菌株的免疫原性制剂一起进行使用，所述其他减毒的分枝杆菌或BCG菌株在下列方面不同：它们表达不同的免疫原性RSV蛋白质；和/或基因定位(插入到基因组中或者处于染色体外)；和/或蛋白质基因的拷贝数；和/或诱导蛋白质表达的启动子；和/或RSV蛋白质或免疫原性片段的目的地(胞质可溶的、分泌至细胞外的或膜结合的蛋白质)。
前面所描述的免疫原性制剂的减毒的分枝杆菌细菌来自处于指数生长期或稳定期(相应于0.5至1.5的在600nm处的光密度)的分枝杆菌细菌培养物，其在缓冲盐水溶液(PBS-0.02％Tween 80或稀释的Sauton SSI溶液)中。
前面所描述的免疫原性制剂可以与缓冲盐水或生理溶液例如稀释的Sauton SSI溶液(125μg MgSO4，125μg K2HPO4，1mg L-天冬酰胺，12.5μg柠檬酸铁铵，18.4mg 85％甘油，0.5mg柠檬酸，1ml注射用水)一起以皮下、经皮或真皮下形式施用给个体。
前面所描述的免疫原性制剂可以用于对先前已与或未与呼吸道合胞病毒相接触的个体进行疫苗接种，以便赋予针对RSV的免疫性。
发明背景
呼吸道合胞病毒(RSV)是全世界幼儿中急性呼吸道感染的主要病原体。根据WHO，这种病毒每年感染6千4百万人，其中160,000人死亡(www.who.int)。由这种病毒造成的感染引起广泛范围的临床症状，所述临床症状可以轻至鼻炎或者严重得多例如肺炎或细支气管炎，其中在未断奶的婴儿、早产儿、具有先天性心脏病的儿童和免疫抑制的儿童中观察到最坏的情况(1-3)。
由这种病毒引起的感染完全是频繁和复发的，因为实际上100％的小于3岁的儿童已具有至少一次RSV感染发作(4)。因为这种感染不留下完整的免疫记忆(5)，所以再感染是频繁的，其中随着患者年龄增加而严重性降低。
由RSV感染引起的健康状况对于受影响的国家产生了高的经济影响。在发达国家中所进行的研究估计，这种感染的花费超过3,000欧元/患者(6)，其中最高限度达到高至8,400欧元(6)。
RSV是具有脂质外壳的负、不分节段、单链RNA病毒，其属于副粘病毒科的肺病毒属(在(7)中进行了综述)。RSV具有约15kb的基因组，其编码总共11种蛋白质。这些蛋白质中的5种具有结构功能，相应于跨膜F、G和SH蛋白，核衣壳N蛋白，和基质M蛋白。其他4种蛋白质，M2-1、M2-2、P和L，参与病毒的复制和转录。其余的2种蛋白质(称为NS1和NS2)是非结构蛋白质，并且它们看起来参与毒力(8)。
感染人的RSV具有不同的毒株或亚群，其中亚群A和B是在群体中占优势的那些(在(9)中进行了综述)。在亚群之间的主要抗原差异与蛋白G相关，其在不同亚群之间仅保留40-44％的其氨基酸(9)。
第一种针对RSV的疫苗在20世纪60年代进行了测试，并且包含经福尔马林灭活的完整病毒(RSV-FI)，其在明矾佐剂存在下经肌内进行施用(10)。与预期的结果相反，在经疫苗接种的儿童中，在RSV感染后，这种免疫接种引起严重得多的呼吸病例，这导致其中的80％ 住院和2例死亡(11)。由经疫苗接种的儿童所呈现出的呼吸-肺临床症状的特征在于罕见的嗜酸性粒细胞和嗜中性粒细胞浸润，连同高滴度的补体结合性抗体(11)。由于RSV感染而死亡的、用RSV-FI进行疫苗接种的儿童的受侵袭肺组织的分析显示出在支气管周围区域中补体沉积、免疫复合物和嗜酸性粒细胞的存在(12)。连同这点，动物研究证明，用RSV-FI进行的疫苗接种产生基于T CD4+淋巴细胞的Th2-型免疫应答，其具有与已用蛋白G进行免疫接种(13)或者接受对于该蛋白质特异的T CD4+淋巴细胞(在RSV感染前)的动物中所观察到的那些相同的特征。因此之故，为了配制有效且安全的针对RSV的疫苗，必须充分研究针对这种病毒的不同蛋白质所产生的免疫应答，以便鉴定能够诱导基于干扰素-γ(IFN-γ)产生性和细胞毒性T-淋巴细胞的Th1-型免疫应答的那些。
关于针对RSV的疫苗的当前研究已集中于分析和开发病毒亚单位，例如蛋白F(14)、M2(15)以及某些保守的蛋白G区段(16)。另一方面，已研究了基于突变型RSV病毒毒株的疫苗的产生，所述突变型RSV病毒毒株例如为对于温度敏感的(17)、在某些基因中具有缺失(18)或者关于细胞因子例如GM-CSF而言重组的(19)那些。这些疫苗中的一些已在I和II期临床试验中进行了测试，它们具有可变的结果(20-22)。其他推定的针对RSV的疫苗由基于蛋白F和G的疫苗的组代表，其用佐剂例如ISCOMs进行施用。当新的病毒感染形成时，用这种类型的疫苗进行的免疫接种产生增加的在肺组织中的嗜酸性粒细胞浸润(23)，这增加了对肺组织的损害。
