将包含高含量的游离脂肪酸的润滑脂转化为脂肪酸酯的方法以及用于所述方法的催化剂
技术领域
本公开内容广泛地涉及将游离脂肪酸转化为脂肪酸酯的方法。具体地，本公开内容包括将含有高含量的游离脂肪酸的润滑脂转化为脂肪酸酯的方法。本公开内容还涉及用于这样的方法的催化剂。
背景
伴随非可再生能源例如原油的快速消耗的世界能源和燃料需求的增加已导致日益增加的对作为替代能源的生物柴油的兴趣。
生物柴油包含来源于甘油三酯例如植物油和动物脂肪的长链脂肪酸烷基脂并且被当作是基于石油的柴油的可再生和更清洁的替代品。更常见的生物柴油之一包含脂肪酸甲酯(FAME)。
FAME通常通过使用碱催化剂，通过植物油(精炼油菜籽油、向日葵油和大豆油)和动物脂肪(牛肉、牛油、猪油)的甲醇分解来产生。然而，目前FAME的价格仍然太高以致不能替代传统化石燃料。FAME的高价格主要是由于用于产生FAME的起始材料的原料的高成本所致。例如，报道已显示菜籽油和大豆油成本分别为约1.28USD/L和约0.70USD/L，这构成了几乎80％的常见生物柴油的生产成本。
在另一个方面，隔油池油(GTO)例如褐色润滑脂(具有15-40wt％的游离脂肪酸(FFA))是廉价的(成本低于约0.3USD/L，并且在一些报道中低至约0.19USD/L)和不可食用的资源。其被大量排放而无任何利用(在新加坡约800-1000吨/年，在美国约169万吨/年)。因此，由于其低获取成本和丰富的量，GTO被看作是用于生物柴油生产的极具吸引力的替代原料。可从使用GTO作为生物柴油生 产的起始材料收集的有前景的有利方面包括(i)生物柴油生产成本的下降和(ii)废油例如褐色润滑脂的处理问题的避免。鉴于此，已经尝试利用废弃润滑脂例如褐色润滑脂来产生有用的生物柴油。
然而，这些尝试遭到当使用GTO产生生物柴油时出现的技术挑战。例如，将甘油三酯转化为FAME的传统碱催化法因升高的存在于GTO中的FFA的量而不太适用于GTO，所述方法通常导致肥皂形成。因此，期望在进行通过碱催化剂对甘油三酯进行的转酯法之前降低存在于GTO中的FFA的水平。因此，设计了由FFA的酸催化酯化和随后利用碱催化剂进行的剩余甘油三酯的转酯组成的两步反应。
均质酸催化剂例如硫酸已被用于FFA与甲醇的酯化，但遭到几个问题的困扰，例如产生大量盐需要随后处理的利用碱对剩余酸的复杂中和、使用的设备的腐蚀和与高度浓酸的使用相关的环境问题。
虽然非均质酸催化剂的使用可避免均质酸催化剂有关的上述问题的一些问题，报道的非均质酸催化剂例如酸性离子交换树脂、沸石类、硫酸氧化锆和铌酸经发现对于通过酯化的润滑脂的预处理是令人不满意的。例如，沸石类和铌酸具有低密度的有效酸位点，从而在酯化中产生令人不满意的性能；酸性离子交换树脂例如Amberlyst15和Nafion受困于高成本、低热稳定性和较低的催化活性；硫酸氧化锆因锆是稀有昂贵金属而极其昂贵；一系列掺入不溶性多孔聚合物和多孔性二氧化硅结构的二芳基铵催化剂可提供改善的生物柴油转化，但它们需要在催化剂合成和再生步骤中使用昂贵的三氟甲磺酸以及使用高反应温度(95-125℃)和用于容纳高于大气压的压力的高压设备。例如，当在95-125℃(所述温度远高于甲醇(65℃)的沸点)应用使用二芳基铵催化剂的反应时，甲醇的对应蒸气压高至3.0-7.2atm。这样，所述方法必需使用高压设备。此外，大部分目前用于上述两步法的催化剂不能足够地再使用或再循环。
概括而言，目前酸催化剂在上述两步反应中的使用仍充满许多缺点。这样的两步反应还可导致环境污染和腐蚀。此外，利用非均质酸催化剂实现的转化不充分高，即使当使用高温(超过100℃的)和长反应时间时。因此，目前使用的将润滑脂转化为生物柴油的两步酸-碱催化法不是如所期望的高效和环境友好的。
鉴于上述内容，还进行了依赖于生物催化剂例如酶替代酸催化剂的尝试。一个已知的实例是使用脂肪酶。然而，这些分离的酶相对昂贵且不稳定。同样地，使用分离的酶的效率和FAME的转化相当低，特别地对于具有超过按重量计15％(15wt％)的FFA的高FFA含量的润滑脂。还已报道了固定化的酶用于生物柴油生产的用途。报道的使用固定化的酶从包含超过10wt％的FFA的GTO进行的生物柴油生产仍然不令人满意。例如，固定在颗粒化二氧化硅(Grant-CA和Gran-TL)上的南极假丝酵母(Candida antartica)脂肪酶B(CALB)和疏绵状嗜热丝孢菌(Thermomyces lanuginose)脂肪酶(TLL)和商购可得的固定化酶Novozyme SP435在48小时的反应时间后分别仅提供30％、5％和60％的润滑脂(包含6.8wt％的FFA)至FAME的转化。此外，据报道，固定在层状硅酸盐溶胶基质(PS-30)上的洋葱假单胞菌(Pseusomonas cepacia)脂肪酶可在约48小时的温育时间后，以合理地可接受的产率从仅包含6.8wt％的FFA的餐馆油脂产生FAME，但当油脂中的FFA增加至8.5wt％FFA时，FAME产率急剧下降。因此可看到，增加FFA的量削弱生物催化剂的性能，并且使用这样的生物催化剂的目前的方法不能达到从包含超过10wt％的的FFA(例如按重量计15-40％的FFA)的褐色润滑脂的期望的FAME转化水平。这得到报道的进一步证明，所述报道显示使用南极假丝酵母脂肪酶(Chirazyme L-2)将包含10.6％的FFA的润滑脂转化为生物柴油在24小时的温育时间后仅提供25％的产率。
除了分离的和固定的酶外，多年来，一些完整的细胞系统已被开发来用于从大豆油或麻风果油生产生物柴油。然而，仍然没有使 用完整细胞生物催化剂来从包含超过10wt％的FFA的GTO产生FAME的成功实例。例如，已报道当使用米根霉(R.oryzae)完整细胞生物催化剂在叔丁醇系统中利用甲醇转化预酸化的油菜籽油(67mol％的FFA含量)以进行FAME生产时，获得70％的不令人满意的产率。
因此，鉴于上述内容，目前用于将含有高FFA(例如超过10wt％的FFA)的GTO转化为FAME的方法远未令人满意或期望。
存在对提供解决或至少部分改善上述缺点的方法的需要。还存在提供用于这样的方法的催化剂的需要。
概述
