技术领域
本发明属于医学领域，涉及间歇性低氧在心肌梗塞治疗中的用途。
背景技术
氧是人类及绝大多数生物赖以生存的必需条件，也是机体生理功能调节的 重要因子。低氧是生命发育的基本环境，人类胚胎是在低氧环境中发育的，出 生后仍有部分组织处于低氧环境。因此低氧研究涉及生命科学的基本问题，研 究低氧与人体组织、器官和细胞的损伤及其保护具有重要的医学价值。
众所周知，心肌梗塞随缺血程度的加重和梗塞面积的扩大，对人体造成的 损害是呈进行性发展的。根据世界卫生组织的报道，在西方国家急性冠状动脉 阻塞是导致死亡的主要原因，到2020年它将成为全世界的主要死因。Yellow， Downey等指出，现有的治疗手段对于缺血性心脏病的干预相当有限(Yellon DM， Downey JM.Preconditioning the myocardium：from cellular physiology to clinical cardiology.Physiol Rev.2003；83：1113-1151.)。因此迫切需要一种更为有效的干 预手段，尤其是新的方法，来限制心肌梗塞病变的进展程度。
在过去的几十年中，科学家们发现长期生活在高原地区的人们其心肌梗塞 的发生率和死亡率都很低，这引起了人们对低氧研究的兴趣。这些流行学上的 发现已经在实验室中得到了证实。1973年Meerson等报道每天在模拟高原环境 中预生活5小时，一周连续5天，可使大鼠因冠状动脉阻塞引起的死亡率下降 84％，心肌梗塞面积减少35％(Meerson FZ，Gomzakov OA，Shimkovich MV. Adaptation to high altitude hypoxia as a factor preventing development of myocardial ischemic necrosis.Am J Cardiol.1973；31：30-34.)。在低压氧舱中给予 低氧预适应后，可使动物在急性心肌缺血后，心脏颤动的发作次数和死亡率下 降2-3倍，并且使心梗后的瘢痕减少1/3，还可促进瘢痕附近血管的增生 (Meerson FZ，Ustinova EE，Orlova EH.Prevention and elimination of heart arrhythmias by adaptation to intermittent high altitude hypoxia.Clin Cardiol. 1987；10：783-789.)。在实验中研究慢性低氧常在高原低氧环境下进行，或是在 实验室模拟高原环境的低压氧舱中进行。但是，这些文献说明的是低氧预适应 后，心肌梗塞的病症减轻，即低氧处理发生在心肌梗塞之前，是一种预防手段 而非治疗手段。
间歇性低氧(intermittent hypoxia，IH)不同于持续性低氧，它是在低氧 环境中保持一段时间，然后恢复至常氧环境。近年来，许多研究表明，间歇性 低氧具有与缺血预适应(ischemia preconditioning，IP)相类似的对心肌的保 护作用。出生后的大鼠经间歇性低氧预适应5周后，能明显改善缺氧再灌注 (ischemia-reperfusion)损伤后的心功能。间歇性低氧提高心肌对缺血再灌 注损伤的耐受性，也能显著提高心肌的抗氧化能力和对氧的利用能力。雄性S.D 大鼠在间歇性低氧环境中生活28天和42天后，与对照组相比具有明显的抗心 肌缺血和再灌性心律失常作用，此抗心律失常作用在间歇性低氧14天后逐渐 发生，并可有效维持脱离低氧处理后的二周左右时间。间歇性低氧可促进大鼠 心肌组织微血管生成，增加冠脉流量，也可通过调控Bcl-2/Bax的表达抑制缺 血再灌后心肌细胞的凋亡。
目前在心肌缺血损伤的研究方面，都是将间歇性低氧作为一种预适应手段 (IH preconditioning)，提高心肌对缺血缺氧的抵抗力，从而起到心肌保护作 用。然而，临床上迫切需要解决的却是在心肌梗塞发生后如何减少梗死面积和 缺血损伤区域。但是，间歇性低氧是否能有效的改善已经发生的急性或亚急性 心肌梗塞，即是否具有缓解或治疗作用尚未见报道。
发明内容
本发明的目的在于提供氧在治疗心肌梗塞中的应用。
本发明的另一目的在于提供间歇性低氧在心肌梗塞治疗中的用途。
在本发明的第一方面，提供一种氧气舱设备的用途，用于制备治疗心肌缺血、 梗塞的设备，所述的氧气舱设备包括一个封闭的舱体，所述舱体中包括氧气供给 装置，氧气排出装置，以及含氧量检测装置，其中，所述的氧气供给装置提供氧气， 使得氧气舱内的氧气满足以下条件：氧分压Po2＝84±20mmHg(或11.2±2.8kPa)。
在本发明的第二方面，提供一种氧气的用途，用于制造治疗心肌缺血、梗塞 的设备或制剂。
在本发明的一个优选例中，所述的氧气在治疗心肌缺血、梗塞的设备中以低 氧-常氧相间隔的方式给予，所述低氧-常氧相间隔的时间为低氧6±2小时，常氧18 ±2小时，并且，所述的低氧为氧分压Po2＝84±20mmHg(或11.2±2.8kPa)，所述的 常氧为氧分压Po2＝159±20mmHg(或20.7kPa±3kPa)。
在本发明的一个优选例中，所述低氧-常氧相间隔的时间为低氧6±1小时，常 氧18±1小时，并且，所述的低氧为氧分压Po2＝84±10mmHg(或11.2±1.4kPa)，所 述的常氧为氧分压Po2＝159mmHg±10mmHg(或20.7kPa±1.5kPa)。