幼儿的免疫系统的特征在于优先发展出Th2-型免疫应答，其可能由在生命的前6个月期间免疫系统未成熟引起(24，25)。然而，如果经适当刺激，那么免疫系统可以呈现出Th1-型应答(26)。为了配制有效且安全的针对RSV的疫苗，必须充分研究针对这种病毒的不同蛋白质所产生的免疫应答，以便鉴定能够诱导基于细胞毒性T-淋巴细胞的Th1-型免疫应答的那些。使用细菌载体来异源表达病毒抗原具有下述优点，即这些细菌载体可以用作减毒的活载体，因为它们具有完 整的侵入能力并且公认为非病原性的。用于表达异源抗原的某些细菌载体的另外优点是其已知的诱导Th1-型免疫性的能力(27，28)，这对于开发针对RSV的疫苗的情况是非常有吸引力的(29)。卡介菌(BCG)是减毒的牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis)菌株，其用作针对新生儿中的结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)的疫苗。从BCG被批准作为针对结核病的疫苗起，这已施用给全世界超过3.3万亿人。通过这些细菌的许多有利特征(例如，其在冷冻干燥形式下的高热稳定性)而促进了它的大规模使用。此外，用这种细菌对新生儿进行免疫接种是无风险的，并且仅产生最低限度的副作用。BCG是高度免疫原性的，并且仅1剂就能够产生长期维持的免疫应答。重要的是，BCG在成人和儿童中诱导强有力的Th1-型免疫应答(30)。在新生儿中通过针对结核分枝杆菌的抗原(PPD)而产生的细胞类型免疫应答(其能够在延长的时期期间存在)而证明了这种现象(30)。
迄今为止，几种细菌、寄生虫和病毒抗原已在这种细菌系统中成功表达，当在动物模型中进行评价时，这被证实诱导了针对这些抗原的体液和细胞免疫(31，32)。此外，BCG具有不被母乳中存在的抗体中和的特性，并因此它可以在未断奶的婴儿中用作免疫性诱导物。本发明涉及免疫学制剂，其包含关于RSV蛋白质而言重组的一种或多种减毒的分枝杆菌细菌菌株，优选地BCG菌株，并且可以用于制备针对这种病毒的疫苗。
该制剂旨在避免或减弱由RSV感染引起的肺损害，这是由于产生了有利于去除病毒的有效免疫应答。因为减毒的分枝杆菌菌株例如BCG是强有力的Th1-型免疫应答诱导物，所以由关于RSV而言重组的BCG菌株所诱导的免疫应答促成了针对由这种病毒引起的感染的保护。
附图简述
图1为用于评估在BCG菌株中来自RSV的蛋白N的表达的免疫印 迹(Western印迹)测定法。这种减毒的分枝杆菌菌株包含单个拷贝的来自RSV的蛋白N基因，其插入到细菌基因组中从而处于组成型hsp60启动子的控制下，并且以组成型形式由所述细菌表达。从总细菌提取物的可溶性级分中获得所述蛋白质。对于用质粒pMV361-N转化的并且于-80℃保存在PBS(137mM NaCl；2.7mM KCl；4.3mM Na2HPO4；1.47mM KH2PO4，pH 7.4)-0.05％ Tween 80-20％甘油溶液中的多个BCG克隆施行蛋白质提取。使用针对来自RSV的蛋白N而产生的兔多克隆抗体来检测所述蛋白质的存在；(+)是阳性测定法对照，包含0.25μg的重组蛋白N；(-)是阴性测定法对照，包含25μg的来自未用pMV361-N转化的BCG菌株的蛋白质；泳道1-5是25μg的来自用pMV361-N转化的BCG克隆的蛋白质。可以得出结论，当将基因插入到细菌基因组中从而处于组成型启动子的控制下时，来自RSV的蛋白N在BCG中成功表达。
图2为用于评估在于-80℃保存在PBS(137mM NaCl；2.7mM KCl；4.3mM Na2HPO4；1.47mM KH2PO4，pH 7.4)-0.05％ Tween 80-20％甘油溶液中的BCG菌株中来自RSV的蛋白M2的表达的免疫印迹(Western印迹)测定法。这种减毒的分枝杆菌BCG菌株包含单个拷贝的来自RSV的蛋白M2基因，其插入到细菌基因组中从而处于组成型hsp60启动子的控制下，并且以组成型形式由所述细菌表达。从总细菌提取物的可溶性级分中获得所述蛋白质。对于用质粒pMV361-M2转化的BCG克隆施行蛋白质提取。使用针对来自RSV的蛋白M2而产生的兔多克隆抗体来检测所述蛋白质的存在；(+)是阳性测定法对照，包含0.25μg的被RSV感染的HEp-2细胞的总裂解物；(-)是阴性测定法对照，包含25μg的来自未用pMV361-M2转化的BCG菌株的蛋白质；泳道1-3是25μg的来自用pMV361-M2转化的BCG克隆的蛋白质。可以得出结论，当将基因插入到细菌基因组中从而处于组成型启动子的控制下时，来自RSV的蛋白M2在BCG中成功表达。
