《白藜芦醇纳米脂质体及其制备方法.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《白藜芦醇纳米脂质体及其制备方法.pdf（8页珍藏版）》请在专利查询网上搜索。
1、(10)申请公布号 CN 103040754 A (43)申请公布日 2013.04.17 CN 103040754 A *CN103040754A* (21)申请号 201210560125.0 (22)申请日 2012.12.20 A61K 9/127(2006.01) A61K 31/05(2006.01) A61P 35/00(2006.01) A61P 1/16(2006.01) A61P 1/00(2006.01) (71)申请人 中国农业科学院农产品加工研究所 地址 100193 北京市海淀区圆明园西路 2 号 (72)发明人 王强 刘红芝 刘丽 陈琼玲 胡晖 (74)专利代理机。
2、构 北京纪凯知识产权代理有限 公司 11245 代理人 关畅 (54) 发明名称 白藜芦醇纳米脂质体及其制备方法 (57) 摘要 本发明公开了一种白藜芦醇纳米脂质体及其 制备方法。该方法， 包括如下步骤 ： 将白藜芦醇、 膜材、 抗氧化剂和有机溶剂混合溶解， 成膜同时除 去所述有机溶剂， 再加入缓冲液进行水合， 得到白 藜芦醇脂质体的粗悬液， 将所得粗悬液进行高压 微射流处理， 得到所述白藜芦醇纳米脂质体。 本发 明采用高压微射流法经过溶解、 脂质形成、 充分水 合、 微射流分散等步骤制得白藜芦醇纳米脂质体。 该白藜芦醇纳米脂质体均匀一致， 粒径小， 包封率 高， 稳定性良好。 (51)Int。
3、.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 4 页 附图 2 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 4 页 附图 2 页 1/1 页 2 1. 一种制备白藜芦醇纳米脂质体的方法， 包括如下步骤 ： 将白藜芦醇、 膜材、 抗氧化剂 和有机溶剂混合溶解， 成膜同时除去所述有机溶剂， 再加入缓冲液进行水合， 得到白藜芦醇 脂质体的粗悬液， 将所得粗悬液进行高压微射流处理， 得到所述白藜芦醇纳米脂质体。 2.根据权利要求1所述的方法， 其特征在于 ： 所述混合溶解的方法为超声 ； 所述成膜同 时除去所述有机溶剂的方法为减压旋转蒸发。 3. 根据权利要求 。
4、1 或 2 所述的方法， 其特征在于 ： 构成所述膜材的物质选自大豆卵磷 脂、 脑磷脂、 神经鞘磷脂、 磷脂酰乙醇胺、 胆固醇、 牛胆酸钠、 - 谷甾醇和胆固醇乙酰酯中的 至少一种， 优选大豆卵磷脂和胆固醇中的至少一种 ； 所述抗氧化剂选自维生素 E、 丁基羟基茴香醚、 二丁基羟基甲苯和二丁基羟基甲苯中的 至少一种， 优选维生素 E ； 所述有机溶剂选自无水乙醇、 甲醇、 氯仿、 乙醚和石油醚中的至少一种， 优选乙醇。 4. 根据权利要求 1-3 任一所述的方法， 其特征在于 ： 所述白藜芦醇、 膜材、 抗氧化剂 有机溶剂和缓冲液的用量比为 0.051g ： 12g ： 0.040.5g ： 。
5、200500mL ： 150350mL， 优选 0.1g ： 1.1g ： 0.1g ： 500mL ： 250mL ； 所述缓冲液为 pH 值为 7.4 的磷酸盐缓冲液， 浓度为 0.0020.02mol/L， 优选 0.01mol/ L。 5. 根据权利要求 1-4 任一所述的方法， 其特征在于 ： 所述超声步骤中， 超声频率为 28100Hz， ， 优选 45Hz， 功率 120300W， 优选 240W ； 时间为 35min， 温度为 4060， 优选 45 ； 所述减压旋转蒸发步骤中， 温度为 4060， 优选 45， 真空度为 -0.09-0.1MPa， 优 选 -0.1MPa 。
