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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 (10)授权公告号 (45)授权公告日 (21)申请号 201510771278.3 (22)申请日 2015.11.12 (65)同一申请的已公布的文献号 申请公布号 CN 105432465 A (43)申请公布日 2016.03.30 (73)专利权人 东北林业大学 地址 150040 黑龙江省哈尔滨市香坊区和 兴路26号 专利权人 沈海龙 高芳 (72)发明人 沈海龙 高芳 梁艳 杨玲 张鹏 (74)专利代理机构 哈尔滨市松花江专利商标事 务所 23109 代理人 侯静 (51)Int.Cl. A01H 4/00(2006.01)。
2、 审查员 崔依同 (54)发明名称 一种提高红松胚性愈伤组织诱导率和转胚 率的方法 (57)摘要 一种提高红松胚性愈伤组织诱导率和转胚 率的方法， 本发明涉及一种提高红松胚性愈伤组 织诱导率和转胚率的方法。 本发明是要解决现有 红松在进行体细胞胚胎发生时， 胚性愈伤组织诱 导率和转胚率低的问题， 方法为： 一、 材料的灭 菌； 二、 胚性愈伤诱导； 三、 愈伤组织的继代保持 与增殖； 四、 原胚的诱导； 五、 体细胞胚的发育、 成 熟与植株再生， 即完成。 本发明通过培养基中各 组分的合理配比与适宜的培养条件， 使红松在进 行体细胞胚胎发生时， 胚性愈伤组织诱导率和转 胚率都得到了提高， 胚性。
3、愈伤组织诱导率可达到 33.3， 本发明通过加入肌醇使胚性愈伤褐化程 度降低， 且更有助于球形胚的转化， 转胚率是不 加肌醇的6-8倍。 本发明应用于林业领域。 权利要求书1页 说明书4页 附图3页 CN 105432465 B 2017.08.25 CN 105432465 B 1.一种提高红松胚性愈伤组织诱导率和转胚率的方法， 其特征在于该方法按以下步骤 进行： 一、 材料的灭菌 将处于裂生多胚期的红松球果灭菌后， 剥去种皮， 再次灭菌， 得到灭菌后的合子胚； 二、 胚性愈伤诱导 将步骤一得到的灭菌后的合子胚接种于培养基中， 在2325的条件下， 暗培养60d， 得到胚性愈伤组织， 其中培。
4、养基为DCR培养基+琼脂6.5g/L+L-谷氨酰胺500mg/L+蔗糖35g/L +NAA 2mg/L+6-BA1.5mg/L+酸水解酪蛋白0.8g/L； 培养基pH5.8； 三、 愈伤组织的继代保持与增殖 将步骤二得到的胚性愈伤组织在2325的条件下， 暗培养15d进行继代培养， 得到增 殖后的愈伤组织； 四、 原胚的诱导 将增殖后的愈伤组织接种到培养基中进行原胚的诱导， 在2325的条件下， 暗培养 12d， 得到带有球形胚的愈伤组织； 其中培养基为DCR培养基+酸水解酪蛋白500mg/L+L-谷氨 酰胺500mg/+蔗糖20g/L+琼脂6.5g/L+活性炭2g/L+肌醇4g/L； pH5。
5、.8； 五、 体细胞胚的发育与植株再生 将带有球形胚的愈伤组织接种到培养基中进行体胚发育， 得到子叶胚； 同时对获得的 子叶胚进行成熟诱导， 得到成熟胚， 然后进行萌发、 植株再生与移栽成苗； 其中步骤三中继代培养的培养基为DCR培养基+琼脂6.5g/L+L-谷氨酰胺500mg/L+蔗糖 30g/L+2,4-D 0.5g/L+6-BA0.1g/L+酸水解酪蛋白0.5g/L； pH5.8； 步骤五中体胚成熟诱导 培养基为DCR培养基+琼脂7.1g/L+L-谷氨酰胺500mg/L+蔗糖60g/L+脱落酸20mg/L+PEG4000 50g/L+IBA0.2mg/L+活性炭2g/L； pH5.8； 。
6、步骤五体胚成熟诱导是在2325的条件下， 暗 培养6080d， 每34周继代一次。 2.根据权利要求1所述的一种提高红松胚性愈伤组织诱导率和转胚率的方法， 其特征 在于步骤一中处于裂生多胚期的红松球果灭菌的方法为： 将红松球果洗净， 然后削去种鳞， 再用质量浓度为70的酒精处理35min， 然后用无菌水冲洗24次， 再用质量浓度10次 氯酸钠浸泡2030min。 3.根据权利要求1所述的一种提高红松胚性愈伤组织诱导率和转胚率的方法， 其特征 在于步骤一中再次灭菌的方法为： 用质量浓度为3的双氧水处理8min， 无菌水冲洗24 次。 权 利 要 求 书 1/1 页 2 CN 105432465 。