图3显示了来自用在盐水溶液(PBS：137mM NaCl；2.7mM KCl；4.3mM Na2HPO4；1.47mM KH2PO4，0.02％Tween 80，pH 7.4，在4℃下) 中的表达蛋白N的BCG进行免疫接种的BALB/c小鼠的脾细胞的CD8+-CD69+细胞百分比(A)和IFN-γ分泌(B)(33)。将来自动物脾脏的5×105个细胞用0.5μM来自RSV的蛋白N刺激72小时，所述动物未经免疫接种，或者用1×107PFU的RSV进行免疫接种、用BCG(1×108CFU/小鼠，在PBS中：137mM NaCl；2.7mM KCl；4.3mM Na2HPO4；1.47mM KH2PO4，0.02％Tween 80，pH 7.4，4℃)进行免疫接种、或用关于来自RSV的蛋白N而言重组的BCG(1×108CFU/小鼠，在PBS中：137mM NaCl；2.7mM KCl；4.3mM Na2HPO4；1.47mM KH2PO4，0.02％ Tween 80，pH 7.4，4℃)进行免疫接种。随后，通过流式细胞术来测定关于CD8和CD69标志物而言阳性的细胞的百分比(A)。对细胞上清液实施ELISA，以检测分泌出的IFN-γ的存在(33)。**，0.002的p值，Student’s t-检验。可以得出结论，关于来自RSV的蛋白N而言重组的BCG菌株在用这种免疫原性制剂进行免疫接种的小鼠中引起有利的T淋巴细胞应答。作为对于用重组蛋白N进行的攻击的应答，这些T淋巴细胞被激活，在其表面上表达激活标志物(CD69+)，并且将IFN-γ分泌到细胞外介质中。
图4显示了关于BALB/c小鼠的体重变化曲线，所述BALB/c小鼠用关于来自RSV的蛋白N而言重组的BCG菌株(1×108CFU/小鼠，在PBS中：137mM NaCl；2.7mM KCl；4.3mM Na2HPO4；1.47mM KH2PO4，0.02％ Tween 80，pH 7.4，4℃)或者用关于来自RSV的蛋白M2而言重组的BCG菌株(1×108CFU/小鼠，在PBS中：137mM NaCl；2.7mMKCl；4.3mM Na2HPO4；1.47mM KH2PO4，0.02％ Tween 80，pH 7.4，4℃)进行免疫接种。用1×107PFU的RSV，毒株13018-8，经鼻内感染BALB/c小鼠，所述BALB/c小鼠未经疫苗接种(■)，或者用1×107噬斑形成单位(PFU)的通过紫外线(UV灯，312nm，8瓦特功率)20分钟灭活的RSV(RSV-UV)进行免疫接种(▲)，或者用不表达RSV蛋白质的野生型(WT)BCG菌株(1×108CFU/小鼠，在PBS中：137mM NaCl；2.7mM KCl；4.3mM Na2HPO4；1.47mM KH2PO4，0.02％ Tween 80，pH7.4，4℃)进行免疫接种 或者用由pMV361-N转化的BCG菌株 (1×108CFU/小鼠，在PBS中：137mM NaCl；2.7mM KCl；4.3mM Na2HPO4；1.47mM KH2PO4，0.02％Tween 80，pH7.4，4℃)进行免疫接种(◆)，或者用由pMV 361-M2转化的BCG菌株(1×108CFU/小鼠，在PBS中：137mM NaCl；2.7mM KCl；4.3mM Na2HPO4；1.47mM KH2PO4，0.02％Tween 80，pH 7.4，4℃)进行免疫接种(△)。作为对照，包括了未经疫苗接种且未感染的小鼠的组(●)。每天记录相对于第0天而言的体重的变化，持续4天。**，0.002的p值，Student’s t-检验。可以得出结论，用关于来自RSV的蛋白N或蛋白M2而言重组的BCG菌株进行的小鼠免疫接种诱导了有利的针对RSV感染的应答，因为当与其中观察到体重减少的未经疫苗接种的小鼠的体重相比较时，这些小鼠的体重却没有显著地发生变化。
图5显示了来自BALB/c小鼠的代表性的肺组织学切片，所述BALB/c小鼠经免疫接种并且用1×107PFU的RSV(毒株13018-8)经鼻内进行感染。(A-B)，未感染的小鼠的肺；(C-D)，用RSV感染的未经免疫接种的小鼠的肺；(E-F)，针对RSV进行免疫接种并且用RSV感染的小鼠的肺；(G-H)，用关于来自RSV的蛋白N而言重组的BCG(1×108CFU/小鼠，在PBS中：137mM NaCl；2.7mM KCl；4.3mMNa2HPO4；1.47mM KH2PO4，0.02％Tween 80，pH 7.4，于4℃)进行免疫接种的小鼠；和(I-J)，用关于来自RSV的蛋白M2而言重组的BCG(1×108CFU/小鼠，在PBS中：137mM NaCl；2.7mM KCl；4.3mM Na2HPO4；1.47mM KH2PO4，0.02％Tween 80，pH 7.4，于4℃)进行免疫接种的小鼠。