根据一个方面，提供了从包含甘油酯和按重量计至少10％的游离脂肪酸(FFA)的组合物产生脂肪酸酯的方法，所述方法包括将多个微米或纳米尺寸的催化颗粒与所述组合物温育，以催化FFA至脂肪酸酯的转化，以便至少80％的FFA被转化为脂肪酸酯。
在一个实施方案中，在醇存在的情况下进行温育步骤。
在一个实施方案中，微米或纳米尺寸的催化颗粒具有不超过800μm的平均粒度或直径。
在一个实施方案中，微米或纳米尺寸的催化颗粒能够额外地催化甘油酯至脂肪酸酯的转化。
在一个实施方案中，微米或纳米尺寸的催化颗粒选自聚合物颗粒、二氧化硅颗粒、微生物细胞及其混合物。
在一个实施方案中，聚合物颗粒和二氧化硅颗粒的至少一种是磁性颗粒，所述磁性颗粒包含外壳；至少一部分被外壳封装的磁性核心；和选自无机酸基团或酶的至少一种的催化实体，所述催化实体被固定在所述外壳上，用于催化FFA至脂肪酸酯的转化，任选地用于额外地催化甘油酯至脂肪酸酯的转化。
在一个实施方案中，微生物是表达水解酶的微生物的野生型菌株或表达水解酶的重组微生物。
根据另一个方面，提供了用于从包含甘油酯和按重量计至少10％的游离脂肪酸(FFA)的组合物产生脂肪酸酯的微米或纳米尺寸的催化颗粒，所述颗粒包含具有微米或纳米范围的尺度的小体(body)；和与小体结合的用于催化游离脂肪酸(FFA)至脂肪酸酯的转化以及任选地用于额外地催化甘油酯至脂肪酸酯的转化的催化装置，其中催化颗粒适合催化包含按重量计至少10％的FFA的组合物中至少80％的FFA至脂肪酸酯的转化。
在一个实施方案中，颗粒是磁性颗粒并且小体包含外壳；和至少部分地被外壳封装的磁性核心，其中与小体结合的催化装置是固定在外壳上的催化实体，用于催化FFA至脂肪酸酯的转化，和任选地用于额外地催化甘油酯至脂肪酸酯的转化。
在一个实施方案中，磁性核心包含多个具有5至20nm的平均尺寸或直径的磁性纳米尺寸的颗粒。
在一个实施方案中，外壳是二氧化硅壳或从由聚(甲基丙烯酸缩水甘油酯)(PGMA)、聚苯乙烯(PS)和聚(甲基丙烯酸甲酯)(PMMA)组成的聚合物的组制造的聚合物壳的至少一种。
在一个实施方案中，催化实体选自无机酸基团或酶的至少一种。
在一个实施方案中，催化实体通过接头固定在聚合物壳上，所述接头选自含环氧化物官能团接头、含胺官能团接头、含醛官能团接头、含苯官能团接头、含酯官能团接头及其混合物。
在一个实施方案中，颗粒具有10至500mg酶/颗粒的单位载荷(specific loading)。
在一个实施方案中，颗粒具有0.1至3mmol H+/克颗粒的单位载荷。
在一个实施方案中，微米或纳米尺寸的催化颗粒是微生物的细胞，颗粒的小体是细胞的小体，并且与小体结合的催化装置是在细胞的小体中产生的或从细胞的小体产生的酶，所述酶用于催化FFA至脂肪酸酯的转化和任选地用于额外地催化甘油酯至脂肪酸酯的 转化。
在一个实施方案中，重组微生物包含编码酶的核酸序列，所述核酸序列与SEQ ID No.1或SEQ ID No.3或SEQ ID No.5的至少一个具有至少80％的同源性/同一性。
根据另一个方面，提供了用于产生微米或纳米尺寸的催化颗粒的方法，所述方法包括形成磁性核心；用外壳封装磁性核心的至少一部分；和将催化实体固定在外壳上，其中催化实体适合催化包含按重量计至少10％的FFA的组合物中至少80％的FFA至脂肪酸酯的转化，和任选地用于额外地催化甘油酯至脂肪酸酯的转化。
在一个实施方案中，形成磁性核心的步骤包括形成多个具有5至20nm的平均尺寸或直径的磁性纳米尺寸的颗粒。
在一个实施方案中，形成多个磁性纳米尺寸的颗粒的步骤包括共沉淀以获得磁性纳米尺寸的颗粒。
在一个实施方案中，外壳包括聚合物壳并且利用聚合物壳封装磁性核心的至少一部分的步骤包括将磁性核心与聚合物壳的一个或多个单体前体混合；和聚合单体前体以形成封装磁性核心的至少一部分的聚合物壳。在一个实施方案中，聚合物壳封装大体上整个磁性核心。
在一个实施方案中，在引发剂存在的情况下进行将磁性核心与聚合物壳的一个或多个单体前体混合的步骤。在一个实施方案中，在水存在的情况下进行将磁性核心与聚合物壳的一个或多个单体前体以及引发剂混合的步骤。
在一个实施方案中，外壳包括二氧化硅壳，利用二氧化硅壳封装至少一部分磁性核心的步骤包括将磁性核心与烷基硅酸盐、碱和醇混合以获得混合物；和从混合物的沉淀形成封装磁性核心的至少一部分的二氧化硅壳。在一个实施方案中，碱是铵。
在一个实施方案中，外壳包括二氧化硅壳，利用二氧化硅壳封装至少一部分磁性核心的步骤包括将磁性核心与四乙基正硅酸盐在含有醇和氨的水中混合以获得混合物；和从混合物沉淀二氧化硅 以形成封装磁性核心的二氧化硅壳。
在一个实施方案中，将催化实体固定至外壳的步骤包括：将催化实体与外壳的与催化实体有化学反应活性的官能团共价偶联，以将催化实体固定至外壳；或利用与催化实体有化学反应活性的官能团官能化外壳的表面；和将催化实体与官能团共价或非共价地偶联，以将催化实体固定至外壳。
根据另一个方面，提供了获得用于从包含甘油酯和按重量计至少10％的游离脂肪酸(FFA)的组合物产生脂肪酸酯的细胞催化剂的方法，所述方法包括：
a.从产生水解酶的微生物的文库鉴定微生物的菌株，所述鉴定的微生物菌株相较于文库中至少50％的其它微生物菌株能够催化更多的FFA至脂肪酸酯的转化，和任选地能够额外地催化甘油酯至脂肪酸酯的转化；
b.从步骤a)中鉴定的菌株鉴定水解酶的基因序列，所述水解酶能够催化FFA至脂肪酸酯的转化和任选地能够额外地催化甘油酯至脂肪酸酯的转化；和
c.将所述基因序列引入宿主细胞以获得重组宿主细胞，所述重组宿主细胞能够在大体上相似的条件下以比步骤a)中鉴定的微生物的菌株更多的量表达水解酶，
其中重组宿主细胞能够催化包含按重量计至少10％的FFA的组合物中至少80％的FFA至脂肪酸酯的转化和任选地能够额外地催化甘油酯至脂肪酸酯的转化。
根据另一个方面，提供了从混合物分离多个上文中公开的微米或纳米尺寸的催化颗粒的方法，所述方法包括施加外部磁场或离心力以使催化颗粒聚集在一起；和从聚集的催化颗粒除去混合物的其余部分。