在本发明的第三方面，提供一种治疗哺乳动物心肌缺血、梗塞的方法，采用 间歇性低氧处理来实施治疗，包括步骤：使所述哺乳动物在低氧-常氧相间隔的环 境中进行治疗，并且，每天将患有心肌梗塞的哺乳动物置于低氧环境中生活6±2 小时，其余18±2小时生活于常氧环境；所述的低氧为环境中的氧分压Po2＝84± 20mmHg(或11.2±2.8kPa)，所述的常氧为氧分压Po2＝159mmHg±20mmHg或20.7kPa ±2.8kPa；连续治疗7-50天。
在本发明的一个优选例中，每天将患有心肌梗塞的哺乳动物置于低氧环境中 生活6±1小时，其余18±1小时生活于常氧环境；所述的低氧为环境中的氧分压 Po2＝84±10mmHg或11.2±1.4kPa，所述的常氧为氧分压Po2＝159mmHg±10mmHg或 20.7kPa±1.5kPa；连续治疗7-35天。
在另一优选例中，每天将患有心肌梗塞的哺乳动物置于所述低氧环境中生活6 小时，其余18小时生活于常氧环境；所述的低氧为环境中氧分压Po2＝84±20mmHg 或11.2±2.8kPa，所述的常氧为氧分压Po2＝159mmHg±20mmHg或20.7kPa± 2.8kPa；连续治疗10-35天。
在本发明的第四方面，提供一种提高患心肌梗塞的哺乳动物心肌组织中内新 生毛细血管的方法，将所述哺乳动物置于低氧-常氧相间隔的环境中，每天在低氧 环境中生活6±2小时，其余18±2小时生活于常氧环境；所述的低氧为环境中的氧 分压Po2＝84±20mmHg或11.2±2.8kPa，所述的常氧为氧分压Po2＝159mmHg± 20mmHg或20.7kPa±2.8kPa；连续治疗7-50天。
在本发明的一个优选例中，每天在低氧环境中生活6±1小时，其余18±1小时 生活于常氧环境；所述的低氧为环境中的氧分压Po2＝84±10mmHg或11.2±1.4kPa， 所述的常氧为氧分压Po2＝159mmHg±10mmHg或20.7kPa±1.4kPa；连续治疗7-35 天。
本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而 易见的。
附图说明
图1.实验安排方案及实验动物分组图。大鼠分成不同的实验组，各自进行 不同的结扎或手术处理。MI-Nor组：行冠状动脉左前降支结扎手术+正常给氧； MI-IH组：行冠状动脉左前降支结扎手术+间歇性低氧处理。另两组各自进行 假手术，分别作为MI-Nor组和MI-IH组的对照。S-Nor组：假手术+正常给氧； S-IH组：假手术+间歇性低氧处理。
图2.间歇性低氧治疗对大鼠心脏射血分数(EF)、左心室舒张末期内径 (LVDD)的影响。射血分数(EF，A)和左心室舒张末期内径(LVDD，B)的超声心动 测量。假手术动物的EF或LVDD仅呈现微小的变化。在MI后，EF逐渐下降且LVDD 逐渐上升，但是在MI 21天、35天(处理14天、28天)后，MI-IH组心脏收缩功能 与常氧处理的大鼠(MI-Nor组)的心脏更好(p＜0.05)。
图3.M型超声心动图显示间歇性低氧治疗后大鼠心功能的改变。代表性M- 性影像。心肌梗塞的间歇性低氧(IH)处理与提高的左心室功能相关。A：在MI 21 天(处理14天)后的M型影像，呈现显著的心腔扩大和左室前壁运动减弱。B：在 MI后21天(处理后14天)MI-IH组的M型影像，心室扩张降低和心脏收缩功能改 善。C和D：MI后35天(处理28天)，左心室扩张且前壁运动异常在MI-Nor组中持 续，但在MI-IH组中消失了。
图4.间歇性低氧治疗减少心肌梗塞面积。Evan’s蓝和TTC染色。A.由 Evan’s蓝确定心肌梗塞面积，而非梗塞的(染成红色)和梗塞的(未染色)区域 在与1％氯化三苯基四氮唑孵育后确定。B.以冠状动脉左前降支结扎手术后21天 和35天(处理后14天和28天)的心肌梗塞面积的百分数表示的心肌梗塞面积。结 果以每组4-5个心脏的平均值±标准误差来表示。与MI-Nor组相比，*p＜0.05。
图5.间歇性低氧治疗促进心肌微血管的增生。免疫组织化学染色梗塞组织 的外周的CD34。A.S-Nor(a)，S-IH(b)，MI-Nor(c)，MI-IH(d)组在MI 21 天后(14天IH或正常含氧量处理后)的免疫组化染色。B.S-Nor(a)，S-IH(b)， MI-Nor(c)，MI-IH(d)组在MI35天后(28天IH或含氧量处理后)的免疫组化染 色。可观察到毛细血管的内皮细胞变薄且缺少平滑肌细胞，刻度标记为50μm。 C.每mm2梗塞区域中IH处理对于毛细血管的平均数的影响，与MI-Nor相比，毛细 血管的平均数明显增加(*p＜0.05，**p＜0.01，MI-IH)。
图6.间歇性低氧治疗促进心肌组织VEGF蛋白的表达。A.假手术、冠状动脉 左前降支结扎手术21和35天后，用大鼠心肌内免疫印迹来指示间歇性低氧处理 对于VEGF表达的影响；VEGF蛋白以25kDa表达。在6个独立的实验中获得相似的 结果(每个实验重复3次)。B.免疫印迹的平均光密度结果。VEGF蛋白含量以 Sham-Nor组的平均值百分比表示。与相应的常氧组相比，*p＜0.05，**p＜0.01。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究，发现间歇性低氧作为一种干预治疗手 段，对心肌梗塞具有缓解和治疗作用。所述间歇性低氧通过低氧系统(更特别 的为低氧舱)来实施。基于此，完成了本发明。