6、； 所述水合步骤中， 温度为 4060， 优选 45， 时间为 2045min， 优选 30min ； 所述高压微射流处理步骤中， 处理压力为 1000030000PSI， 优选 18000PSI， 循环次数 为 16 次， 优选 3 次。 6.根据权利要求1-5任一所述的方法， 其特征在于 ： 所述方法还包括 ： 在所述溶解步骤 之后， 所述水合步骤之前， 向所述缓冲液中加入玻璃珠。 7. 权利要求 1-6 任一所述方法制备得到的白藜芦醇纳米脂质体。 8. 根据权利要求 7 所述的脂质体， 其特征在于 ： 所述脂质体的粒径为 24.53219.2nm， 优选 76.091.38nm ； Ze。
7、ta 电位为 -24.6-65mV， 优选 -53.902.26mV ； 包封率为 34.40%89.30%， 优选 88.27% ； pH 值为 7.337.47， 优选 7.350.035 ； 对 人 肝 癌 细 胞 HEPG-2 和 人 胃 癌 细 胞 AGS 的 抑 制 率 分 别 为 31.58%76.85% 和 11.49%58.37%， 优选分别为 76.85% 和 58.37%。 9. 权利要求 7 或 8 所述白藜芦醇纳米脂质体在制备抑制肿瘤细胞产品中的应用。 10. 根据权利要求 9 所述的应用， 其特征在于 ： 所述肿瘤细胞具体为肝癌细胞或胃癌细 胞 ； 所述肝癌细胞具体。
8、为人肝癌细胞 HEPG-2 ； 所述胃癌细胞具体为人胃癌细胞 AGS。 权 利 要 求 书 CN 103040754 A 2 1/4 页 3 白藜芦醇纳米脂质体及其制备方法 技术领域 0001 本发明属于功能性保健食品技术领域， 涉及一种白藜芦醇纳米脂质体及其制备方 法。 背景技术 0002 白藜芦醇又称芪三酚， 是植物为抵抗外界刺激如紫外线、 真菌、 病毒感染或机械损 伤而产生的一种植物抗毒素， 具有抗癌、 抑菌、 抗炎症、 保护心血管、 调节雌激素、 保护神经 和肝脏、 抗辐射、 镇咳平喘、 降低血压、 改善微循环、 治疗艾滋病和休克等多种生理功能， 被 美国 抗衰老圣典 列为 “100 。
9、种最热门有效的抗衰老物质” 之一。但由于白藜芦醇化学性 质不稳定， 见光遇热易分解， 且水溶性差， 因此存在口服吸收性差、 生物利用率低、 难以持久 作用等缺点， 导致其应用受到一定程度的限制。 0003 纳米脂质体作为一种新型药物载体， 是以卵磷脂、 胆固醇等为膜材对目的物质进 行包封， 制成的一种具有类似生物膜结构的双分子层囊泡， 具有稳定性好、 靶向性强、 可延 缓释放、 无免疫毒性等特点， 成为近年来现代医学和食品功能化学共同关注的焦点。因此， 将纳米脂质体用于白藜芦醇的包封与载运， 有利于提高其生物利用率与缓释作用， 促进其 渗皮吸收性， 从而进一步扩大其在食品、 药品、 化妆品等行。
10、业的应用范围。 0004 目前， 纳米脂质体的制备方法主要有薄膜分散法、 逆向蒸发法、 乙醇注入法、 超声 法、 高压均质法等， 但都存在有机试剂残留、 磷脂成分易氧化、 生产成本高、 周期长， 制备过 程难以控制等缺点， 放大为工业化生产存在难度。 发明内容 0005 本发明的目的是提供一种白藜芦醇纳米脂质体及其制备方法。 0006 本发明提供的制备白藜芦醇纳米脂质体的方法， 包括如下步骤 ： 将白藜芦醇、 膜 材、 抗氧化剂和有机溶剂混合溶解， 成膜同时除去所述有机溶剂， 再加入缓冲液进行水合， 得到白藜芦醇脂质体的粗悬液， 将所得粗悬液进行高压微射流处理， 得到所述白藜芦醇纳 米脂质体。。
11、 0007 上述方法中， 所述混合溶解的方法为超声 ； 所述成膜同时除去所述有机溶剂的方 法为减压旋转蒸发。 0008 构成所述膜材的物质选自大豆卵磷脂、 脑磷脂、 神经鞘磷脂、 磷脂酰乙醇胺、 胆固 醇、 牛胆酸钠、 - 谷甾醇和胆固醇乙酰酯中的至少一种， 优选大豆卵磷脂和胆固醇中的至 少一种 ； 0009 所述抗氧化剂选自维生素 E、 丁基羟基茴香醚、 二丁基羟基甲苯和二丁基羟基甲苯 中的至少一种， 优选维生素 E ； 0010 所述有机溶剂选自无水乙醇、 甲醇、 氯仿、 乙醚和石油醚中的至少一种， 优选乙醇。 0011 所述白藜芦醇、 膜材、 抗氧化剂、 有机溶剂和缓冲液的用量比为 0.。