右边的图版相应于放大40×的显微照片，而左边的图版相应于放大100×的显微照片，其中用显示上皮肺细胞中病毒蛋白质的存在的多克隆抗RSV抗体-HRP(USBiologicals)进行标记。受感染的肺细胞更暗(由箭头来指示)。可以得出结论，用关于来自RSV的蛋白N而言重组的BCG菌株进行免疫接种的小鼠发展出有利的针对RSV感染的T淋巴细胞应答。在RSV感染后，与未经免疫接种的动物相比较而言，在来自经疫苗接种的小鼠的肺中可以观察到更少的细胞浸润。此外，与对照相比较而言，在用关于来自RSV的蛋白N而言重组的BCG 菌株进行疫苗接种的小鼠中观察到更少数目的被病毒感染的肺细胞。
发明详述
本发明包括可以用于制备疫苗的免疫原性制剂，所述疫苗在哺乳动物中诱导针对由呼吸道合胞病毒(RSV)引起的感染的保护和/或减弱由该病毒引起的病理学状态。本发明的免疫原性制剂可以用于制备疫苗，并且包含一定的菌落形成单位(CFU)(例如，1×104-1×109CFU/剂)的活的重组且减毒的分枝杆菌菌株，优选地卡介菌(BCG)菌株(例如，Pasteur或Danish BCG菌株(34)，美国典型培养物保藏中心， www.atcc.org，ATCC编号分别为35734和35733)，所述菌株重组地或异源地表达一种或多种RSV免疫原性蛋白质或片段，并且在其使用前通过冷冻干燥或者在稳定化盐水中进行保存。例如，将免疫原性制剂在稀释的Sauton SSI溶液(125μg MgSO4，125μg K2HPO4，1mg L-天冬酰胺，12.5μg柠檬酸铁铵，18.4mg 85％甘油，0.5mg柠檬酸，在1ml H2O中)中于4℃进行保存；将免疫原性制剂在补充有0.02％Tween 80和20％甘油的PBS(137mM NaCl，2.7mM KCl；4.3mM Na2HPO4；1.47mM KH2PO4，pH 7.4)中于-80℃进行保存；或者将免疫原性制剂重悬浮在25体积％的乳糖溶液以及补充有葡萄糖和Tween 80的Proskauer and Beck Medium(PBGT：0.5g天冬酰胺；5.0g磷酸二氢钾；1.5g柠檬酸镁；0.5g硫酸钾；0.5ml Tween 80；和10.0g葡萄糖/升蒸馏水)中，冷冻干燥，并且保存于4℃至25℃的温度范围下。
本发明的免疫原性制剂的重组且减毒的分枝杆菌细菌包含编码来自RSV亚型RSV A或RSV B或两者的至少一种蛋白质或免疫原性片段的基因。呼吸道合胞病毒的基因组先前已在GenBank数据库中进行了描述，具有登录号gI-9629367和gI-9629198。这些来自RSV的免疫原性蛋白质或片段与来自RSV的蛋白NS1、NS2、N、P、M、SH、M2(ORF1)、M2(ORF2)、L、F或G相对应，并且包含在质粒pMV361中(37)， 所述质粒pMV361根据先前所描述的技术通过电转化而掺入到细菌中(35)，并且通过分枝杆菌噬菌体整合酶的作用而随之掺入到细菌基因组中(36)。这些基因还可以存在于染色体外质粒例如pMV261中(37)，所述质粒pMV261根据先前所描述的技术通过电转化而掺入到分枝杆菌中(35)，并且以染色体外的形式维持在细菌中(36)。这些基因可以以单个或多个拷贝存在，并且其表达受组成型或诱导型(例如，分别为hsp60基因启动子和acr基因启动子)内源BCG启动子(例如，来自BCG的hsp60基因启动子)指挥。这些RSV免疫原性蛋白质或片段可以由BCG或其他减毒的分枝杆菌菌株表达为胞质可溶的、分泌至细胞外的或膜结合的形式，这是由于将呼吸道合胞病毒基因或其免疫原性片段与编码充当朝向不同细菌区室的蛋白质目的地信号的肽(例如，α-抗原基因的N-末端序列，其用于细胞外分泌；和19-kDa蛋白基因的N-末端序列，其用于膜结合蛋白质)的DNA序列相融合。
本发明中公开的免疫原性制剂可以连同包含一种或多种在下列方面不同的减毒的分枝杆菌或BCG菌株的免疫原性制剂一起进行使用：它们表达不同的免疫原性RSV蛋白质；和/或基因定位(插入到基因组中或者处于染色体外)；和/或蛋白质基因的拷贝数；和/或诱导蛋白质表达的启动子；和/或RSV蛋白质或免疫原性片段的目的地(胞质可溶的、分泌至细胞外的或膜结合的蛋白质)。
前面所描述的免疫原性制剂的减毒的分枝杆菌细菌来自处于指数生长期或稳定期(具有0.5至1.5的在600nm处的光密度)的分枝杆菌细菌培养物(例如，在37℃下，在培养基中，其补充有4.9g/L的Middlebrock 7H9培养基，Difco，目录号0713-01-7，1×富集OADCBeckton Dickinson介质，目录号212351；5％甘油和0.05％Tween 80)，其在缓冲盐水溶液(PBS-0.02％Tween 80，或稀释的Sauton SSI溶液)中。