在本发明中，术语“间歇性低氧”是一种治疗干预手段，指间隔给予动物 低氧-常氧-低氧循环的环境。
在本发明中，术语“低氧”是指氧分压Po2＝84±20mmHg或11.2±2.8kPa；更 特别的，氧分压Po2＝84±10mmHg或11.2±1.4kPa；最佳的，氧分压Po2＝84±5mmHg 或11.2±0.5kPa。
在本发明中，术语“常氧”是指氧分压Po2＝159±20mmHg(或20.7kPa±3kPa)； 更特别的，氧分压Po2＝159±10mmHg(或20.7kPa±1.5kPa)；更佳的，氧分压Po2＝159 ±5mmHg(或20.7kPa±0.5kPa)。
在本发明中，“低氧系统”是指一种可制造低氧环境的设备，其也可称为 “低氧设备”、“低氧舱”、“低压氧舱”等。
本发明人的研究结果显示，在大鼠心肌梗塞后，给予间歇性低氧治疗，即 每天在相当于5000米海拔高度(即Po2＝159±20mmHg或20.7kPa±3kPa)的低压氧 舱中生活4-8小时，然后恢复常氧环境，连续治疗10-30天后，间歇性低氧能明 显促进心梗后大鼠心功能的恢复，减少心梗面积，增加冠脉流量，促进微血管 的增生，对大鼠心肌梗塞有明显的改善作用。由此，提示间歇性低氧对于人的 心肌梗塞的缓解和治疗也可产生明显作用。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说 明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方 法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1
低氧系统
一种用于制备治疗心肌缺血、梗塞的氧气舱设备，所述的氧气舱设备包括一 个封闭的舱体，所述舱体中包括氧气供给装置，氧气排出装置，以及含氧量检测装 置，其中，所述的氧气供给装置提供氧气，所述的氧气排出装置可排出氧气。
该氧气舱可使得其内的氧气满足以下条件：氧分压Po2＝84±20mmHg或11.2± 2.8kPa。
在使用时，调节氧气供给装置，使氧气舱内的氧分压稳定在Po2＝84±1mmHg 或11.2±0.14kPa，将哺乳动物置于其内，维持有效长时间(如6小时)后，关闭氧气 供给装置，使氧气维持在常氧范围(Po2＝159mmHg±20mmHg(或20.7kPa±3kPa))小 时。重复上述步骤10-30天，即可达到治疗或缓解心肌梗塞的效果。
实施例2
动物分组和动物模型的建立
I.动物分组
雄性Sprague-Dawley大鼠(体重150-180克)均为清洁级动物，购自中国 科学院上海实验动物中心。如图1所示，按实验设计要求，大鼠被随机分组。
分组后，对其中一部分大鼠行冠状动脉左前降支结扎手术(LAD occlusion)，造成大鼠急性心肌梗塞。另一部分大鼠则作为假手术组(Sham surgery)，不对其冠状动脉进行结扎。术后在常温条件下密切观察7天。然后 大鼠被随机分组至常氧环境继续生活，或至低压氧舱中治疗。本发明人将心梗 后的大鼠置于低压氧舱中治疗14天和28天，即大鼠心梗7天后，每天在相当 于5000米海拔高度的低压氧舱中生活6小时，然后恢复至常氧环境，连续治 疗14天和28天(MI-IH组)。常氧组大鼠在心梗7天后，也在常氧条件下连续 生活14天和28天作为对照观察(MI-Nor组)。MI-IH和MI-Nor组分别设假手 术组Sham-IH，Sham-Nor。所有的大鼠分别在术前、术后7天、术后21天(治 疗14天)和术后35天(治疗28天)测量体重及动脉血压。
II.建立大鼠心肌梗塞模型
1.实验器械与试剂
包括：动物人工呼吸机(DW2000 volume-cycled rodent ventilator， Jiapen Technology，Co，Shanghai)、心电图仪、颈内动脉穿刺针、常规手术 器械、1％戊巴比妥钠、70％酒精、医用缝合线、6/0的医用无损伤缝合针、医用 透气胶布。
2.实验步骤
对大鼠心脏的冠状动脉左前降支进行结扎，使大鼠左心室前壁缺血造成心 肌梗塞。给予大鼠腹腔内注射1％戊巴比妥钠(50mg/kg)后，将大鼠置于手术板 上。颈部和左胸脱毛后，用70％酒精消毒。沿颈部正中切开然后逐层分离，暴 露气管。将颈内动脉穿刺针沿大鼠甲状软骨下气管第2-3软骨环缝隙内插入， 随后立即接上动物呼吸机，维持通气量45-50次/分。在左胸第3-4肋骨处， 打开胸腔，剪去心外膜，暴露心脏。冠状动脉左前降支一般沿左心房与肺动脉 圆锥之间的动脉沟出发，基本与室间隔平行前行。由左前降支出发点向后向下 约1-2mm处用6-0医用无损伤缝合针结扎，注意结扎时避免穿破心脏。结扎成 功后肉眼直接可观察到左心室前壁颜色改变，心脏收缩减弱。冠状动脉结扎后 逐层缝合，关闭胸腔。术后撤去呼吸机，几秒钟后待大鼠恢复自主呼吸，直接 接上心电图仪记录大鼠术后的心电。心电图监护可见肢导R波振幅升高，I， aVL导联ST段明显抬高，证明结扎成功。
实施例3
间歇性低氧对大鼠生理参数的影响
测量血液参数指标
在心梗手术后21天，35天(也即术后常氧或间歇性低氧治疗14天，28天)， 将大鼠麻醉后，从腹股沟动脉处采血1ml，分别测得外周血血红蛋白浓度、红 细胞记数和白细胞记数。