12、051g ： 12g ： 0.040.5g ： 200500mL ： 150350mL，优 选 0.1g ： 1.1g ： 0.1g ： 500mL ： 250mL，具 体 为 说 明 书 CN 103040754 A 3 2/4 页 4 0.05-0.1g ： 1.1-1.5g ： 0.04-0.1g ： 200-500mL ： 150-250mL 或 0.1-1g ： 1.0-1.1g ： 0.1-0.5g ： 500mL ： 250-350mL 或 0.05-1.0g ： 1.0-1.5g ： 0.04-0.5g ： 200-500mL ： 150-350mL 或 0.05g ： 1.5。
13、g ： 0.04g ： 200mL ： 150mL 或 1g ： 1.0g ： 0.5g ： 500mL ： 350mL ； 0012 所述缓冲液为 pH 值为 7.4 的磷酸盐缓冲液， 浓度为 0.0020.02mol/L， 优选 0.01mol/L， 具体为 0.002-0.01mol/L。 0013 所述超声步骤中， 超声频率为28100Hz， ， 优选45Hz， 具体为45-100HZ或28-45HZ， 功率 120300W， 优选 240W， 具体为 120-240W 或 240-300W ； 时间为 35min， 具体为 3-4min 或 4-5min， 温度为 4060， 优选 。
14、45， 具体为 40-45或 45-60 ； 0014 所述减压旋转蒸发步骤中， 温度为 4060， 优选 45， 具体为 40-45或 45-60， 真空度为 -0.09-0.1MPa， 具体为 -0.09 或 -0.01 或 -0.08 或 -0.08 至 -0.01 或 -0.09 至 -0.01 或 -0.09 至 -0.08MPa ； 0015 所述水合步骤中， 温度为 4060， 优选 45， 具体为 40-45或 45-60， 时间为 2045min， 优选 30min， 具体为 20-30min 或 30-45min ； 0016 所述高压微射流处理步骤中， 处理压力为 100。
15、0030000PSI， 优选 18000PSI， 具体 为 10000-18000PSI 或 18000-30000PSI， 循环次数为 16 次， 优选 3 次， 具体为 1-3 次或 3-6 次 ； 0017 为了将减压旋转蒸发所得类脂膜洗至水合介质中， 以利于洗膜完全， 避免有部分 类脂膜粘附在茄形瓶壁上， 难以洗下来， 上述制备白藜芦醇纳米脂质体的方法， 还可包括 ： 在所述溶解步骤之后， 所述水合步骤之前， 向所述缓冲液中加入玻璃珠。 0018 利用上述方法制备得到的白藜芦醇纳米脂质体， 也属于本发明提供的保护范围。 所述脂质体的粒径为24.53219.2nm， Zeta电位为-24。
16、.6-65mV， 包封率为34.40%89.30%， 具体为 75.27%、 88.27%、 88.68%、 75.27%-88.68%、 75.27%-88.27% 或 88.27%-88.68% ； 0019 pH 值为 7.337.47， 且对人肝癌细胞 HEPG-2、 人胃癌细胞 AGS 的抑制率分别为 31.58%76.85%、 11.49%58.37%。 0020 本发明优选条件下提供的白藜芦醇纳米脂质体特征为 ： 外观呈均匀乳白色悬浮 液， 电镜下呈圆形或椭圆形微球体， 颗粒间分散、 独立， 粒径为 （76.091.38） nm， Zeta 电位 （-53.902.26） mV，。
17、 包封率为 88.27%， pH 值 （7.350.035） ， 且对人肝癌细胞 HEPG-2、 人胃 癌细胞 AGS 的抑制率分别为 76.85% 和 58.37%。 0021 另外， 上述本发明提供的白藜芦醇纳米脂质体在制备抑制肿瘤细胞产品中的应 用， 也属于本发明的保护范围。其中， 所述肿瘤细胞具体为肝癌细胞或胃癌细胞 ； 所述肝癌 细胞具体为人肝癌细胞 HEPG-2 ； 所述胃癌细胞具体为人胃癌细胞 AGS。 0022 本发明采用高压微射流法经过溶解、 脂质形成、 充分水合、 微射流分散等步骤制得 白藜芦醇纳米脂质体， 具有如下有益效果 ： 0023 1、 制备方法操作简便、 易于控制。