7、B 2 一种提高红松胚性愈伤组织诱导率和转胚率的方法 技术领域 0001 本发明涉及一种提高红松胚性愈伤组织诱导率和转胚率的方法。 背景技术 0002 红松(Pinus koraiensis)是我国东北地区极其重要的优质用材树种,也是发展前 景巨大的坚果经济林树种。 体细胞胚胎发生是快速繁殖和人工种子研制的基础， 对遗传改 良有重要意义。 进行红松体细胞胚胎发生和不定芽发生研究， 既可以为其生物学研究提供 有效组培体系， 又可以直接用于优良种质材料的无性扩繁。 但现在进行红松体细胞发生时， 胚性愈伤组织诱导率和转胚率都较低， 严重制约了红松的体细胞胚胎发生方面的研究。 发明内容 0003 本发。
8、明是要解决现有红松在进行体细胞胚胎发生时， 胚性愈伤组织诱导率和转胚 率低的问题， 提供一种提高红松胚性愈伤组织诱导率和转胚率的方法。 0004 本发明一种提高红松胚性愈伤组织诱导率和转胚率的方法按以下步骤进行： 0005 一、 材料的灭菌 0006 将处于裂生多胚期的红松球果灭菌后， 剥去种皮， 再次灭菌， 得到灭菌后的合子 胚； 0007 二、 胚性愈伤诱导 0008 将步骤一得到的灭菌后的合子胚接种于培养基中， 在2325的条件下， 暗培养 5865d， 得到胚性愈伤组织， 其中培养基为DCR培养基+琼脂6.5g/L+L-谷氨酰胺500mg/L+ 蔗糖35g/L+NAA2mg/L+6-B。
9、A 1.5mg/L+酸水解酪蛋白0.8g/L； 培养基pH5.8； 0009 三、 愈伤组织的继代保持与增殖 0010 将步骤二得到的胚性愈伤组织进行继代培养， 得到增殖后的愈伤组织； 0011 四、 原胚的诱导 0012 将增殖后的愈伤组织接种到培养基中进行原胚的诱导， 在2325的条件下， 暗 培养715d， 得到带有球形胚的愈伤组织； 其中培养基为DCR培养基+酸水解酪蛋白500mg/L +L-谷氨酰胺500mg/+蔗糖20g/L+琼脂6.5g/L+活性炭2g/L+肌醇4g/L； pH5.8； 0013 五、 体细胞胚的发育与植株再生 0014 将带有球形胚的愈伤组织接种到培养基中进行体。
10、胚发育， 完成转胚过程， 得到子 叶胚； 同时对获得的子叶胚进行成熟诱导， 得到成熟胚， 然后进行萌发、 植株再生与移栽成 苗。 0015 本发明通过培养基中各组分的合理配比与适宜的培养条件， 使红松在进行体细胞 胚胎发生时， 胚性愈伤组织诱导率和转胚率都得到了提高， 胚性愈伤组织诱导率可达到 33.3， 本发明发现肌醇对球形胚的诱导以及后期体胚发育与成熟有重要作用， 通过加入 肌醇使胚性愈伤褐化程度降低， 且更有助于球形胚的转化， 转胚率是不加肌醇的6-8倍。 说 明 书 1/4 页 3 CN 105432465 B 3 附图说明 0016 图1为实施例一中胚性愈伤组织的照片； 0017 图。
11、2为实施例一中早期原胚的照片； 0018 图3为实施例一中球形胚的照片； 0019 图4和图5为实施例一中体细胞胚发育的照片。 具体实施方式 0020 具体实施方式一： 本实施方式一种提高红松胚性愈伤组织诱导率和转胚率的方法 按以下步骤进行： 0021 一、 材料的灭菌 0022 将处于裂生多胚期的红松球果灭菌后， 剥去种皮， 再次灭菌， 得到灭菌后的合子 胚； 0023 二、 胚性愈伤诱导 0024 将步骤一得到的灭菌后的合子胚接种于培养基中， 在2325的条件下， 暗培养 5865d， 得到胚性愈伤组织， 其中培养基为DCR培养基+琼脂6.5g/L+L-谷氨酰胺500mg/L+ 蔗糖35g。