结果，各组大鼠体重、动脉血压、血红蛋白及红细胞计数值见表1。在术 后第7天，四组大鼠动脉血压基本一致。心梗手术后经间歇性低氧治疗14天， 28天后分别发现MI-IH组大鼠的血压值较常氧组(MI-Nor)升高(14天后， 间歇性低氧组比常氧组＝142.8±1.4比125.1±1.8，p＜0.01；28天后，间歇 性低氧组比常氧组＝153.1±1.5比132.8±1.7，p＜0.01)，但这些大鼠的血压 值均在生理范围内。由此可见，大鼠心肌梗塞后经间歇性低氧治疗14天和28 天，动脉血压值有一定程度的升高，但并未导致高血压。
大鼠心肌梗塞后经间歇性低氧治疗14天、28天，其血红蛋白值和红细胞 计数与常氧组(MI-Nor)相比，均无明显差异(p＞0.05)。心梗后IH治疗对血 红蛋白和红细胞计数无明显影响。
表1 各组大鼠体重、动脉血压、血红蛋白及红细胞计数值 sham/MI后天数 (处理天数) S-Nor S-IH MI-Nor MI-IH 体重(g) 21(14) 293.0±8.6 (n＝6) 298.8±12.7 (n＝5) 302.6±6.9 (n＝12) 299.7±9.5 (n＝10) 35(28) 350.2± 10.7(n＝6) 353.4±6.6 (n＝5) 359.9±9.8 (n＝18) 352.9±10.6 (n＝20) 动脉血压 (mmHg) 21(14) 133.0±1.8 (n＝13) 138.8±2.1 (n＝13) 125.1±1.8 (n＝36)** 142.8±1.4 (n＝44) 35(28) 145.9±3.8 (n＝7) 151.9±3.8 (n＝7) 132.8±1.7 (n＝15)** 153.1±1.5 (n＝20) 血红蛋白 (g/100ml) 21(14) 15.0±1.0 (n＝9) 17.8±1.0 (n＝7) 16.8±1.2 (n＝15) 20.2±1.4 (n＝10) 35(28) 16.2±1.0 (n＝6) 16.2±1.6 (n＝5) 15.6±0.8 (n＝11) 18.9±0.8 (n＝10) 红细胞计 数(1012个 /L) 21(14) 7.6±0.3 (n＝7) 8.2±0.4 (n＝6) 9.0±0.7 (n＝14) 11.1±0.7 (n＝13) 35(28) 9.3±0.3 (n＝6) 9.6±0.5 (n＝5) 8.9±0.7 (n＝11) 11.0±0.9 (n＝11)
与相应的假手术值相比，*p＜0.05；与相应的正常含氧值相比，**p＜0.01； p＜0.05，p＜0.01。
实施例4
间歇性低氧对大鼠心功能具有保护作用
1.离体心脏Langendorff灌流
1)灌流液Krebs-Henseleit buffe(mM)：118 NaCl，4.7 KCl，1.2 KH2PO4， 1.2 MgSO4，1.8 CaCl·2H2O，25 NaHCO3，11 Glucose。超纯水配置，pH7.4， 以95％O2，5％CO2混合气体充灌30分钟。
2)恒压Langendorff灌流装置：此系统主要由管道系统、恒温系统、氧合 器和恒流泵组成。氧合器用于灌流液的供氧；恒流泵用于控制灌流系统的灌注 压，本实验灌注压恒定于80mmHg；恒温系统则使灌流液保持恒定温度，本实验 所用灌流液温度为37℃。
3)实验操作：雄性S.D大鼠，1％戊巴比妥钠(50mg/kg)腹腔内注射麻醉。 仰位固定，打开胸腔，迅速取出心脏置于冰冷的K-H液中(4℃)；剪开心包， 分离主动脉，将充满灌流液的套管插入主动脉，结扎固定；注入灌流液排出心 脏内剩余血液，将主动脉套管快速连于Langendorff灌流装置。在左心房侧壁 剪一小口，将小乳胶水囊通过房室瓣插入左心室。和乳胶水囊相连的导管通过 三通管连接压力转换器。压力转换器(model Gould P23 Db，AC Instrument Ltd. Australia)信号通过桥式放大器输入多导记录系统(PowerLab system， Australia)，通过计算机运行chart软件完成信号的实时采集和处理。流量检 测装置直接连于多导记录系统，记录冠脉流量(CF)。记录的心功能参数包括心 率(HR)、左心室舒张末压(LVEDP)、左心室峰压(LVPSP)、左心室发展压 (LVDP＝LVPSP-LVEDP)、左心室等容期压力最大变化速率(±LVdp/dt max)。离 体心脏经20分钟平衡灌流后，取下心脏，液氮速冻，用于分子生物学检测； 或10％中性福尔马林固定，用于病理学检测；或进行Evan’s染色，测量心肌 梗塞面积。
结果如表2所示，经常氧或间歇性低氧处理14天，28天后，各组大鼠心 率值基本一致。离体心脏Langendorff灌流显示MI-Nor组与MI-IH组之间心 脏收缩功能有显著差异，主要表现在LVDP，±LVdp/dt数值上。在假手术组大 鼠(sham groups)，除冠脉流量之外，其各项心功能参数在常氧组与间歇性低 氧组之间均无明显变化(S-Nor比S-IH，p＞0.05)。心肌梗塞大鼠在间歇性低 氧治疗14天和28天后，与常氧组相比，LVDP，±LVdp/dt max各项指标均有 明显改善。心肌梗塞后经间歇性低氧治疗一段时间，可促进大鼠心功能的恢复。