根据另一个方面，提供了从包含甘油酯和按重量计至少10％的游离脂肪酸(FFA)的组合物产生脂肪酸酯的方法，所述方法包括将多个微米或纳米尺寸的催化颗粒(从上文中公开的分离多个磁性 催化颗粒的方法再循环的)与所述组合物温育以催化FFA至脂肪酸酯的转化，以便至少80％的FFA转化为脂肪酸酯，和任选地额外地催化甘油酯至脂肪酸酯的转化。
定义
如本文中所用，术语"微米"被广泛地解释为包括约1微米至约1000微米的尺度。
如本文中所用，术语"纳米"被广泛地解释为包括小于约1000nm的尺度。
如本文中所用，术语“颗粒”广泛地是指离散的实体或离散的小体。本文中描述的颗粒可包括有机、无机或生物颗粒。生物颗粒可包括生物颗粒哺乳动物细胞、血细胞、细菌细胞、细胞器以及病毒。本文中描述的使用的颗粒还可以是通过多个亚颗粒或小物体的碎片的聚集形成的大颗粒。本公开内容的颗粒可以是球形的，大体上球形的或非球形的，例如具有不规则形状的颗粒或椭圆形颗粒。术语“尺寸”，当用于指颗粒时，广泛地指颗粒的最大尺度。例如，当颗粒是大体上球形时，术语“尺寸”可指颗粒的直径；或当颗粒大体上是非球形时，术语“尺寸”可指颗粒的最大长度。
如本文中所用，术语"脂肪酸"广泛地指具有饱和的或不饱和的脂肪族尾的非酯化羧酸，或其对应的羧酸阴离子，并且可分别表示为RCOOH或RCOO-，其中R是脂肪族尾。脂肪族尾可以例如包含3至25个碳原子。
本文中使用的术语"游离脂肪酸"或"FFA"意欲包括大体上不与其它分子缔合的任何脂肪酸。例如，游离脂肪酸包括这样的脂肪酸：其羧基不共价地键合于另一种化合物。
本文中使用的术语"脂肪酸酯"广泛地指脂肪酸的酯，包括脂肪酸单酯、二酯或三酯。术语"脂肪酸酯"还意欲包括脂肪酸烷基酯例如脂肪酸甲酯(FAME)。
术语"烷基"包括具有1至50个碳原子，例如1、2、3、4、5、6、 7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20……或50个碳原子的直链或支链饱和脂肪族基团。例如，术语烷基包括但不限于甲基、乙基、1-丙基、异丙基、1-丁基、2-丁基、异丁基、叔-丁基、戊基、1,2-二甲基丙基、1,1-二甲基丙基、戊基、异戊基、己基、4-甲基戊基、1-甲基戊基、2-甲基戊基、3-甲基戊基、2,2-二甲基丁基、3,3-二甲基丁基、1,2-二甲基丁基、1,3-二甲基丁基、1,2,2-三甲基丙基、1,1,2-三甲基丙基、2-乙基戊基、3-乙基戊基、庚基、1-甲基己基、2,2-二甲基戊基、3,3-二甲基戊基、4,4-二甲基戊基、1,2-二甲基戊基、1,3-二甲基戊基、1,4-二甲基戊基、1,2,3-三甲基丁基、1,1,2-三甲基丁基、1,1,3-三甲基丁基、5-甲基庚基、1-甲基庚基、辛基、壬基、癸基等。
如本说明书中所用，除非另有所指，否则术语"偶联的"或"连接的"意欲覆盖直接连接的或通过一个或多个中间装置连接的。
本文中使用的术语“微生物”、“微生物细胞”和“微生物”广泛地指原核和真核微观生物例如细菌或原生动物、病毒或任何类型的高等生物，例如真菌、藻类、植物或动物，可将其以细胞悬浮液或细胞培养物的形式维持。
本文中使用的术语“细菌”是指原核生物域。细菌可包括但不限于至少11个不同的种类，如下：(1)革兰阳性(gram+)细菌，其存在两个主要亚类：(1)高G+C组(放线菌,分支杆菌,微球菌等等)；(2)低G+C组(芽孢杆菌属(Bacillus)、梭菌属(Clostridia)、乳杆菌属(Lactobacillus)、葡萄球菌属(Staphylococci)、链球菌属(Streptococci)、支原体属(Mycoplasmas)；(2)变形菌(Proteobacteria)，例如紫色光合+非光合革兰阴性菌(包括大部分“常见的”革兰阴性细菌)；(3)蓝藻菌例如产氧性光能利用菌；(4)螺旋体和相关物种；(5)浮霉状菌属(Planctomyces)；(6)拟杆菌属(Bacteroides)、产黄菌属(Flavobacteria)；(7)衣原体属(Chlamydia)；(8)绿硫细菌；(9)绿色非硫细菌(也是厌氧光能利用菌)；(10)抗辐射微球菌属及亲缘细菌；(11)栖热袍菌属(Thermotoga)和Thermosipho thermophiles。
“革兰阴性细菌”可包括但不限于球菌、非肠道杆状菌和肠道杆状 菌。革兰阴性细菌的属包括例如奈瑟球菌属(Neisseria)、螺旋菌属(Spirillum)、巴斯德菌属(Pasteurella)、布鲁杆菌属(Brucella)、耶尔森菌属(Yersinia)、弗朗西丝菌属(Francisella)、嗜血菌属(Haemophilus)、博德特菌属(Bordetella)、埃希氏菌属(Escherichia)、沙门菌属(Salmonella)、志贺菌属(Shigella)、克雷伯菌属(Klebsiella)、变形杆菌属(Proteus)、弧菌属(Vibrio)、假单胞菌属(Pseudomonas)、拟杆菌属(Bacteroides)、醋杆菌属(Acetobacter)、气杆菌属(Aerobacter)、土壤杆菌属(Agrobacterium)、固氮菌属(Azotobacter)、螺旋菌属(Spirilla)、沙雷菌属(Serratia)、弧菌属(Vibrio)、根瘤菌属(Rhizobium)、衣原体属(Chlamydia)、立克次体属(Rickettsia)、密螺旋体属(Treponema)和梭杆菌属(Fusobacterium)。
“革兰阳性细菌”可包括但不限于球菌(cocci)、非孢子形成杆状菌和孢子形成杆状菌。革兰阳性细菌的属包括例如放线菌属(Actinomyces)、芽孢杆菌属(Bacillus)、梭菌属(Clostridium)、棒杆菌属(Corynebacterium)、丹毒丝菌属(Erysipelothrix)、乳杆菌属(Lactobacillus)、利斯特菌属(Listeria)、分枝杆菌属(Mycobacterium)、粘球菌属(Myxococcus)、诺卡尔菌属(Nocardia)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、链球菌属(Streptococcus)和链霉菌属(Streptomyces)。