12、/L+NAA2mg/L+6-BA 1.5mg/L+酸水解酪蛋白0.8g/L； 培养基pH5.8； 0025 三、 愈伤组织的继代保持与增殖 0026 将步骤二得到的胚性愈伤组织进行继代培养， 得到增殖后的愈伤组织； 0027 四、 原胚的诱导 0028 将增殖后的愈伤组织接种到培养基中进行原胚的诱导， 在2325的条件下， 暗 培养715d， 得到带有球形胚的愈伤组织； 其中培养基为DCR培养基+酸水解酪蛋白500mg/L +L-谷氨酰胺500mg/+蔗糖20g/L+琼脂6.5g/L+活性炭2g/L+肌醇4g/L； pH5.8； 0029 五、 体细胞胚的发育与植株再生 0030 将带有球形胚。
13、的愈伤组织接种到培养基中进行体胚发育， 完成转胚过程， 得到子 叶胚； 同时对获得的子叶胚进行成熟诱导， 得到成熟胚， 然后进行萌发、 植株再生与移栽成 苗。 0031 本实施方式中的红松球果采集于黑龙江省苇河林业局青山林木种子园。 0032 本实施方式通过培养基中各组分的合理配比与适宜的培养条件， 使红松在进行体 细胞胚胎发生时， 胚性愈伤组织诱导率和转胚率都得到了提高， 胚性愈伤组织诱导率可达 到33.3， 本实施方式发现肌醇对球形胚的诱导以及后期体胚成熟有重要作用， 通过加入 肌醇使胚性愈伤褐化程度降低， 且更有助于球形胚向成熟胚转化， 转胚率是不加肌醇的6-8 倍。 0033 具体实施。
14、方式二： 本实施方式与具体实施方式一不同的是： 步骤一中处于裂生多 胚期的红松球果灭菌的方法为： 将红松球果洗净， 然后削去种鳞， 再用质量浓度为70的酒 精处理35min， 然后用无菌水冲洗24次， 再用质量浓度10次氯酸钠浸泡2030min。 其 它与具体实施方式一相同。 0034 具体实施方式三： 本实施方式与具体实施方式一或二不同的是： 步骤一中再次灭 菌的方法为： 用质量浓度为3的双氧水处理8min， 无菌水冲洗24次。 其它与具体实施方 说 明 书 2/4 页 4 CN 105432465 B 4 式一或二相同。 0035 具体实施方式四： 本实施方式与具体实施方式一至三之一不同的。
15、是： 步骤二中暗 培养60d。 其它与具体实施方式一至三之一相同。 0036 具体实施方式五： 本实施方式与具体实施方式一至四之一不同的是： 步骤三中继 代培养的培养基为DCR培养基+琼脂6.5g/L+L-谷氨酰胺500mg/L+蔗糖30g/L+2,4-D0.5g/L+ 6-BA 0.1g/L+酸水解酪蛋白0.5g/L； pH5.8。 其它与具体实施方式一至四之一相同。 0037 具体实施方式六： 本实施方式与具体实施方式一至五之一不同的是： 步骤三中继 代培养是在2325的条件下， 暗培养15d。 其它与具体实施方式一至五之一相同。 0038 具体实施方式七： 本实施方式与具体实施方式一至六。
16、之一不同的是： 步骤四中暗 培养12d。 其它与具体实施方式一至六之一相同。 0039 具体实施方式八： 本实施方式与具体实施方式一至七之一不同的是： 步骤五中暗 培养70d。 其它与具体实施方式一至七之一相同。 0040 具体实施方式九： 本实施方式与具体实施方式一至八之一不同的是： 步骤五中体 胚成熟诱导培养基为DCR培养基+琼脂7.1g/L+L-谷氨酰胺500mg/L+蔗糖60g/L+脱落酸 20mg/L+PEG400050g/L+IBA 0.2mg/L+活性炭2g/L； pH5.8。 其它与具体实施方式一至八之 一相同。 0041 具体实施方式十： 本实施方式与具体实施方式一至九之一不。
17、同的是： 步骤五体胚 成熟诱导是在2325的条件下， 暗培养6080d， 每34周继代一次。 其它与具体实施方 式一至九之一相同。 0042 下面的实施例将对本发明予以进一步的说明， 但并不因此而限制本发明。 0043 实施例1： 本实施例提高红松胚性愈伤组织诱导率和转胚率的方法， 按以下步骤进 行： 0044 一、 材料的灭菌 0045 将处于裂生多胚期的红松球果洗净， 然后削去种鳞， 再用质量浓度为70的酒精 处理2min， 然后用无菌水冲洗3次， 再用质量浓度10次氯酸钠浸泡25min， 之后于超净工作 台下剥去种皮， 然后用质量浓度为3的双氧水处理8min， 无菌水冲洗3次， 得到灭菌。