在假手术组大鼠，经IH处理14天和28天后，与常氧组比较，冠脉流量 明显增加(14天，间歇性低氧组比常氧组＝21.2±0.8比15.1±1.5，p＜0.01； 28天，间歇性低氧组比常氧组＝18.9±2.4比13.2±0.8，p＜0.01)，CF值分别 增加了40.9％和43.9％。同样，心梗后的大鼠经IH治疗14天，28天后，与常 氧组相比，CF也显著增加(14天，间歇性低氧组比常氧组＝15.9±0.6比12.5 ±0.6，p＜0.05；28天，间歇性低氧组比常氧组＝16.6±0.6比12.7±0.8，p＜0.05)， CF值分别增加了26.8％和30.8％。这说明间歇性低氧的参与能明显增加冠脉流 量，改善心肌缺血状态。
表2.IH治疗对大鼠离体心功能指标的影响 sham/MI后 天数 (处理天数) 值 S-Nor S-IH MI-Nor MI-IH 21(14) n＝6 n＝5 n＝17 n＝15 HR(BPM) CF(ml/min) LVPSP(mmHg) LVEDP(mmHg) LVDP(mmHg) +dP/dtmax(mmHg/s) -dP/dtmax(mmHg/s) 333.1±12.1 15.1±1.5 102.7±5.5 10.4±0.6 92.4±5.7 2924.1±135.2 -2439.7±179.4 321.9±7.5 21.2±0.8 107.3±4.9 9.0±0.8 98.3±5.2 3017.6±82.9 -2375.3±130.1 286.6±12.3 12.5±0.6* 69.4±4.9** 7.4±0.8 62.1±4.9* 1647.6±151.5** -1381.5±125.3** 314.1±7.3 15.9±0.6** 95.9±6.7 6.7±0.9 89.2±6.8 2266.9±173.9* -1944.6±131.2 35(28) n＝7 n＝5 n＝15 n＝19 HR(BPM) CF(ml/min) LVPSP(mmHg) LVEDP(mmHg) LVDP(mmHg) +dP/dtmax(mmHg/s) -dP/dtmax(mmHg/s) 290.0±22.2 13.2±0.8 113.7±5.1 9.6±1.4 104.0±5.6 3263.2±188.2 -2370.2±114.8 299.4±15.5 18.9±2.4 102.2±7.3 8.9±0.4 93.4±7.6 3098.2±127.0 -2348.8±181.7 296.0±8.5 12.7±0.8 69.4±3.7** 9.2±0.5 60.2±3.6** 1900.3±148.9** -1368.9±84.8** 292.5±11.9 16.6±0.6 90.1±5.5 8.9±0.2 81.1±5.4 2568.6±158.9 -1845.9±126.5
与相应的假手术值相比，*p＜0.05，**p＜0.01；与相应的常氧组相比， p＜0.05，p＜0.01。
2.超声心动图评价
所有试验动物在心梗前，心梗后第7天，第21天及第35天均进行了经胸 超声心动图检查。以往的报道已经证实了大鼠经胸超声心动图的精确性和可重 复性。超声心动图使用商业购买的15-MHz线阵探头(Philips Sonos 5500成像 系统，S12)进行，检查期间所有大鼠均用戊巴比妥钠麻醉，平卧位于左侧胸骨 旁切面记录图像。采用二维超声引导下M型超声心动图，在心室腔最大的短轴 切面上测量室间隔厚度(IVS)，左室后壁厚度(LVPW)，左室舒张末期内径(LVDD)， 左室收缩末期内径(LVDS)。仪器将自动计算出左室射血分数(EF)，以及短轴缩 短率(FS)。所有的测量均由一位有经验的且不知道分组情况的技术员进行，所 有测值均为3个连续心动周期的平均值。心梗后第七天EF≥90％的大鼠视为心 梗不显著而被剔除。
术前，心梗后第7天，第21天(即治疗后第14天)，以及术后第35天(即 治疗后第28天)的超声心动图测值列于表3。各组在术前超声心动图指标无显 著差异。冠脉结扎后第7天，IH治疗的MI组(MI-IH)以及常氧(normoxia)治疗 的MI组(MI-Nor)的所有心超指标较术前均有显著变化，室间隔厚度(IVS)变薄， 分别下降18.2％和19.4％；左心室舒张末期内径(LVDD)扩张27.8-36.7％，射血 分数(EF)和短轴缩短率(FS)分别下降27.9-29％和45.8-46.9％。心梗后第7天， MI-IH组与MI-Nor两组之间各指标无统计学差异，但与假手术组相比，两个心 梗组的指标均有显著变化。这提示心梗模型的成功建立，而且MI-IH组与MI-Nor 组的基础水平具有可比性。
如图2A所示，在整个实验过程中，sham组大鼠射血分数(EF％)在各个时间 点，其数值基本保持稳定。MI-Nor组大鼠在心梗手术后7天，EF值明显下降 (92.6％比66.7％)，而且随时间的延长，其EF值始终维持在较低水平。MI-IH 组大鼠在心梗术后7天EF值下降至65.5％，但经间歇性低氧治疗14天后，其 EF值与MI-Nor组相比显著上升(MI-IH比MI-Nor＝71.5±2.7％比58.2±3.5％， p＜0.05)。在IH治疗28天后，MI-IH与MI-Nor二组之间EF值的差异仍然十分 显著(MI-IH比MI-Nor＝72.5±3.6％比60.6±3.5％，p＜0.05)。