本文中使用的术语“重组微生物”和“重组宿主细胞”可互换使用，包括已进行了遗传修饰以表达或过表达内源多核苷酸、或表达非内源序列例如包含在载体中的那些，或内源基因表达减少的微生物。多核苷酸通常编码参与用于产生上述期望的代谢物的代谢途径的靶酶。因此，本文中描述的重组微生物包括已进行了遗传工程化以表达或过表达先前未被亲代微生物表达或过表达的靶酶的那些重组微生物。应理解，术语“重组微生物”和“重组宿主细胞”不仅指指定的重组微生物而且还指这样的微生物的后代或潜在后代。
上文中所用的术语“亲代微生物”是指用于产生重组微生物的细胞。术语“亲代微生物”包括已进行遗传修饰的细胞和已进行了遗传修饰但不表达或过表达靶酶的细胞。
术语“野生型”，当指微生物时，广泛地指天然存在的细胞，即还未进行遗传修饰的细胞。
术语“酶”，当在本文中使用时，广泛地指完全由或大部分由催化或促进一种或多种化学或生物化学反应的蛋白质或多肽组成的任何物质。
术语“基因”，当在本文中使用时，是指编码包含一种或多种蛋白质或酶的全部或部分的特定氨基酸序列的多核苷酸，并且可包括调控(非转录)DNA序列，例如启动子序列，其决定例如在其下基因被表达的条件。基因的转录区可包括非翻译区，包括内含子、5′-非翻译区(UTR)和3′-UTR，以及编码序列。
术语“核酸”或“重组核酸”是指多核苷酸例如脱氧核糖核酸(DNA)和，当适当时，核糖核酸(RNA)。
术语“表达”等，当与基因序列结合使用时，是指基因的转录和适当时，所得mRNA转录物至蛋白质的翻译。
本文中使用的术语“载体”广泛地指可籍以将核酸扩增和/或在生物、细胞或细胞组分之间转移的任何工具。载体可包括但不限于病毒、噬菌体、原病毒、质粒、噬菌粒、转座子和人工染色体例如YAC(酵母人工染色体)、BAC(细菌人工染色体)和PLAC(植物人工染色体)等，并且可以是“附加体”(即，可自主复制)或可整合进入宿主细胞的染色体。载体还可以是：不是天然附加型的裸露的RNA多核苷酸、裸露的DNA多核苷酸、在相同链内由DNA和RNA两者组成的多核苷酸、缀合有多聚赖氨酸的DNA或RNA、缀合有肽的DNA或RNA、缀合有脂质体的DNA等，或其可以是包含上述多核苷酸构建体的一个或多个的生物体例如农杆菌或细菌。
术语“转化”、“转染”等，当在遗传工程的上下文中使用时，是指籍以将载体引入宿主细胞的方法。转化(或转导或转染)可通过许多方法，包括电穿孔、微注射、生物微粒轰击(或微粒轰击介导的递送)或农杆菌介导的转化的任一种来实现。
如本文中所用，术语“任选地取代的”意指该术语所指的基团可不 被取代，或可被一个或多个基团取代。示例性取代基包括烷基、烯基、炔基、硫代烷基、环烷基、环烯基、杂环烷基、卤素、羧基、卤代烷基、卤代炔基、羟基、烷氧基、硫代烷氧基、烯基氧、卤代烷氧基、卤代烯氧基、硝基、氨基、硝基烷基、硝基烯基、硝基炔基、硝基杂环基、烷氨基、二烷氨基、烯胺基、炔氨基、酰基、烯酰基、炔酰基、酰氨基、二酰氨基、酰氧基、烷基磺酰氧基、杂环氧基、杂环氨基、卤代杂环烷基、烷基亚磺酰基、烷基羰氧基、烷硫基、酰硫基、含磷基团例如膦酰基和氧膦基、芳基、杂芳基、烷基芳基、烷基杂芳基、氰基、氰酸酯和异氰酸酯。
本文中使用的术语"同源性"和“同一性”是指多聚体分子之间，例如核酸分子(例如DNA分子和/或RNA分子)之间和/或多肽分子之间的总体亲缘关系。
本文中使用的术语"与……缔合"，当指两个元件时，是指两个元件之间广泛的关系。关系包括但不限于物理、化学或生物学关系。例如，当元件A与元件B缔合时，元件A与B可直接或间接彼此连接，或元件A可通过元件B产生或反之亦然。
术语"和/或"，例如"X和/或Y"被理解为意指"X和Y"或"X或Y"，并且应当被用来提供对两种含义或任一含义的明确支持。
此外，在本文中的说明中，单词“大体”，无论何时使用，被理解为包括但不限于“整个地”或“完全地”等。此外，术语例如“包含”、“包括”等，无论何时使用，意欲为非限制性描述语言，即它们广泛地包括在这样的术语之后提及的元素/组成部分，还有其它未明确提及的组成部分。此外，术语例如"约"、"大致"等，无论何时使用，通常意指合理的变化，例如公开的值的+/-5％的变化，或公开的值的4％的变化，或公开的值的3％的变化，或公开的值的2％的变化或公开的值的1％的变化。
此外，在本文中的描述中，某些值可以以以范围公开。显示范围的终点的值意欲说明优选范围。无论何时描述范围，范围意欲覆盖和教导所有可能的子范围以及该范围内的单个数值。即，范围的终点不 应当解释为不可改变的限制。例如，1％至5％的范围的描述意欲明确公开子范围1％至2％、1％至3％、1％至4％、2％至3％等，以及单个地，该范围内的值例如1％、2％、3％、4％和5％。上述特定公开内容的意图适用于任何深度/宽度的范围。
当适用时，在本领域技术人员的能力之内的化学、分子生物学、遗传工程、重组DNA的常规技术可用于帮助实践本文中公开的一个或多个步骤。技术可在教科书例如Ausubel,F.M.等人(1995和期刊补充材料；Current Protocols in Molecular Biology,第9,13和16章,John Wiley&Sons,New York,N.Y.)；B.Roe,J.Crabtree和A.Kahn,1996,DNA Isolation and Sequencing：Essential Techniques,John Wiley&Sons J.M.Polak和James O'D.McGee,1990,In Situ Hybridization：Principles and Practice；Oxford University Press；J.Sambrook,E.F.Fritsch和T.Maniatis,1989,Molecular Cloning：A Laboratory Manual,第2版,Books1-3,Cold Spring Harbor Laboratory Press；M.J.Gait(编辑),1984,Oligonucleotide Synthesis：A Practical Approach,Irl Press；D.M.J.Lilley和J.E.Dahlberg,1992,Methods of Enzymology：DNA Structure Part A：Synthesis and Physical Analysis of DNA Methods in Enzymology,Academic Press；和Lab Ref：A Handbook of Recipes,Reagents,and Other Reference Tools for Use at the Bench,Edited Jane Roskams和Linda Rodgers,2002,Cold Spring Harbor Laboratory,ISBN0-87969-630-3中获得。