18、、 清洁安全、 无有毒有机溶剂残留， 且可连续化生 产。 0024 2、 制得的纳米脂质体形态均一、 粒径小、 包封率高、 稳定性好， 实现了白藜芦醇的 载运与缓释， 改变其溶解性， 提高其生物利用率。 0025 3、 本发明提供的脂质体中含有抗氧化剂， 避免了药物由体内外氧化而造成的毒副 作用， 降低不良反应。 说 明 书 CN 103040754 A 4 3/4 页 5 附图说明 0026 图 1 为白藜芦醇纳米脂质体的透射电镜图。 0027 图 2 为白藜芦醇纳米脂质体的粒径分布图。 0028 图 3 为白藜芦醇纳米脂质体的 Zeta 电位图。 0029 图 4 为高效液相色谱 （HPL。
19、C） 测定白藜芦醇的谱图 ； 具体实施方式 0030 下面结合具体实施例对本发明作进一步阐述， 但本发明并不限于以下实施例。所 述方法如无特别说明均为常规方法。所述原材料如无特别说明均能从公开商业途径而得。 0031 实施例 1、 白藜芦醇纳米脂质体制备 0032 准确称取 0.1g 白藜芦醇、 1g 大豆卵磷脂、 0.1g 胆固醇和 0.1g 抗氧化剂 VE， 加入 500mL 无水乙醇， 于 45HZ、 240W 条件下 45水浴超声 3min 至充分溶解， 45水浴条件下减 压 （真空度 -0.09MPa） 旋转蒸发除去乙醇， 直至茄形瓶壁上形成一层均匀的脂质薄膜。加入 250mL0.0。
20、1mol/L 磷酸盐缓冲液 （pH=7.4） 和适量玻璃珠， 45水浴条件下旋转水合 30min， 得到白藜芦醇脂质体粗悬液。将白藜芦醇粗悬液于高压微射流仪器中分散， 18000PSI 条件 下循环 3 次， 即得到白藜芦醇纳米脂质体。 0033 实施例 2、 白藜芦醇纳米脂质体制备 0034 准确称取 0.05g 白藜芦醇、 1g 蛋黄卵磷脂、 0.5g 牛胆酸钠和 0.04g 抗氧化剂丁基 羟基茴香醚， 加入 200mL 无水甲醇， 于 28HZ、 120W 条件下 40水浴超声 5min 至充分溶解， 40水浴条件下减压 （真空度 -0.01MPa） 旋转蒸发除去乙醇， 直至茄形瓶壁上形。
21、成一层均匀 的脂质薄膜。加入 150mL0.002mol/L 磷酸盐缓冲液 （pH=7.4） 和适量玻璃珠， 40水浴条件 下旋转水合45min， 得到白藜芦醇脂质体粗悬液。 将白藜芦醇粗悬液于高压微射流仪器中分 散， 10000PSI 条件下循环 6 次， 即得到白藜芦醇纳米脂质体。 0035 实施例 3、 白藜芦醇纳米脂质体制备 0036 准确称取 1g 白藜芦醇、 1.8g 脑磷脂、 0.2g - 谷甾醇和 0.5g 抗氧化剂二丁基羟 基甲苯， 加入 500mL 石油醚， 于 100HZ、 300W 条件下 60水浴超声 4min 至充分溶解， 60水 浴条件下减压 （真空度 -0.08。
22、MPa） 旋转蒸发除去乙醇， 直至茄形瓶壁上形成一层均匀的脂 质薄膜。加入 350mL0.002mol/L 磷酸盐缓冲液 （pH=7.4） 和适量玻璃珠， 60水浴条件下旋 转水合 20min， 得到白藜芦醇脂质体粗悬液。将白藜芦醇粗悬液于高压微射流仪器中分散， 30000PSI 条件下循环 1 次， 即得到白藜芦醇纳米脂质体。 0037 实施例 4、 白藜芦醇纳米脂质体的质量评价 0038 形态观察 ： 取实施例 1 制备所得白藜芦醇纳米脂质体以 0.01mol/L 磷酸盐缓冲液 （pH=7.4） 稀释至较低浓度， 滴于铜网上， 用滤纸吸干多余的液体， 醋酸铀染色 3min， 染色三 次后于。
23、透射电镜下观察产物的形态， 如图 1 所示， 呈圆形或椭圆形微球体， 颗粒间分散、 独 立， 且粒径 100nm。 0039 粒径与 Zeta 电位测定 ： 取适量白藜芦醇纳米脂质体， 用 0.45um 滤膜过滤， 采用 Malvern Zeta 电位仪测定其粒径与 Zeta 电位， 测得粒径为 （76.091.38） nm， Zeta 电位 （-53.902.26） mV， 其粒径分布图如图 2 所示， Zeta 电位图如图 3 所示。 说 明 书 CN 103040754 A 5 4/4 页 6 0040 pH 值测定结果为 7.350.035。 0041 包封率 EE（%） 测定 ： 0。