如图2B所示，在整个实验过程中，sham组大鼠左室舒张末期内径(LVDD) 在各个时间点无明显变化。冠脉结扎术后7天，MI-Nor与MI-IH二组大鼠LVDD 明显扩大(MI-Nor组由0.5020.008至0.6420.021，p＜0.05；MI-IH组由 0.4630.029至0.6330.016，p＜0.05)。心梗后第21天(即治疗后14天)，MI-Nor 组大鼠LVDD继续显著扩大，而MI-IH组大鼠经间歇性低氧治疗，其LVDD增加 程度明显低于MI-Nor组(0.8220.03比0.7080.03，p＜0.05)。该现象在心梗后 第35天(即治疗后28天)仍然明显(0.8740.05比0.7550.03，p＜0.05)。
M型超声心动图显示(图3)，与MI-Nor组左室前壁收缩减弱或收缩消失形 成对比，梗死的心脏在接受间歇性低氧治疗14天后(MI-IH)左室前壁运动改善， IH阻止LVDD的进一步扩大，心室功能良好。2周后，MI-Nor组仍持续存在左 室扩张和前壁运动异常，而MI-IH组在IH治疗28天后上述现象消失，心脏收 缩功能明显改善。
实施例5
间歇性低氧减少心肌梗塞面积
1)试剂：Evan’s蓝染料(Sigma)
氯化三苯基四氮唑(TTC)(Sigma)
0.05M PBS缓冲液 0.2M磷酸缓冲液(pH7.4)
2)步骤：离体心脏灌流后，从Langendorff灌流装置上取下心脏，由主动 脉内注入1ml 0.5-1％的Evan’s染料，将正常心肌与缺血区心肌(area at risk) 区分开。然后用生理盐水冲洗干净，将心脏放于液氮中快速冷冻20min。由液 氮中取出心脏，顺房室沟从心尖部至心基部平行将大鼠心室切成0.1-0.2cm厚 的心肌片，将心肌片放在1％TTC溶液中37℃温孵10-15min。染色过程中不时 摇动染色液使之与心肌充分接触。染色后立即用水冲洗去多余的染料。心肌梗 死区不着色，呈灰白色；缺血但仍存活的心肌被TTC染成红色。染色结束后将 心肌切片置于10％中性福尔马林溶液中固定，以增强染色强度。将染色后的心 肌切片平铺于二块载玻片之间，照相，扫描，用电脑软件图像分析法(image-pro plus 5.0)确定心肌梗死的面积。心肌梗死范围以每一心脏总梗死面积(IF)占 总缺血区面积(area at risk，AR)的百分比表示。
离体心脏灌流后，取下心脏，用Evan′s蓝和1％TTC染色后，计算心肌梗 塞面积。结果显示(图4)，心梗后21天(即治疗后14天)MI-IH组心梗面积为 21.7±3.1％，与MI-Nor组35.9±4.3％相比，明显减少(p＜0.05)。在心梗后35 天(即治疗后28天)，MI-Nor组心梗面积达到55.0±6.4％，而MI-IH组经间歇 性低氧治疗，心梗面积缩小至32.6±4.2％，二者存在显著差异(p＜0.05)。所以， 大鼠心肌梗塞后经间歇性低氧治疗14天、28天，可有效减少心梗面积，提高 心肌的存活能力，对心脏起到保护作用。
实施例6
间歇性低氧促进心肌微血管形成
(1)试剂
二甲苯 无水酒精 95％酒精 3％H2O2(甲醇)
0.01M PBS缓冲液pH 7.2-7.6
0.1M枸橼酸盐缓冲液(pH 6.0)
DAB显色剂
小鼠抗大鼠CD34单克隆抗体，使用浓度1∶100(Santa Cruz Biotechnology， Santa Cruz，CA)
羊抗鼠二抗(即用型，长岛公司EnVisionTM试剂)
(2)免疫组织化学染色
离体心脏灌流后，取下心脏，用生理盐水冲洗干净，10％中性福尔马林固 定心脏标本。顺房室沟由心尖部至冠状动脉左前降支结扎处平行切取三块心脏 组织，厚约2mm。常规石蜡包埋后，采用免疫组织化学EnVision二步法进行染 色。玻片经APES(Sigma公司)、丙酮预处理，4～5um厚石蜡切片，60℃烘烤 2h。二甲苯脱蜡，梯度乙醇入水。3％H2O2(甲醇)溶液孵育20min，灭活内源性过 氧化物酶活性，蒸馏水漂洗。切片置于pH 6.0的枸橼酸盐缓冲液内，微波抗 原修复98℃15min，室温冷却20min后PBS漂洗3次；然后滴加一抗，4℃湿 盒孵育过夜。PBS漂洗3次，EnVisionTM二抗室温孵育30min，PBS漂洗3次， DAB显色，苏木精衬染，常规梯度乙醇脱水，树脂封片。以PBS缓冲液代替一 抗作为阴性对照。
(3)CD34免疫组化染色可以显示血管内皮细胞
心肌细胞之间微血管呈单个内皮或成簇内皮细胞阳性。每个标本选三张切 片，每一张切片选取5个血管密度最多的区域，然后在400倍视野下分别记数 毛细血管数目，取其平均值。
计算毛细血管密度(/mm2)＝平均毛细血管数/400倍视野(0.2mm2)，观察 心肌内毛细血管数量的变化。
结果：本实施例应用免疫组织化学染色方法，用CD34抗体标记血管内皮 细胞，来反映心肌组织中血管增生的情况。心肌梗死后在梗塞区周围的心内膜 下可见较多新生毛细血管，每张切片选取五个不重叠的区域，在高倍视野下 (×400倍)计数毛细血管密度(/mm2)。结果显示，心梗后21天(即治疗后14天)， MI-IH组经间歇性低氧治疗，与常氧组MI-Nor相比，毛细血管密度显著增加(624 ±40.7比397.1±42.5/mm2，p＜0.05)。从图5可见，MI-IH组在心梗周围毛 细血管增生活跃，排列密集。心梗后35天(即治疗后28天)，MI-IH组毛细血 管密度进一步增加，与MI-Nor组之间继续存在显著差异(MI-IH比MI-Nor＝ 919.3±98.4比516.4±50.7，p＜0.05)。
由此可见，间歇性低氧治疗可促进心肌梗塞后心肌微血管的增生，改善心 肌的缺血程度。
实施例7.