前面所描述的免疫原性制剂可以与缓冲盐水或生理溶液例如稀释的Sauton SSI溶液(125μg MgSO4，125μg K2HPO4，1mg L-天冬酰胺，12.5μg柠檬酸铁铵，18.4mg 85％甘油，0.5mg柠檬酸，1ml 注射用水)一起以皮下、经皮或真皮下形式施用给个体。
前面所描述的免疫原性制剂可以用于对先前已与或未与呼吸道合胞病毒相接触的个体进行疫苗接种，以便赋予针对这种病毒的免疫性或减弱由其引起的病理学状态。
实施例
下述涉及关于来自呼吸道合胞病毒(RSV)的蛋白质而言重组的BCG菌株的产生和使用的实施例仅是举例说明性的，并不意欲限制本发明的产生或申请范围。尽管在下列描述中使用特定的术语，但它们的使用仅是描述性的而不是限制性的。
实施例I：免疫原性制剂，其包含108个关于来自RSV亚型A的N基因而言重组的BCG Danish菌株的细菌。将该基因插入到细菌基因组中从而处于来自BCG的内源组成型hsp60启动子的调节下，并且以胞质方式表达出蛋白质。所述免疫原性制剂可以于-80℃包含在稀释的Sauton SSI溶液(125μg MgSO4，125μg K2HPO4，1mg L-天冬酰胺，12.5μg柠檬酸铁铵，18.4mg 85％甘油，0.5mg柠檬酸，1ml H2O)中。所述制剂还可以以108个细菌/100μl的终浓度包含在补充有20％甘油和0.02％Tween 80的PBS(137mM NaCl；2.7mM KCl；4.3mMNa2HPO4；1.47mM KH2PO4，pH 7.4)溶液中，并且保存于-80℃。类似地，可以将所述菌株重悬浮在25体积％的乳糖溶液以及补充有葡萄糖和Tween 80的Proskauer and Beck Medium(PBGT：0.5g天冬酰胺；5.0g磷酸二氢钾；1.5g柠檬酸镁；0.5g硫酸钾；0.5ml Tween 80；和10.0g葡萄糖/升蒸馏水)中，然后冷冻干燥并保存于25℃。
通过电转化(35)用衍生自pMV361质粒的pMV361/N质粒(37)转化BCG Danish菌株(美国典型培养物保藏中心，www.atcc.org，ATCC编号35733)，所述pMV361/N质粒插入到细菌基因组中一次。该质粒包含编码来自RSV亚型A的蛋白N的基因，其在来自BCG的hsp60基 因的内源组成型启动子的调节下进行表达。使所得到的重组体菌落进行生长(于37℃在经补充的Middlebrock 7H9培养基中)直至OD600nm＝1，在4,000rpm下离心20分钟(Eppendorf 5702/R A-4-38型转子)，并且以108个细菌/100μl的终浓度重悬浮在补充有20％甘油和0.02％Tween 80的PBS(137mM NaCl；2.7mM KCl；4.3mM Na2HPO4；1.47mM KH2PO4，pH 7.4)溶液中，并保存于-80℃。类似地，将所述菌株重悬浮在25体积％的乳糖溶液以及补充有葡萄糖和Tween 80的Proskauer and Beck Medium(PBGT：0.5g天冬酰胺；5.0g磷酸二氢钾；1.5g柠檬酸镁；0.5g硫酸钾；0.5ml Tween 80；和10.0g葡萄糖/升蒸馏水)中，然后冷冻干燥并保存于25℃。通过使用针对来自RSV的蛋白N而产生的抗体的Western印迹测定法，可以观察到，这种BCG菌株在细胞质中重组地表达来自RSV亚型A的蛋白N(图1)。使用用作疫苗的所描述的制剂对BALB/c小鼠所进行的免疫接种赋予这些动物以针对下述感染的保护：用107噬斑形成单位的RSV亚型A的鼻内感染(图4和5)。该免疫原性制剂能够赋予针对来自RSV亚型A和B的蛋白N的免疫性。
实施例II：免疫原性制剂，其包含5×107个关于来自RSV亚型A的N基因而言重组的BCG Danish菌株的细菌和5×107个关于来自RSV亚型A的M2基因而言重组的BCG Danish菌株的细菌。在所述免疫原性制剂所包含的细菌的每一种中，RSV基因以单个拷贝插入到细菌基因组中从而处于来自BCG的内源组成型hsp60启动子的调节下，并且以胞质方式表达出蛋白质。所述免疫原性制剂可以以108个细菌/100μl的终浓度保存在补充有20％甘油和0.02％Tween 80的PBS(137mMNaCl；2.7mM KCl；4.3mM Na2HPO4；1.47mM KH2PO4，pH 7.4)中，并且保存于-20℃。类似地，可以将所述菌株重悬浮在25体积％的乳糖溶液以及补充有葡萄糖和Tween 80的Proskauer and Beck Medium(PBGT：0.5g天冬酰胺；5.0g磷酸二氢钾；1.5g柠檬酸镁；0.5g硫酸钾；0.5ml Tween 80；和10.0g葡萄糖/升蒸馏水)中，然后冷 冻干燥并保存于4℃。