详述
在下文中公开了从游离脂肪酸产生脂肪酸酯的方法和用于该方法的催化剂的示例性非限定性实施方案。
从包含按重量计至少约10％的游离脂肪酸(FFA)的组合物产生脂肪酸酯的方法可包括用将多个微米或纳米尺寸的催化颗粒与所述组合物温育，以催化至少约80％的FFA至脂肪酸酯的转化。可在醇存在的情况下进行方法。
在一个实施方案中，脂肪酸酯包括脂肪酸烷基酯。脂肪酸烷基酯可以是直链或支链脂肪酸烷基酯。烷基酯可选自甲酯、乙酯、丙酯、丁酯、戊酯、己酯及其混合物。在一个实施方案中，脂肪酸烷基酯包括脂肪酸甲酯(FAME)。本文中公开的脂肪酸可选自辛酸；癸酸；十二烷酸；十四烷酸；十六烷酸；十七烷酸；顺,顺-9,12-十八碳二烯酸；顺-9-十八碳烯酸；和十八烷酸。
本文中公开的组合物可包含按重量计至少10％的游离脂肪酸，按重量计至少约11％的游离脂肪酸，按重量计至少约12％的游离脂肪酸，按重量计至少约13％的游离脂肪酸，按重量计至少约14％的游离脂肪酸，按重量计至少约15％的游离脂肪酸，按重量计至少约20％的游离脂肪酸，按重量计至少约21％的游离脂肪酸，按重量计至少约22％的游离脂肪酸，按重量计至少约23％的游离脂肪酸，按重量计至少约24％的游离脂肪酸，按重量计至少约25％的游离脂肪酸，按重量计至少约30％的游离脂肪酸，按重量计至少约35％的游离脂肪酸，按重量计至少约40％的游离脂肪酸，按重量计至少约45％的游离脂肪酸，按重量计至少约50％的游离脂肪酸，按重量计至少约60％的游离脂肪酸，按重量计至少约70％的游离脂肪酸或至少按重计约80％的游离脂肪酸。在一个实施方案中，本文中公开的组合物包含按重量计约12％至约22％的游离脂肪酸。
在一个实施方案中，本文中公开的组合物还包含甘油酯。因此，在一个实施方案中，微米或纳米尺寸的催化颗粒能够额外地催化甘油酯至脂肪酸酯的转化。甘油酯可选自甘油三酯、甘油二酯和甘油一酯。
本文中公开的组合物可以是润滑脂。润滑脂还可以是褐色润滑脂或包含动物和/或植物油的废油。润滑脂可作为副产品获自工业或制造过程，例如获自食品工业(例如餐馆)。
本文中公开的醇可以是选自甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、戊醇和甘油的醇。在一个实施方案中，醇包括单醇。在一些实施方案中，醇具有通式R—OH，其中R表示Cn(H2n+1)并且n为从1至10的整数。适合于使用的单醇的实例包括甲醇、乙醇、正-丙醇(1-丙醇)、异丙醇(2- 丙醇)、正-丁醇(1-丁醇)、仲-丁醇(2-丁醇)、异丁醇(2-甲基-1-丙醇)、叔-丁醇(2-甲基-2-丙醇)、正-戊醇(1-戊醇)、2-戊醇、3-戊醇、2-甲基-1-丁醇、叔-戊醇(2-甲基-2-丁醇)、3-甲基-1-丁醇、3-甲基-2-丁醇、新-戊醇(2,2-二甲基-1-丙醇)、1-己醇、1-庚醇、1-辛醇或其组合。在一些实施方案中，醇可以是甲醇、乙醇、丙醇、丁醇或其组合。
在一些实施方案中，醇包括多元醇例如二醇、三醇等。在一个实施方案中，醇包括甲醇、甘油的至少一种及其混合物。醇与FFA的摩尔比可以为约2:1至约50:1、约3:1至约40:1、约4:1至约30:1、约5:1至约20:1、约6:1至约15:1、约7:1至约10:1、约7:1至约9:1、或约2:1至约8:1。醇与GTO的摩尔比可以为约2:1至约50:1、约3:1至约40:1、约4:1至约30:1、约5:1至约20:1、约6:1至约15:1、约7:1至约10:1、约7:1至约9:1、或约2:1至约8:1。在一个实施方案中，醇以超过完成反应所需的理论量的过量的量使用。
可在适合于至少80％的FFA至脂肪酸酯的转化的条件下进行温育步骤。还可在开始方法之前预先确定条件，或在反应过程中专门地确定条件。这样的条件可包括温育时间、温育温度和温育压力的至少一个。
温育温度可以是低于约150℃、低于约140℃、低于约130℃、低于约125℃、低于约120℃、低于约100℃、低于约90℃、低于约80℃、低于约70℃、低于约60℃、低于约50℃或低于约40℃的温度。在一个实施方案中，温育温度不超过约100℃或不超过约70℃。在另一个实施方案中，温育温度不超过约40℃或不超过约30℃。在一个实施方案中，当使用的醇是甲醇时，温育温度不超过70℃、不超过80℃或不超过90℃。在一个实施方案中，当使用的醇是甘油时，温育温度不超过100℃、不超过110℃、不超过120℃、不超过125℃或不超过130℃。
温育压力可以是不过约150kPa、不超过约140kPa、不超过约130kPa、不超过约125kPa、不超过约121kPa、不超过约120kPa、不超过约115kPa、不超过约110kPa,或不超过约105kPa的压力。在 一个实施方案中，温育压力大体上为标准大气压，即为1atm(101.325kPa)。在一个实施方案中，温育压力低于约7.2atm(729.54kPa)、7.0atm(709.275kPa)、6.0atm(607.95kPa)、5.0atm(506.625kPa)、4.0atm(405.3kPa)、3.0atm(303.975kPa)。
温育时间可以为约0.5小时至约100小时。在一个实施方案中，温育时间为约0.5小时至约12小时。在一个实施方案中，温育时间为约0.5小时至约26小时。在一个实施方案中，温育时间为约84小时至约96小时。