间歇性低氧促进VEGF蛋白的表达
(1)试剂和溶液
二硫苏糖醇(DTT)、Tween-20、十二烷基硫酸钠(SDS)、牛血清白蛋白(BSA)、 蛋白酶抑制剂(Protease Inhibitor Cocktail)
一级抗体小鼠抗大鼠VEGF购自Santa Cruz公司(Santa Cruz Biotechnology，Santa Cruz，CA)
二级抗体HRP酶标羊抗鼠IgG、蛋白电泳分子量标准品均购自 Sigma公司(St.Louis，MO，USA)；
Triton X-100、苯甲基磺酰氟(PMSF)、TEMED购自MERCK公司(Merck KGaA， 64271 Darmstadt，Germany)；
丙烯酰胺(Acrylamide)、双丙烯酰胺(Bisacrylamide)为Fluka公司产品 (Buchs，Switzerland)；
硝化纤维素膜购自Amersham公司(Buckinghamshire，UK)；
化学荧光显色剂-Western Blotting Chemiluminescence Reagent，购 自PE公司(PerkinElmer Life Science.Inc)
其它化学试剂包括Tris-Base、Glycine、EDTA、sodium vanadate、Coomassie Brilliant Blue G-250、Coomassie Brilliant Blue R-250、Bromophenol Blue 等均为分析纯级国产试剂。
匀浆缓冲液A(mM)：Tris 50.0，pH 7.4，EDTA 1.0，DTT 0.5，PMSF 0.4， Na3VO4 1.0，Protease Inhibitor Cocktail 0.02％(V/V)，pH 7.4；
Bradford蛋白测定液：乙醇95％w/v，磷酸85％w/v和超纯水以1∶2∶17 的体积混合加入终浓度为0.1mg/ml的Coomassie Brilliant Blue G-250， 以滤纸抽气过滤；
2倍样本缓冲液(mM)：Tris-HCl 125.0，SDS 4.0％(w/v)，Bromophenol Blue 0.005％(w/v)，Sucrose 350.0，DTT 150.0，pH 6.8；
丙烯酰胺贮备液：30g丙烯酰胺和0.8g双丙烯酰胺溶于超纯水，终体 积为100ml，以定性滤纸过滤，4℃避光存放；
8倍分离胶缓冲液贮备液：Tris-HCl(pH 8.8)3.0M，SDS 1.0％(w/v)，4 ℃存放备用；
4倍浓缩胶缓冲液贮备液：Tris-HCl(pH 6.8)0.5M，SDS 0.4％(w/v)，4 ℃存放备用；
浓缩胶贮备液：丙烯酰胺贮备液16.7％(v/v)，4倍浓缩胶缓冲液贮备液 25％(v/v)，4℃避光存放；
10％过硫酸铵(w/v)：使用前新鲜配制，一周内使用；
电泳槽电极液：Tris-Base 25mM，Glycine 0.25M，SDS 0.1％(w/v)，pH 8.3；
转移槽电极液：Tris-Base 25mM，Glycine 192mM，甲醇20％(v/v)，pH 8.3；
TBST缓冲液(Tris-Buffer Saline containing Tween-20)：Tris-Base 20 mM，NaCl 137mM，Tween-20 0.1％(v/v)，pH 7.6；
抗体封闭液：含有2％BSA的TBST缓冲液。
(2)蛋白的提取分离和定量
蛋白的提取分离(以下所有操作均在冰水浴或低温下进行)
心肌组织(约50～100mg)自液氮中取出，加入0.5ml预冷的匀浆缓冲液， 在4℃以高速匀浆机将心肌组织彻底匀浆，匀浆后置于冰上30min。将匀浆液 倒入1.5ml Eppendorff管，在4℃以10,000g/min的速度离心20min， 将离心分层后的上清液分装，置-70℃冰箱内保存。
Bradford法蛋白定量
以高纯度BSA作为标准蛋白(1mg/ml)绘制标准曲线，取10μl的样本加 入1ml的Bradford蛋白测定液，混合均匀；室温静置五分钟后，以紫外可见 光光度计(Lambda 2S UV/VIS型Perkin Elmer公司Germany)读取595nm之 OD值，通过标准曲线计算出样本的蛋白浓度。
(3)十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)
变性蛋白质样本的制备
取50μg的蛋白样本加入4倍蛋白样本缓冲液，混合均匀，在沸水浴中 煮沸10min后，立即放入0℃的冰水浴中冷却并分装，置-70℃冰箱冷藏。
SDS-PAGE凝胶(12％)的制备
加入3.2ml的30％丙烯酰胺贮备液、1ml的8倍分离胶缓冲贮备液和3.8ml 的超纯水，混合均匀；再加入10％的过硫酸铵80μl和TEMED 8μl，迅速搅 拌混匀，倒入装置好的玻璃槽中约4/5高，上面轻轻地覆以超纯水隔离胶体与 空气，并使表面平整；待胶体凝结后，倒掉纯水，并以超纯水冲洗干净，以定 性滤纸吸干表面水分，取配制好的浓缩胶(5％贮备液)3ml，加入10％的过硫酸 铵30μl和TEMED 3μl，迅速均匀后，倒入玻璃槽内，插入样品梳，待胶体 凝结后取出样品梳。