18、后的合 子胚； 0046 二、 胚性愈伤诱导 0047 将步骤一得到的灭菌后的合子胚接种于培养基中， 在25的条件下， 暗培养60d， 得到胚性愈伤组织， 其中培养基为DCR培养基+琼脂6.5g/L+L-谷氨酰胺500mg/L+蔗糖35g/L +NAA 2mg/L+6-BA 1.5mg/L+酸水解酪蛋白0.8g/L； 培养基pH5.8； 本步骤的胚性愈伤组织 的照片如图1所示， 胚性愈伤组织诱导率可达到33.3。 0048 三、 愈伤组织的继代保持与增殖 0049 将步骤二得到的胚性愈伤组织进行继代培养， 在25的条件下， 暗培养15d， 得到 增殖后的愈伤组织， 其中继代培养的培养基为DCR。
19、培养基+琼脂6.5g/L+L-谷氨酰胺500mg/L +蔗糖30g/L+2,4-D 0.5g/L+6-BA 0.1g/L+酸水解酪蛋白0.5g/L； pH5.8； 0050 四、 原胚的诱导 0051 将增殖后的愈伤组织接种到培养基中进行原胚的诱导， 在25的条件下， 暗培养 12d， 得到带有球形胚的愈伤组织； 其中培养基为DCR培养基+酸水解酪蛋白500mg/L+L-谷氨 说 明 书 3/4 页 5 CN 105432465 B 5 酰胺500mg/+蔗糖20g/L+琼脂6.5g/L+活性炭2g/L+肌醇4g/L； pH5.8； 本步骤过程中生成 早期原胚的照片如图2所示， 球形胚的照片如。
20、图3所示。 0052 五、 体细胞胚的发育 0053 将带有球形胚的愈伤组织接种到培养基中进行体胚发育， 完成转胚过程； 同时对 获得的子叶胚进行成熟诱导， 在25的条件下， 暗培养6080d， 每34周继代一次， 得到成 熟胚， 其中培养基为DCR培养基+琼脂7.1g/L+L-谷氨酰胺500mg/L+蔗糖60g/L+脱落酸20mg/ L+PEG400050g/L+IBA 0.2mg/L+活性炭2g/L； pH5.8； 本步骤胚发育的照片如图4和图5所 示。 0054 六、 体细胞胚的萌发与植株再生 0055 将诱导的成熟体细胞胚水平置于萌发培养基DCR上进行萌发， 附加20g/L蔗糖， L-。
21、 谷氨酰胺500mg/L， 酸水解酪蛋白2g/L， 先暗培养6d， 再在光照度2000lx， 16/8h光/暗培养 14d， 对成熟体细胞胚进行萌发培养； 然后采用WPM基本培养基， 附加1.0mg/LIBA、 0.2mg/ LNAA、 20g/L蔗糖、 0.1g/L肌醇和6.5/L琼脂， 光照度20001x， 16/8小时的光暗培养1个月， 进 行体细胞胚植株再生， 得到再生植株； 0056 七、 再生植株的移栽 0057 待再生植株根伸长2cm以上后进行移栽， 移栽前7d逐渐将封口膜揭开， 使幼苗适应 外界的环境， 移栽在采用体积比为1:3:1珍珠岩、 营养土和蛭石为基质， 进行移栽培养，。
22、 即完 成。 0058 本实施例中的红松球果采集于黑龙江省苇河林业局青山林木种子园。 0059 本实施例通过加入肌醇使胚性愈伤褐化程度降低， 且更有助于球形胚向成熟胚转 化， 转化率是不加肌醇的6-8倍。 0060 通过以上实施例可知， 本发明通过培养基中各组分的合理配比与适宜的培养条 件， 使红松在进行体细胞胚胎发生时， 胚性愈伤组织诱导率和转胚率都得到了提高， 胚性愈 伤组织诱导率可达到33.3， 本发明发现肌醇对球形胚的诱导以及后期体胚发育和成熟有 重要作用， 通过加入肌醇使胚性愈伤褐化程度降低， 且更有助于球形胚的转化， 转化率是不 加肌醇的6-8倍。 0061 以上所述,仅为本发明较佳的具体实施方式,但本发明的保护范围并不局限于此, 任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内,可轻易想到的变化或替换, 都应涵盖在本发明的保护范围之内。 说 明 书 4/4 页 6 CN 105432465 B 6 图1 图2 说 明 书 附 图 1/3 页 7 CN 105432465 B 7 图3 图4 说 明 书 附 图 2/3 页 8 CN 105432465 B 8 图5 说 明 书 附 图 3/3 页 9 CN 105432465 B 9 。