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1、10申请公布号CN104059169A43申请公布日20140924CN104059169A21申请号201410257053122申请日20140611CGMCCNO911120140429C08B37/08200601C12P19/26200601C12R1/4620060171申请人滨州安华生物工程有限公司地址256600山东省滨州市黄河十二路渤海二十四路西首72发明人韩秀云74专利代理机构济南舜源专利事务所有限公司37205代理人于晓晓54发明名称一种透明质酸的提纯工艺57摘要本发明公开了一种透明质酸的提纯工艺。本发明采用添加活性炭、珍珠岩、白硅藻土、EDTA结合大板框过滤技术去除透明。
2、质酸中的杂质，添加剂常见易得，操作相对简单，杂质含量更低。生产易于控制，适合工业化大规模生产，收率高，并且大大降低了生产成本。83生物保藏信息51INTCL权利要求书1页说明书4页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书4页10申请公布号CN104059169ACN104059169A1/1页21一种透明质酸的提纯工艺，其特征在于，该透明质酸采用兽疫链球菌（STREPTOCOCCUSZOOEPIDEMICUS）AWA008发酵结束后压入沉淀罐中，兽疫链球菌（STREPTOCOCCUSZOOEPIDEMICUS）AWA008保藏编号是CGMCCNO9111，保藏日期是。
3、2014年04月29日；提纯工艺包括以下步骤（1）前沉淀向沉淀罐里在搅拌情况下缓缓地加入9098的酒精，至产生雪花状沉淀，控制温度，收集沉淀物；（2）溶解用氯化钠溶液将沉淀物溶解，调节PH至9395，加入EDTA、活性炭、珍珠岩，搅拌均匀；（3）过滤将溶解后的料液压入1大板框过滤一遍后，过滤液调PH9395；再加入白硅藻土和珍珠岩后，搅拌均匀后，压入2大板框过滤第二遍；二遍过滤液中加入硅藻土，搅拌均匀后，料液通过不锈钢板打循环澄清后，过滤第三遍，澄清度在995以上，然后过滤液通过聚丙烯滤芯过滤至洁净间沉淀罐；（4）后沉淀料液调PH至7073，搅拌下缓缓地加入95酒精至沉淀产生，控制酒精度数47。
4、50度即可；静止2040分钟后将上清液打入废酒精罐；（5）脱水离心用7580的PH值在7073之间的酒精脱水67次，然后再用90的酒精脱水23次，脱水后酒精度数到90以上，静止13小时，打走上清液，取样测PH值，并控制在7073之间；搅拌1520分钟后离心；（6）干燥。2根据权利要求1所述的一种透明质酸的提纯工艺，其特征在于，步骤（1）中酒精浓度为95。3根据权利要求1所述的一种透明质酸的提纯工艺，其特征在于，步骤（1）中温度为4750度。4根据权利要求1所述的一种透明质酸的提纯工艺，其特征在于，步骤（2）氯化钠溶液浓度为15。5根据权利要求1所述的一种透明质酸的提纯工艺，其特征在于，步骤（2。
5、）中，加入EDTA、活性炭、珍珠岩质量比为，110152030。6根据权利要求1所述的一种透明质酸的提纯工艺，其特征在于，步骤（2）中，加入EDTA、活性炭、珍珠岩质量比为，11125。7根据权利要求1所述的一种透明质酸的提纯工艺，其特征在于，步骤（3）中，白硅藻土和珍珠岩的质量比为1110。8根据权利要求1所述的一种透明质酸的提纯工艺，其特征在于，步骤（3）中，白硅藻土和珍珠岩的质量比为115。9根据权利要求1所述的一种透明质酸的提纯工艺，其特征在于，步骤（3）中过滤液通过022微米聚丙烯滤芯过滤至洁净间沉淀罐。10根据权利要求1所述的一种透明质酸的提纯工艺，其特征在于，步骤（6）具体为将离。