通过电转化(35)用衍生自pMV361质粒的pMV361/N或pMV361/M2质粒(37)转化BCG Danish菌株(美国典型培养物保藏中心， www.atcc.org，ATCC编号35733)，所述pMV361/N或pMV361/M2质粒插入到细菌基因组中一次。这些质粒分别包含来自RSV亚型A的蛋白N和M2基因，所述基因处于来自BCG的组成型hsp60基因启动子的控制下。使所得到的重组体菌落进行生长(于37℃在经补充的Middlebrock 7H9培养基中)直至OD600nm＝1，在4,000rpm下离心20分钟(Eppendorf 5702/R A-4-38型转子)，并且以107个细菌/100μl的终浓度重悬浮在补充有20％甘油和0.02％Tween 80的PBS(137mMNaCl；2.7mM KCl；4.3mM Na2HPO4；1.47mM KH2PO4，pH 7.4)溶液中，并保存于-20℃。类似地，可以将所述菌株重悬浮在25体积％的乳糖溶液以及补充有葡萄糖和Tween 80的Proskauer and Beck Medium(PBGT：0.5g天冬酰胺；5.0g磷酸二氢钾；1.5g柠檬酸镁；0.5g硫酸钾；0.5ml Tween 80；和10.0g葡萄糖/升蒸馏水)中，然后冷冻干燥并保存于4℃。通过使用针对来自RSV的蛋白N和M2而产生的抗体的Western印迹测定法，可以观察到，这些BCG Danish菌株重组地表达来自RSV亚型A的蛋白N和M2(图1和2)。该免疫原性制剂能够赋予同时的针对来自RSV亚型A和B的蛋白N和M2的免疫性。
实施例III：免疫原性制剂，其包含106个关于来自RSV亚型B的蛋白F的区段而言重组的BCG Pasteur菌株的细菌。该基因以多个拷贝(2-4个拷贝/细菌)以染色体外形式存在于细菌中，并且编码来自RSV亚型B的蛋白F的片段(从氨基酸5至氨基酸200的区段)。该基因的表达处于编码来自BCG的α-抗原蛋白(85kDa)的基因的内源组成型启动子的控制下。此外，由该基因所编码的蛋白质在其N-末端处具有信号肽HMKKRGLTVAVAGAAILVAGLSGCSSNKSTTGSGETTTTAAGTTASPGG，该信号肽属于BCG的19kDa蛋白并且诱导其表达在细菌膜处。所述免疫原性制剂在补充有0.02％Tween 80和20％甘油的PBS(137mM NaCl；2.7mM KCl；4.3mM Na2HPO4；1.47mM KH2PO4，pH 7.4)中于-80℃进行保存。类似地，可以将所述菌株重悬浮在25体积％的乳糖溶液以及补充有葡萄糖和Tween 80的Proskauer and Beck Medium(PBGT：0.5g天冬酰胺；5.0g磷酸二氢钾；1.5g柠檬酸镁；0.5g硫酸钾；0.5ml Tween 80；和10.0g葡萄糖/升蒸馏水)中，然后冷冻干燥并保存于4℃。
通过电转化(35)用衍生自pMV261质粒的pMV261/F5-200质粒(37)转化BCG Pasteur菌株(美国典型培养物保藏中心，www.atcc.org，ATCC编号35734)，所述pMV261/F5-200质粒以多个拷贝以染色体外形式位于细菌内。该质粒编码在其N-末端处与来自BCG的19kDa蛋白的下述信号肽相融合的来自RSV亚型B的F基因的片段(从氨基酸5至氨基酸200的区段)：HMKKRGLTVAVAGAAILVAGLSGCSSNKSTTGSGETTTTAAGTTASPGG，该信号肽诱导所述19kDa蛋白表达在细菌膜处。该基因的表达处于编码来自BCG的α-抗原蛋白(85kDa)的基因的内源组成型启动子的控制下。使所得到的重组体菌落于37℃在经补充的Middlebrock 7H9培养基中进行生长直至OD600nm＝1，在4,000rpm下离心20分钟(Eppendorf 5702/R A-4-38型转子)，并且以106个细菌/100μl的终浓度重悬浮在补充有0.02％Tween 80和20％甘油的PBS(137mM NaCl；2.7mM KCl；4.3mM Na2HPO4；1.47mM KH2PO4，pH 7.4)中。类似地，可以将所述菌株重悬浮在25体积％的乳糖溶液以及补充有葡萄糖和Tween 80的Proskauer and Beck Medium(PBGT：0.5g天冬酰胺；5.0g磷酸二氢钾；1.5g柠檬酸镁；0.5g硫酸钾；0.5ml Tween 80；和10.0g葡萄糖/升蒸馏水)中，然后以各包含106个细菌的等分试样进行冷冻干燥并保存于4℃。该免疫原性制剂能够赋予针对来自RSV亚型A和B的蛋白F的免疫性。