在一个实施方案中，在适合于至少80％的FFA至烷基酯的转化的条件下进行温育步骤，其中所述条件包括不超过约50℃的温育温度、不超过121kPa的温育压力或约0.5小时至约8小时的温育时间的至少一个。
添加至组合物中以进行温育的微米或纳米尺寸的催化颗粒的量可以为按组合物重量计约0.01％至约20％、约0.01％至约15％、约0.01％至约10％、约0.05％至约10％、约0.1％至约5％、约0.15％至约4.5％、约0.2％至约4.4％、约0.25％至约4.3％、约0.3％至约4.2％、约0.35％至约4.1％、约0.4％至约4.0％、约0.45％至约3.9％、约0.5％至约3.8％、约1％至约3.7％、约1％至约3.5％、约1％至约3％、或约1％至约2％。在一个实施方案中，添加至组合物以进行温育的固定在微米或纳米尺寸的催化颗粒上的酶的量为按组合物重量计约0.01％至约1％。在一个实施方案中，添加至组合物以进行温育的微米或纳米尺寸的催化颗粒的量为按组合物重量计约3.5％至约10％。在一个实施方案中，添加至组合物以进行温育的的微米或纳米尺寸的催化颗粒的量为按组合物重量计约0.1％至约20％。
温育步骤还可包括搅拌包含游离脂肪酸(FFA)的组合物、微米或纳米尺寸的催化颗粒和醇的混合物的步骤。可在约20rpm至约1200rpm下进行搅拌步骤。在一个实施方案中，可在约30rpm下进行搅拌步骤。在一个实施方案中，可在约1000rpm下进行搅拌步骤。在一个实施方案中，可在约250rpm至约500rpm下进行搅拌步骤。
在一个实施方案中，本文中公开的方法是“一锅”反应，其中将包含游离脂肪酸(FFA)的组合物、微米或纳米尺寸的催化颗粒和醇一起在一个反应容器中温育以从组合物产生脂肪酸酯。因此，可在一个单一步骤中进行脂肪酸酯的产生。因此，在一个实施方案中，当组合物包含甘油酯时，同时进行FFA至脂肪酸酯的转化和甘油酯至所述脂肪酸酯的转化。在一个实施方案中，本文中公开的方法大体上不含溶剂例如叔-丁醇或正己烷。
在另一个实施方案中，方法还可包括将甘油酯暴露于碱以催化甘油酯至脂肪酸酯的转化。可在至少约80％的FFA已转化为脂肪酸酯后将碱添加至组合物，以进一步将甘油酯转化为脂肪酸酯。碱催化剂可以是包含OH-基团的碱。在一个实施方案中，碱催化剂可以是金属氢氧化物。金属氢氧化物可选自NaOH、KOH等。碱催化剂还可选自CH3ONa,CH3OK,Na2CO3,K2CO3等。将FFA转化为脂肪酸酯的化学反应可包括酯化过程。将甘油酯转化为脂肪酸酯的化学反应可包括转酯过程。
本文中公开的方法可以能够催化至少约80％的FFA至脂肪酸酯，至少约85％的FFA至脂肪酸酯，至少约90％的FFA至脂肪酸酯，至少约95％的FFA至脂肪酸酯，至少约96％的FFA至脂肪酸酯，至少约97％的FFA至脂肪酸酯，至少约98％的FFA至脂肪酸酯，至少约99％的FFA至脂肪酸酯或至少约99.5％的FFA至脂肪酸酯的转化。
本文中公开的方法可具有至少约80％，至少约85％，至少约90％，至少约95％，至少约96％，至少约97％，至少约98％，至少约99％或至少约99.5％的脂肪酸酯例如脂肪酸甲酯(FAME)的产率。FAME产率可通过下列公式来计算：
FAME产率＝[(由公开的催化剂产生的FAME的总量)/(FAME标准)]x100(％)。FAME标准可以是通过由Novozyme435和KOH催化的两步反应获得的FAME产率。在某些实施方案中，这样的FAME标准可通过第三方校准曲线来获得，所述校准曲线使用由Novozyme435和KOH催化的两步反应。
微米或纳米尺寸的催化颗粒可具有不超过约800μm、不超过约700μm、不超过约600μm、不超过约500μm、不超过约400μm、不超过约300μm、不超过约200μm、不超过约100μm、不超过约50μm、不超过约20μm、不超过约10μm、不超过约1μm、不超过约800nm、不超过约700nm、不超过约600nm、不超过约500nm、不超过约400nm、不超过约300nm、不超过约200nm、不超过约100nm、不超过约50nm或不超过约40μm的平均尺寸或直径。在一个实施方案中，微米或纳米尺寸的催化颗粒具有约40nm至约100μm的平均尺寸或直径。在一个实施方案中，微米或纳米尺寸的催化颗粒具有约80nm至约500μm的平均尺寸或直径。在一个实施方案中，微米或纳米尺寸的催化颗粒具有约500nm至约10μm的平均尺寸或直径。在一些实施方案中，微米-尺寸催化颗粒由纳米-尺寸催化颗粒的簇组成。有利地，纳米-和微米-尺寸催化剂的高表面积/体积比率使得颗粒表面上具有高催化剂载荷，并且小的尺寸减少质量转移限制，从而导致高转化和产率。
微米或纳米尺寸的催化颗粒可以是大体上球形的，大体上长形的或大体具有无规则形状的。因此，当微米或纳米尺寸的催化颗粒是大体上球形时，平均尺寸可通过平均直径来提供。当微米或纳米尺寸的催化颗粒是大体上长形或大体上具有无规则形状时，颗粒的平均尺寸可通过平均长度来提供。
微米或纳米尺寸的催化颗粒可包括具有在微米或纳米范围内的维度的小体；和用于催化游离脂肪酸(FFA)至脂肪酸酯的转化的与小体结合的催化装置，其中催化颗粒适合催化包含按重量计至少10％的FFA的组合物中的至少80％的FFA至脂肪酸酯的转化。在一个实施方案中，微米或纳米尺寸的催化颗粒选自聚合酶颗粒、二氧化硅颗粒、微生物细胞及其混合物。
催化装置可包含酶和酸基团的至少一种。催化装置可包含超过一种酶。酶可以是脂肪酶。在一个实施方案中，酶包括水解酶。水解酶可以是选自疏绵状嗜热丝孢菌(Thermomyces lanuginosus)脂肪酶 (TLL)、南极假丝酵母(Candida antarctica)脂肪酶B(CALB)、南极假丝酵母脂肪酶A(CALA)、粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)脂肪酶(SML)、洋葱假单胞菌(Pseudomonas cepacia)脂肪酶、皱褶念珠菌(Candida rugosa)脂肪酶、伯霍尔德杆菌属(Burkholderia)脂肪酶、米赫根毛霉(Rhizomucor miehei)脂肪酶、黑曲霉菌(Aspergillus niger)脂肪酶、娄地青霉菌(Penicillium roqueforti)脂肪酶、雪白根霉(Rhizopus niveus)脂肪酶、稻根霉菌(Rhizopus oryzae)脂肪酶、产碱菌属(Alcaligenes sp.)脂肪酶、无色杆菌属(Achromo-bacter sp.)脂肪酶、施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)脂肪酶的脂肪酶。