6、心好的物料放入干燥罐，设定温度30，抽真空干燥3小时后，每小时升温5，设温60时停止，检测水分，水分小于7后出罐。权利要求书CN104059169A1/4页3一种透明质酸的提纯工艺技术领域0001本发明涉及生物多糖提取技术领域，特别是涉及一种透明质酸的提纯工艺。背景技术0002国内目前有十几家透明质酸的生产厂家，且这些企业大多数是用动物组织提取法。从动物组织中提取常用的原料有鸡冠、脐带和猪皮等，主要工艺过程包括脱水、磨碎、浸泡、提取、除杂、沉淀和分离。这种方法的特点是工艺流程简单，适用于原料来源分散的小规模生产。但由于原料有限，且原料中的含量低，同时又还与硫酸软骨素等粘多糖共存于生物组织中，致。
7、使其收率低、提纯难、成本过高、产品质量差，且难以应用于大规模生产。随着需求量的不断增大，迫切要求生产大量的高质量，动物组织提取法己不能适应这种要求。国外从上世纪70年代开始研究利用发酵法生产透明质酸，采用发酵法生产的透明质酸质量稳定、原料易得，成本低。0003目前微生物发酵法生产透明质酸采用的工艺发酵周期长、产物相对分子量低、产品透光率差、蛋白质含量高、葡萄糖醛酸含量低。有的透明质酸的形态为纤维状，不易溶解。发明内容0004本发明的目的就是针对上述存在的缺陷而提供一种透明质酸的提纯工艺。本发明采用添加活性炭、珍珠岩、白硅藻土、EDTA结合大板框过滤技术去除透明质酸中的杂质，添加剂常见易得，操作。
8、相对简单，杂质含量更低。生产易于控制，适合工业化大规模生产，收率高，并且大大降低了生产成本。0005本发明的一种透明质酸的提纯工艺技术方案为，该透明质酸采用兽疫链球菌（STREPTOCOCCUSZOOEPIDEMICUS）AWA008发酵结束后压入沉淀罐中，兽疫链球菌（STREPTOCOCCUSZOOEPIDEMICUS）AWA008保藏编号是CGMCCNO9111，保藏日期是2014年04月29日；提纯工艺包括以下步骤（1）前沉淀向沉淀罐里在搅拌情况下缓缓地加入9098的酒精，至产生雪花状沉淀，控制温度，收集沉淀物；（2）溶解用氯化钠溶液将沉淀物溶解，调节PH至9395，加入EDTA、活性炭。
9、、珍珠岩，搅拌均匀；（3）过滤将溶解后的料液压入1大板框过滤一遍后，过滤液调PH9395。再加入白硅藻土和珍珠岩后，搅拌均匀后，压入2大板框过滤第二遍。二遍过滤液中加入硅藻土，搅拌均匀后，料液通过不锈钢板打循环澄清后，过滤第三遍，澄清度在995以上，然后过滤液通过聚丙烯滤芯过滤至洁净间沉淀罐；（4）后沉淀料液调PH至7073，搅拌下缓缓地加入95酒精至沉淀产生，控制酒精度数4750度即可。静止2040分钟后将上清液打入废酒精罐；（5）脱水离心用7580的PH值在7073之间的酒精脱水67次，然后再用90的酒精脱水23次，脱水后酒精度数到90以上，静止13小时，打走上清液，取样测PH值，说明书C。
10、N104059169A2/4页4并控制在7073之间。搅拌1520分钟后离心；（6）干燥。0006优选的，步骤（1）中酒精浓度为95，步骤（1）中温度为4750度。0007步骤（2）氯化钠溶液浓度为15。0008步骤（2）中，加入EDTA、活性炭、珍珠岩质量比为，110152030。0009优选的，步骤（2）中，加入EDTA、活性炭、珍珠岩质量比为，11125。0010步骤（3）中，白硅藻土和珍珠岩的质量比为1110。0011优选的，步骤（3）中，白硅藻土和珍珠岩的质量比为115。0012步骤（3）中过滤液通过022微米聚丙烯滤芯过滤至洁净间沉淀罐。0013步骤（6）具体为将离心好的物料放入干。