实施例IV：免疫原性制剂，其包含105个同时对于来自RSV亚型A的N和M2基因而言重组的BCG Danish菌株的细菌。将N基因插入到细菌基因组中从而处于来自BCG的内源组成型hsp60启动子的调节 下，并且以胞质方式表达出蛋白质。M2基因以多个拷贝(2-4个拷贝/细菌)以染色体外形式存在于细菌中，并且处于编码来自BCG的α-抗原蛋白(85kDa)的基因的内源组成型启动子的控制下。由M2基因所编码的蛋白质在其N-末端处具有来自BCG的19kDa蛋白的信号肽：HMKKRGLTVAVAGAAILVAGLSGCSSNKSTTGSGETTTTAAGTTASPGG，该信号肽诱导所述19kDa蛋白表达在细菌膜上。将所述免疫原性制剂保存于4℃，由重悬浮在25体积％的乳糖溶液以及补充有葡萄糖和Tween 80的Proskauer and Beck Medium(PBGT：0.5g天冬酰胺；5.0g磷酸二氢钾；1.5g柠檬酸镁；0.5g硫酸钾；0.5ml Tween 80；和10.0g葡萄糖/升蒸馏水)的细菌进行冷冻干燥，冷冻干燥并保存于4℃。类似地，可以将所述菌株以105个细菌/100μl的终浓度保存在补充有0.02％Tween 80和20％甘油的PBS(137mM NaCl；2.7mM KCl；4.3mMNa2HPO4；1.47mM KH2PO4，pH 7.4)溶液中。
通过电转化(35)用衍生自pMV 361质粒的pMV361/N质粒(37)转化BCG Danish菌株(美国典型培养物保藏中心，www.atcc.org，ATCC编号35733)，所述pMV 361/N质粒插入到细菌基因组中一次。该质粒包含编码来自RSV亚型A的蛋白N的基因，其在来自BCG的hsp60基因的内源组成型启动子的调节下进行表达。在评估出所得到的BCG菌株关于来自RSV的蛋白N而言是重组的之后，通过电转化(35)用衍生自pMV206质粒的pMV206/M2质粒(37)转化所述BCG菌株，所述pMV206/M2质粒以多个拷贝以染色体外形式位于细菌内。由M2基因所编码的蛋白质在其N-末端处具有信号肽HMKKRGLTVAVAGAAILVAGLSGCSSNKSTTGSGETTTTAAGTTASPGG，该信号肽属于BCG的19kDa蛋白并且诱导其表达在细菌膜处。使所得到的重组体菌落于37℃在经补充的Middlebrook 7H9培养基中进行生长直至OD600nm＝1，在4,000rpm下离心20分钟(Eppendorf 5702/R A-4-38型转子)，并且以105个细菌/1ml的终浓度重悬浮在25体积％的乳糖溶液以及补充有葡萄糖和Tween 80的Proskauer and Beck Medium(PBGT：0.5g天冬酰胺；5.0g磷酸二氢钾；1.5g柠檬酸镁；0.5g 硫酸钾；0.5ml Tween 80；和10.0g葡萄糖/升蒸馏水)中。最后，对具有105个细菌的1-ml等分试样进行冷冻干燥，并且保存于4℃。类似地，可以将所述菌株以105个细菌/100μl的终浓度保存在补充有0.02％Tween 80和20％甘油的PBS(137mM NaCl；2.7mM KCl；4.3mMNa2HPO4；1.47mM KH2PO4，pH 7.4)溶液中。该免疫原性制剂能够赋予针对来自RSV亚型A和B的蛋白N和M2的免疫性。
实施例V：免疫原性制剂，其包含104个关于来自RSV亚型A的N基因而言重组的BCG Danish菌株的细菌。该基因以单个拷贝插入到细菌基因组中从而处于来自BCG的诱导型内源启动子acr的调节下，所述启动子响应于一氧化氮、低氧浓度和稳定生长期而变得具有活性。该蛋白质表达是细胞质的。所述免疫原性制剂在25体积％的乳糖溶液以及补充有葡萄糖和Tween 80的Proskauer and Beck Medium(PBGT：0.5g天冬酰胺；5.0g磷酸二氢钾；1.5g柠檬酸镁；0.5g硫酸钾；0.5ml Tween 80；和10.0g葡萄糖/升蒸馏水)中进行冷冻干燥，在稀释的Sauton SSI溶液(125μg MgSO4，125μg K2HPO4，1mg L-天冬酰胺，12.5μg柠檬酸铁铵，18.4mg 85％甘油，0.5mg柠檬酸，在1ml H2O中)中于25℃进行保存。类似地，可以将所述菌株以104个细菌/100μl的终浓度保存在补充有0.02％ Tween 80和20％甘油的PBS(137mM NaCl；2.7mM KCl；4.3mM Na2HPO4；1.47mM KH2PO4，pH 7.4)溶液中。