酸基团可以是无机酸基团。酸基团可选自磺酸、杂多酸及其混合物。在一个实施方案中，磺酸来源于甲磺酸、苯磺酸或丙磺酸的至少一种。在一个实施方案中，酸基团包括磺酸基团。在一个实施文案中，当微米或纳米尺寸的催化颗粒包括聚(甲基丙烯酸缩水甘油酯)(PGMA)颗粒时，磺酸基团来源于甲磺酸。在一个实施方案中，当微米或纳米尺寸的催化颗粒包括聚苯乙烯(PS)颗粒时，磺酸基团来源于苯磺酸。在一个实施方案中，当微米或纳米-尺寸催化颗粒包括二氧化硅颗粒时，磺酸基团来源于丙磺酸。当催化装置是酸基团时，微米或纳米尺寸的催化颗粒可具有约0.1至约3mmol H+/克颗粒的单位H+载荷。单位H+载荷可以为每克颗粒约0.1mmol H+、约0.2mmol H+、约0.3mmol H+、约0.4mmol H+、约0.5mmol H+、约0.6mmol H+、约0.7mmol H+、约0.8mmol H+、约0.9mmol H+、约1.10mmol H+、约1.20mmol H+、约1.30mmol H+、约1.40mmol H+、约1.50mmol H+、约1.60mmol H+、约1.70mmol H+、约1.80mmol H+、约1.90mmol H+、约2.0mmol H+、约2.10mmol H+、约2.20mmol H+、约2.30mmol H+、约2.40mmol H+、约2.50mmol H+、约2.60mmol H+、约2.70mmol H+、约2.80mmol H+、约2.90mmol H+或约3.0mmol H+。在一个实施方案中，微米-或纳米-尺寸催化颗粒具有约0.5至约2.3mmol H+/克颗粒的单位H+载荷。在一个实施方案中，微米-或纳米-尺寸催化颗粒具有约2.3mmol H+/克颗粒的单位H+载荷。在一个实施方案中，微米-或 纳米-尺寸催化颗粒具有约2.25mmol H+/克颗粒的单位H+载荷。在一个实施方案中，微米-或纳米-尺寸催化颗粒具有约0.54mmol H+/克颗粒的单位H+载荷。在一个实施方案中，微米-或纳米-尺寸催化颗粒具有约1.11mmol H+/克颗粒的单位H+载荷。
微米或纳米尺寸的催化颗粒可以是磁性颗粒。磁性颗粒可以是顺磁性颗粒。磁性颗粒的小体可包括外壳；和被外壳至少部分封装的磁性核心，其中与小体结合的催化装置是固定在外壳上的催化实体，用于催化FFA至脂肪酸酯的转化。在一个实施方案中，聚合物壳封装大体上整个磁性核心。在一个实施方案中，磁性核心包含多个磁性纳米-尺寸颗粒。磁性核心可通过为非交联的并且可以可逆地彼此分离的磁性纳米-尺寸颗粒的簇形成。磁性纳米-尺寸颗粒可具有直径为约40nm至约800nm的大体上均一的尺寸分布。磁性纳米-尺寸颗粒可具有约5nm至约30nm、约5nm至约20nm、约5nm至约15nm或约8nm至约20nm的平均尺寸或直径。磁性纳米-尺寸颗粒可被封端剂(capping agent)涂覆。封端剂可以是酸。不受理论束缚，相信封端剂可在磁性颗粒之间提供位阻以改善稳定性。封端剂可选自油酸、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、柠檬酸三钠、溴化十六烷基三甲铵(CTAB)和油胺。磁性核心的磁性性质可通过金属氧化物来提供。金属氧化物的金属可选自过渡金属。在一个实施方案中，金属氧化物的金属选自元素周期表的第6族、第7族或第8族的金属。金属氧化物可选自Fe3O4、γ-Fe2O3、FeCo、MnFe2O4和CoFe2O4。在一个实施方案中，金属氧化物包括氧化铁(Fe3O4)。因此，在一个实施方案中，磁性纳米-尺寸颗粒为涂覆有油酸的氧化铁纳米-尺寸颗粒。
外壳是聚合物壳或二氧化硅壳的至少之一。聚合物可选自聚(甲基丙烯酸缩水甘油酯)(PGMA)、聚苯乙烯(PS)、聚(甲基丙烯酸甲酯)(PMMA)、聚(乙酸乙烯酯)(PVAc)、聚(乙烯醇)(PVA)和聚(乙二醇)(PEG)。在一个实施方案中，外壳包含选自聚(甲基丙烯酸缩水甘油酯)(PGMA)、聚苯乙烯(PS)、聚(甲基丙烯酸甲酯)(PMMA)、二氧化硅及其混合物的材料。当催化实体包含酶时，酶可通过接头固定在外壳 上，所述接头选自含环氧化物官能团接头、含胺官能团接头、含醛官能团接头、含苯官能团接头、含酯官能团接头、含酐官能团接头、含碳酸酯官能团接头、含酰叠氮官能团接头、含异氰酸酯官能团接头、含羧酸苯酯官能团接头及其混合物。在一个实施方案中，接头是4,7,10-三氧-1,13-十三烷二胺。在一个实施方案中，接头通过将颗粒的外壳与胺和醛的至少一种反应来获得。胺可以是乙二胺(EDA)，醛可以是戊二醛(GA)。在一个实施方案中，外壳表面上的醛基团通过胺表面基团与戊二醛的反应来引入。
微米或纳米尺寸的催化颗粒可具有约5mg至约500mg酶/克颗粒的单位载荷。单位载荷可以为约10mg、约20mg、约30mg、约40mg、约50mg、约60mg、约70mg、约80mg、约90mg、约100mg、约110mg、约120mg、约130mg、约140mg、约150mg、约160mg、约170mg、约180mg、约190mg、约200mg、约210mg、约220mg、约230mg、约240mg、约250mg、约260mg、约270mg、约280mg、约290mg、约300mg enzyme、约310mg、约320mg、约330mg、约340mg、约350mg、约360mg、约370mg、约380mg、约390mg、约400mg、约410mg、约420mg、约430mg、约440mg、约450mg、约460mg、约470mg、约480mg、约490mg或约500mg酶/克颗粒。在一个实施方案中，微米-尺寸催化颗粒具有约10至约100mg酶/克颗粒的单位载荷。在另一个实施方案中，纳米-尺寸催化颗粒可具有约10至约300mg酶/克颗粒的单位载荷。