11、燥罐，设定温度30，抽真空干燥3小时后，每小时升温5，设温60时停止，检测水分，水分小于7后出罐。0014一种兽疫链球菌（STREPTOCOCCUSZOOEPIDEMICUS）AWA008，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，其保藏编号是CGMCCNO9111，保藏日期是2014年04月29日。0015目前该兽疫链球菌在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编100101，其保藏编号是CGMCCNO9111，菌种的拉丁文名称是STREPTOCOCCUSZOOEPIDEMICUS，参据的微生物（株）AWA008，保藏日期是2014年。
12、04月29日。0016本发明所述的兽疫链球菌菌株特征呈球形或卵圆形，呈链状排列，有荚膜，无芽孢，无鞭毛，革兰氏染色阳性。0017所述的透明质酸的发酵工艺，包括以下步骤摇瓶种子液培养将斜面菌种接种于装有灭菌培养液的1L锥形瓶中，37培养1216小时，镜检观察菌体生长良好，无杂菌污染，即可接种于种子罐中；菌种扩配将培养液加入到种子罐中，进行蒸汽灭菌后，设定温度363、PH686，按无菌要求在种子罐里加入菌种，维持罐压005MPA，培养1216小时，镜检观察菌体生长良好，无杂菌污染，即可接种于发酵罐中；发酵将一半发酵培养液加入到发酵罐中，进行蒸汽灭菌后，设定温度363、PH686，维持罐压005MP。
13、，将种子罐的培养基全部压入到发酵罐中，记录PH值，在PH下降时加入另一半发酵培养液，保持各项指标，发酵液PH每分钟下降幅度小于001时结束发酵，检测发酵液粘度，将发酵液压入沉淀罐中。0018步骤中的培养液包括按重量百分比的葡萄糖35、酵母粉152、七水硫酸镁12、四水硫酸锰00101、磷酸二氢钾0105、磷酸氢二钠0508、碳酸钙011、氯化锌00501，余量为水。0019本发明的有益效果为1本发明采用复合诱变技术筛选出透明质酸产率高的菌种，结合发酵技术，透明质酸产品产出率高，可达79G/L。发酵得到的透明质酸易于分离纯化，生产周期短。00202本发明采用添加活性炭、珍珠岩、白硅藻土、EDTA。
14、结合大板框过滤技术去除透明质酸中的杂质，添加剂常见易得，操作相对简单，杂质含量更低。说明书CN104059169A3/4页500213本发明使用7580酒精对物料进行了67次脱水，90酒精对物料进行23次脱水。这样逐步脱水不但减少了透明质酸中的水分，易于干燥，而且洗去了物料中残留的少量杂质，蛋白质含量更低，产品纯度高。00224本发明使用酒精多次脱水达到90以上时后，可得粉末状无定型沉淀，干燥后产品溶解性好，堆积密度适中。00235本发明生产工艺相对简单，生产易于控制，杂质含量更低，适合工业化大规模生产，收率高，并且大大降低了生产成本。0024具体实施方式为了更好地理解本发明，下面用具体实例来。
15、详细说明本发明的技术方案，但是本发明并不局限于此。0025实施例本发明的一种透明质酸的提纯工艺技术方案为，一种兽疫链球菌（STREPTOCOCCUSZOOEPIDEMICUS）AWA008，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，其保藏编号是CGMCCNO9111，保藏日期是2014年04月29日。0026目前该兽疫链球菌在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编100101，其保藏编号是CGMCCNO9111，菌种的拉丁文名称是STREPTOCOCCUSZOOEPIDEMICUS，参据的微生物（株）AWA008，保藏日期是2014年。