通过电转化(35)用衍生自pMV 361质粒的pMV361Pacr/N质粒(37)转化BCG Danish菌株(美国典型培养物保藏中心，www.atcc.org，ATCC编号35733)，所述pMV361Pacr/N质粒插入到细菌基因组中一次。该质粒包含编码来自RSV亚型A的蛋白N的基因，其在来自BCG的内源诱导型acr启动子的调节下进行表达。使所得到的重组体菌落进行生长(于37℃在经补充的Middlebrock 7H9培养基中)直至OD600nm＝1，在4,000rpm下离心20分钟(Eppendorf 5702/R A-4-38型转子)，并且重悬浮在25体积％的乳糖溶液以及补充有葡萄糖和Tween 80的 Proskauer and Beck Medium(PBGT：0.5g天冬酰胺；5.0g磷酸二氢钾；1.5g柠檬酸镁；0.5g硫酸钾；0.5ml Tween 80；和10.0g葡萄糖/升蒸馏水)中。最后，对具有104个细菌的1-ml等分试样进行冷冻干燥，并且保存于25℃。类似地，可以将所述菌株以108个细菌/100μl的终浓度保存在补充有0.02％Tween 80和20％甘油的PBS(137mM NaCl；2.7mM KCl；4.3mM Na2HPO4；1.47mM KH2PO4，pH 7.4)溶液中。该免疫原性制剂能够赋予针对来自RSV亚型A和B的蛋白N的免疫性。
实施例VI：免疫原性制剂，其包含109个关于来自RSV亚型A的N基因而言重组的BCG Danish菌株的细菌。将该基因插入到细菌基因组中从而处于外源T7-噬菌体启动子的调节下，以用于在共表达T7-噬菌体聚合酶的BCG菌株中进行组成型表达。该蛋白质表达是细胞质的。所述免疫原性制剂包含在稀释的Sauton SSI溶液(125μg MgSO4，125μg K2HPO4，1mg L-天冬酰胺，12.5μg柠檬酸铁铵，18.4mg 85％甘油，0.5mg柠檬酸，在1ml H2O中)中并且保存于-20℃，或者可以进行冷冻干燥并且保存于4℃。类似地，可以将所述菌株以109个细菌/100μl的终浓度保存在补充有0.02％Tween 80和20％甘油的PBS(137mM NaCl；2.7mM KCl；4.3mM Na2HPO4；1.47mM KH2PO4，pH 7.4)溶液中。
通过电转化(35)用衍生自pMV361质粒的pMV361PT7/N质粒(37)转化BCG Danish菌株(美国典型培养物保藏中心，www.atcc.org，ATCC编号35733)，所述pMV361PT7/N质粒插入到细菌基因组中一次。该质粒包含编码来自RSV亚型A的蛋白N的基因，其在通过T7-噬菌体聚合酶的表达而被激活的T7启动子的调节下进行表达(39)。
通过电转化(35)用衍生自pMV261质粒的pMV261Amp/PolT7质粒(37)转化所得到的BCG菌株，所述pMV261Amp/PolT7质粒以多个拷贝以染色体外形式位于细菌内。在该质粒中，针对抗生素卡那霉素的抗性(40)已被针对潮霉素(Hygr)的抗性替代。来自T7噬菌体的T7 聚合酶处于来自BCG的hsp60的组成型启动子的控制下。使所得到的重组体菌落于37℃在经补充的Middlebrock 7H9培养基中进行生长直至OD600nm＝1，在4,000rpm下离心20分钟(Eppendorf 5702/R A-4-38型转子)，并且重悬浮在稀释的Sauton SSI溶液(125μg MgSO4，125μg K2HPO4，1mg L-天冬酰胺，12.5μg柠檬酸铁铵，18.4mg 85％甘油，0.5mg柠檬酸，在1ml H2O中)中，并保存于-80℃。该免疫原性制剂能够赋予针对来自RSV亚型A和B的蛋白N的免疫性。
前述的实施例对于包含重组且减毒的分枝杆菌菌株的免疫原性制剂来说是广泛而全面的，所述分枝杆菌菌株表达来自RSV的蛋白NS2、N、P、M、SH、M2(ORF1)、M2(ORF2)、L、F或G，以及其所有组合。类似地，这些实施例对于包含一种或几种重组且减毒的分枝杆菌菌株的免疫原性制剂来说是广泛而全面的；其中所述重组细菌包含来自RSV的蛋白质或免疫原性片段基因，所述基因以一个或多个拷贝插入到细菌基因组或染色体外质粒中，并且它们的表达处于内源或外源的组成型或诱导型启动子的控制下，从而被表达为胞质可溶的、分泌至细胞外的或膜结合的蛋白质。
本文所提及的所有出版物(包括在“参考文献”部分中所列出的所有出版物)通过提及而合并入本文。当引用参考文献以提供关于本文所描述的方法或材料的信息时，涉及那种方法或材料的该参考文献的那部分特别地合并入本文。
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