电泳
在电泳槽内加入电泳槽电极液，赶出样品槽内的气泡。在样品槽内分别加 入蛋白电泳分子量标准品阳性对照和蛋白样本，样本上样量均为50μg；接通 电源，先以80V的恒压电泳40min，再以120V的恒压继续电泳约2-3h， 至溴酚兰染料跑至凝胶底部结束电泳。
转膜
将取下的SDS-PAGE电泳胶体、硝化纤维素膜、定性滤纸以及纤维垫放在 电泳槽转移液内，以夹三明治方式(中间为胶体和硝化纤维素膜，外面分别夹 以滤纸和纤维垫)夹牢，彻底清除内部的气泡；然后放入装满电极液的转移槽 内；正确接通电极和电源，通以150mA的恒流约4h，将胶体上的蛋白质转印 到硝化纤维素膜上。
抗体标记
将转印有蛋白的硝化纤维素膜取出，标记方向和蛋白分子量标准印记；然 后浸入抗体封闭液，摇床上室温下孵育2h以封闭非特异性蛋白结合位点；将 硝化纤维素膜浸于含有一抗(Primary antibody：anti-VEGF 1∶1000稀释)的一 抗孵育液中，4℃孵育过夜，以TBST于摇床上洗膜10min×3次。将硝化纤 维素膜浸入含有辣根过氧化酶标记的二级抗体(Secondary antibody，Goat anti-mouse horseradish peroxidase 1∶5000)的二抗孵育液中，室温下摇晃 孵育2h，再以TBST洗膜15min×3次。
显色成像
利用辣根过氧化酶显色剂的化学荧光方法，使X感光胶片成像来检测相关 蛋白的位置及其含量；用扫描仪将图像输入计算机再用蛋白条带分析软件 Gel-Pro Analyzer 3.0，Media Cybernetics，USA来对相关蛋白进行定量。
数据处理
所有数据均以均数±标准误差(mean±S.E)表示。不同处理组之间比较通 过单因素方差分析ANOVA或Student’st检验进行。P＜0.05时差异具有显著 性。
Western Blot免疫印迹法检测心肌组织中VEGF蛋白的表达，结果显示(图 6)，大鼠心肌梗塞后21天(即治疗后14天)，间歇性低氧组(MI-IH)VEGF表达 值为247±34.1，显著高于常氧组(MI-Nor)134.6±19.7(p＜0.05)。在心梗后35 天(即治疗后28天)，这二组VEGF表达的差异依旧十分显著(MI-IH 2 44.9± 26.7比MI-Nor 123.5±5.3，p＜0.01)。这提示间歇性低氧治疗可提高大鼠心 肌梗塞后心肌组织中VEGF蛋白的表达，进而促进微血管的增生。
综上，本发明证实了间歇性低氧对大鼠心肌梗塞具有明显的治疗作用。IH 能促进梗塞后大鼠心功能的恢复，减少心肌梗塞面积。IH通过诱导VEGF表达 增强，促进心肌组织内微血管增生，减少心肌细胞损伤，对大鼠心肌梗塞有显 著的改善作用。间歇性低氧作为一种新的干预治疗手段，为心肌梗塞的临床治 疗提供了新的途径。
讨论
本发明在大鼠心肌梗塞后，将间歇性低氧作为一种干预治疗手段，研究间 歇性低氧治疗对大鼠心肌梗塞是否具有保护作用。研究结果第一次表明，在相 当于海拔高度5000米的低压氧舱中给予间歇性低氧治疗14天和28天，对于 缺血和梗塞的心肌均具有明显的改善作用。这一新的心肌保护作用具体表现 在：通过IH治疗，可改善大鼠心梗后的心功能，有助于心功能的恢复；有效 地减少心肌梗塞面积，提高心肌的存活能力；增加心肌组织内VEGF蛋白的表 达，从而促进心肌内毛细血管的增生，增加冠状动脉流量，改善心肌缺血程度。 同时，经IH治疗14天和28天后，与常氧对照组相比，大鼠外周血中血红蛋 白浓度和红细胞计数没有明显增加，表明IH对心肌梗塞的治疗并不影响这二 者的水平，从而可减少因血细胞容积增多导致血栓形成的危险性。因此，本发 明的研究结果表明，IH治疗对大鼠慢性心肌缺血损伤具有一定的保护作用。
以往过多的研究集中在缺血预适应(ischemic preconditioning)对心肌的 保护方面。心肌缺血预适应(IPC)是指心肌在经历了一次或多次短暂的缺血/再 灌注后，对随后发生的长时间缺血损伤的耐受性明显增强。此现象在1986年 首次发现以来，已在不同种属动物、不同脏器得到验证，说明IPC是广泛存在 的机体保护性防御反应。间歇性低氧适应能提高心肌对缺血/再灌注损伤的耐 受性)；提高心肌的抗氧化能力和对氧的利用能力，减少再灌注性心律失常；减 轻心肌细胞坏死和凋亡，促进心肌功能的恢复等。间歇性低氧能提高心肌抗缺 血缺氧能力，对提高人体健康状况和运动能力具有积极的意义。目前，许多实 验都是将间歇性低氧作为一种预适应手段(IH preconditioning)，而未见有关 将间歇性低氧用于治疗方面的研究报道。本发明第一次将间歇性低氧用于大鼠 心肌梗塞后的治疗。结果发现，IH同样也具有明显的治疗作用，可改善心肌梗 死后的心功能，促进心肌组织内血管的增生等。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献 被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后， 本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申 请所附权利要求书所限定的范围。