16、04月29日。0027本发明所述的兽疫链球菌菌株特征呈球形或卵圆形，呈链状排列，有荚膜，无芽孢，无鞭毛，革兰氏染色阳性。0028所述的一种透明质酸的提纯工艺，包括以下步骤（1）摇瓶种子液培养将斜面菌种接种于装有灭菌培养液的1L锥形瓶中，37培养1216小时，镜检观察菌体生长良好，无杂菌污染，即可接种于种子罐中；（2）菌种扩配将培养液加入到种子罐中，进行蒸汽灭菌后，设定温度363、PH686，按无菌要求在种子罐里加入菌种，维持罐压005MPA，培养1216小时，镜检观察菌体生长良好，无杂菌污染，即可接种于发酵罐中；（3）发酵将一半发酵培养液加入到发酵罐中，进行蒸汽灭菌后，设定温度363、PH68。
17、6，维持罐压005MP，将种子罐的培养基全部压入到发酵罐中，记录PH值，在PH下降时加入另一半发酵培养液，保持各项指标，发酵液PH每分钟下降幅度小于001时结束发酵，检测发酵液粘度，将发酵液压入沉淀罐中；（4）前沉淀向沉淀罐里在搅拌情况下缓缓地加入95的酒精，至产生雪花状沉淀，控制在4750度（折至20时的酒精度），收集沉淀物；（5）溶解用氯化钠溶液将沉淀物溶解，调节PH至9395，加入EDTA、活性炭、珍珠岩，搅拌均匀；（6）过滤将溶解后的料液压入1大板框过滤一遍后，过滤液调PH9395。再加入白硅藻土和珍珠岩后，搅拌均匀后，压入2大板框过滤第二遍。二遍过滤液中加入硅藻土，搅拌均匀后，料液通。
18、过不锈钢板打循环澄清后，过滤第三遍，澄清度在995以上，然后过滤液通过聚丙烯滤芯过滤至洁净间沉淀罐；（7）后沉淀料液调PH至7073，搅拌下缓缓地加入95酒精至沉淀产生，控制酒精说明书CN104059169A4/4页6度数4750度即可。静止2040分钟后将上清液打入废酒精罐；（8）脱水离心用7580的PH值在7073之间的酒精脱水67次，然后再用90的酒精脱水23次，脱水后酒精度数到90以上，静止1小时左右，打走上清液，取样测PH值，并控制在7073之间。搅拌1520分钟后离心；（9）干燥将离心好的物料放入干燥罐，设定温度30，抽真空干燥3小时后，每小时升温5，设温60时停止，检测水分，水分。
19、小于7后出罐。0029步骤（1）、（2）、（3）中的培养液包括按重量百分比的葡萄糖35、酵母粉152、七水硫酸镁12、四水硫酸锰00101、磷酸二氢钾0105、磷酸氢二钠0508、碳酸钙011、氯化锌00501，余量为水。0030步骤（5）氯化钠溶液浓度为3。0031步骤（5）中，加入EDTA、活性炭、珍珠岩质量比为，11125。0032步骤（6）中，白硅藻土和珍珠岩的质量比为115。0033步骤（6）中过滤液通过022微米聚丙烯滤芯过滤至洁净间沉淀罐。00341本发明采用复合诱变技术筛选出透明质酸产率高的菌种，结合发酵技术，透明质酸产品产率达9G/L。发酵得到的透明质酸易于分离纯化，生产周期。
20、短。00352本发明采用添加活性炭、珍珠岩、白硅藻土、EDTA结合大板框过滤技术去除透明质酸中的杂质，添加剂常见易得，操作相对简单，杂质含量更低（蛋白质01、重金属20PPM、砷盐2PPM）。00363本发明使用7580酒精对物料进行了67次脱水，90酒精对物料进行23次脱水。这样逐步脱水不但减少了透明质酸中的水分，易于干燥，而且洗去了物料中残留的少量杂质，蛋白质含量更低，产品纯度高，能达到990以上。00374本发明使用酒精多次脱水达到90以上时后，可得粉末状无定型沉淀，干燥后产品溶解性好，溶解速度快，降解慢，堆积密度适中（堆积密度0406G/ML）。00385本发明生产工艺简单，原辅料常见易得，生产易于控制，杂质含量更低，适合工业化大规模生产，收率高，并且大大降低了生产成本。说明书CN104059169A。