24、042 （1） HPLC 法建立白藜芦醇标准曲线 ： 0043 色谱条件为测定仪器 ： Waters1525 型高效液相色谱仪 （配有紫外和示差检测器） ； 色谱柱 ： C18柱， 150mm4.6mm， 5um ； 流动相 ： 乙腈 / 水 / 冰醋酸 =25:75:0.09（V/V） ， 流速 0.7mL/min， 检测波长 306nm， 进样量 10uL， 柱温 30。 0044 标准曲线的绘制 ： 精密称取 12.5mg（精确至 0.0001g） 白藜芦醇标准品， 用甲醇溶 解并定容至250mL， 得到50mg/L白藜芦醇标准贮备液。 准确移取1、 2、 4、 6、 8、 10mL白藜。
25、芦醇 标准贮备液， 用甲醇稀释并定容至 50mL， 得到一系列的标准工作溶液， 以峰面积为纵坐标， 浓度为横坐标， 绘制标准曲线， 得到回归方程 ： 0045 y=1.02105x+0.904105(r2=0.9998) 0046 式中 :y 为峰面积， x 为白藜芦醇浓度 （ug/mL） 。 0047 （2） 包封率 EE（%） 的测定 ： 取适量白藜芦醇纳米脂质体， 采用 HPLC 测定其质量浓 度 C1。取 5mL 纳米脂质体于分子截留量为 8000-14000D 的透析袋中， 置于 200mL0.01mol/L 磷酸盐缓冲液 （pH=7.4） 中透析 24h， 每隔 2h 更换 1 次。
26、透析液。取出透析后的纳米脂质体， 采用 HPLC 测定其质量浓度 C2。计算其包封率 EE（%） =C2/C1100%。 0048 如图 4 所示， 经 HPLC 测得透析前白藜芦醇的峰面积为 460868AUmin， 透析后白 藜芦醇的峰面积为 407868AUmin， 代入标准曲线分别计算其浓度 C1、 C2， 根据 EE（%） =C2/ C1100% 得包封率为 88.27%。 0049 按照与上相同的方法， 测得实施例 2 和 3 所得白藜芦醇脂质体的包封率分别为 88.68% 和 75.27%。 0050 体外抗肿瘤活性测定 ： 0051 收集生长良好的肿瘤细胞人肝癌细胞 HEPG-。
27、2 （购自上海抚生试剂公司 AGS 细胞） 、 人胃癌细胞AGS （购自上海瑞齐生物科技有限公司） ， 用含10%胎牛血清的RPMI-1640或DMEM 培养基配成 6104/ml 细胞悬液 , 接种于 96 孔板内 , 每孔 100l,37、 5%CO2孵箱培养 24h 后 , 加入待测药液 （药物终浓度 6.25、 12.5、 25、 50、 100g/ml） ， 每浓度设 3 个平行孔， 同时设空白对照。培养 48h 后弃上清 , 每孔加入 MTT 液 10l（5mg/mlRPMI-1640 培养基 配制 ) 后继续培养 4h， 每孔加入 200lDMSO， 摇匀， 用 Bio-Tek 。
28、MQX200 型酶标仪在检测波 长 570nm、 参考波长 450nm 下测吸光度 （A） 值， 抑制率计算 ： (A空白对照 A样品)/A空白对照100。 0052 测定得白藜芦醇脂质体对人肝癌细胞 HEPG-2 的半抑制浓度 （IC50） 为 52.183ug/ mL， 100ug/mL 浓度条件下对其抑制率达 76.85% ； 对人胃癌细胞 AGS 的半抑制浓度 （IC50） 为 46.809ug/mL， 50ug/mL 浓度条件下对其抑制率达 58.37%。 说 明 书 CN 103040754 A 6 1/2 页 7 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 103040754 A 7 2/2 页 8 图 3 图 4 说 明 书 附 图 CN 103040754 A 8 。