鉴于上述内容，在一个实施方案中，还提供了产生上述微米或纳米尺寸的催化颗粒的方法。方法可包括形成磁性核心；利用外壳封装磁性核心的至少一部分；和将催化实体固定在外壳上，其中催化实体适合催化包含按重量计至少10％的FFA的组合物中的至少80％的FFA至脂肪酸酯的转化。形成磁性核心的步骤可包括形成多个磁性纳米-尺寸颗粒。形成多个磁性纳米-尺寸颗粒的步骤可包括共沉淀以获得磁性纳米-尺寸颗粒。
在一个实施方案中，当外壳是聚合物壳时，利用聚合物壳封装磁 性核心的至少一部分的步骤包括将磁性核心与聚合物壳的单体前体混合；和聚合单体前体以形成封装磁性核心的至少一部分的聚合物壳。聚合反应可以是自由基聚合反应。聚合反应可通过在磁性核心存在的情况下添加引发剂例如过硫酸铵(APS)和相关单体来进行，以获得磁性微米或纳米颗粒。
在另一个实施方案中，当外壳是二氧化硅壳时，用二氧化硅壳封装磁性核心的步骤包括将磁性核心与四乙基正硅酸盐在包含醇和氨的水中混合以获得混合物；和从混合物沉淀二氧化硅以形成封装磁性核心的二氧化硅壳。在一个实施方案中，用二氧化硅壳封装磁性核心的步骤包括使用![]()
法。
将催化实体固定至外壳的步骤可包括将催化实体化学偶联至外壳或将催化实体物理地吸附至外壳的至少之一。将催化实体化学地偶联至外壳的步骤可包括将聚合物或二氧化硅颗粒添加至酸溶液，以将来源于酸溶液的催化实体固定至外壳。将聚合物或二氧化硅颗粒添加至酸溶液的步骤可在环境条件下进行。将催化实体化学偶联至外壳可包括将催化实体与外壳的与催化实体有化学反应活性的官能团共价缀合，以将催化实体固定至外壳；或利用与催化实体有化学反应活性的官能团官能化外壳的表面；和共价地或非共价地将催化实体与官能团偶联以将催化实体固定至外壳。官能化外壳的表面的步骤可包括(i)将包含有机胺基的溶液添加至聚合物颗粒；(ii)在第一温育温度下温育混合物；(iii)在步骤(ii)后将醛添加至混合物；和(iv)在第二温育温度下温育步骤(iii)的混合物。第一温育温度可高于室温，并且可超过约50℃。第一温育温度可以在约室温，并且可低于约50℃。利用官能团化学偶联催化实体以将催化实体固定至外壳的步骤可包括在适当的缓冲剂存在的情况下，将酶添加至包含与催化实体有化学反应活性的官能团的外壳，和在约40℃或更低温度温育混合物。
在一个实施方案中，微米-或纳米-尺寸催化磁性颗粒适合于重复使用，以进行多个循环，其中包含按重量计约10％的(FFA)的组合物中的至少约80％的FFA在每一个循环中被转化为脂肪酸。多个循环 可以为2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个循环。可通过施加磁场以进行收集来收集微米-或纳米-尺寸催化磁性颗粒以进行再循环或再利用。
因此，还提供了从混合物分离本文中公开的磁性催化颗粒的方法，所述方法包括施加外部磁场以将磁性催化颗粒聚集在一起；和从聚集的磁性催化颗粒除去混合物的其余部分。还提供了从包含按重量计至少10％的游离脂肪酸(FFA)的组合物产生脂肪酸酯的方法，所述方法包括将多个获自上述分离方法的再循环的微米或纳米尺寸的催化颗粒与所述组合物温育，以催化FFA至脂肪酸酯的转化，以便至少80％的FFA被转化为脂肪酸酯。
在一个实施方案中，微米-尺寸颗粒为包含具有固定在纳米颗粒表面上的疏绵状嗜热丝孢菌脂肪酶(TLL)的CHO-磁性纳米颗粒(CHO-MNP)的非交联簇的MNA TL颗粒，所述纳米颗粒包含氧化铁核心、聚(甲基丙烯酸缩水甘油酯)壳和醛表面基团。MNA TL(利用疏绵状嗜热丝孢菌脂肪酶固定的磁性纳米生物催化剂聚集体)颗粒可通过在4-30℃摇动浓度为7mM、pH5-8的磷酸盐缓冲液中的TLL和CHO-MNP，进行0.5-12h来制备。
在另一个实施方案中，微米-尺寸颗粒为聚(甲基丙烯酸缩水甘油酯)微粒，其包含具有固定在纳米颗粒表面上的南极假丝酵母脂肪酶B(CALB)的CHO功能化磁性纳米颗粒(CHO-MNP)的非交联簇，所述纳米颗粒包含氧化铁核心、聚(甲基丙烯酸缩水甘油酯)壳和醛表面基团。MNA CA(利用CALB固定的磁性纳米生物催化剂聚集体)颗粒可通过在4-30℃摇动浓度为7mM、pH5-8的磷酸盐缓冲液中的CALB和CHO-MNP，进行0.5-12h来制备。
在另一个实施方案中，纳米-尺寸颗粒包括具有固定在纳米颗粒表面上的南极假丝酵母脂肪酶B(CALB)的聚(甲基丙烯酸缩水甘油酯)磁性纳米颗粒(GA-MNP)，所述纳米颗粒包含氧化铁核心、聚(甲基丙烯酸缩水甘油酯)壳和醛表面基团。GAP CA颗粒可通过在4-30℃摇动pH7的磷酸盐缓冲液中的CALB和GA-MNP，进行 4-12h来制备。
在另一个实施方案中，纳米-尺寸颗粒包含具有固定在纳米颗粒表面上的南极假丝酵母脂肪酶B(CALB)的乙二胺功能化的磁性纳米颗粒(EDA-MNP)，所述纳米颗粒包含氧化铁核心、聚(甲基丙烯酸缩水甘油酯)壳和胺表面基团。EDAP CA颗粒可通过在4-30℃摇动pH7的磷酸盐缓冲液中的CALB、戊二醛和EDA-MNP，进行4-12h来制备。
在另一个实施方案中，纳米-尺寸颗粒包含具有固定在纳米颗粒表面上的南极假丝酵母脂肪酶B(CALB)的聚苯乙烯磁性纳米颗粒(PS-MNP)，所述纳米颗粒包含氧化铁核心、聚苯乙烯壳和苯基表面基团。PSP CA颗粒可通过在4-30℃摇动pH7的磷酸盐缓冲液中的CALB和PS-MNP，进行4-12h，将CALB物理吸附至纳米颗粒上来制备。
在另一个实施方案中，纳米-尺寸颗粒包含具有固定在纳米颗粒表面上的南极假丝酵母脂肪酶B(CALB)的聚(甲基丙烯酸甲酯)磁性纳米颗粒(PMMA-MNP)，所述纳米颗粒包含氧化铁核心、聚(甲基丙烯酸甲酯)壳和酯表面基团。PSP CA颗粒可通过在4-30℃摇动pH7的磷酸盐缓冲液中的CALB和PMMA-MNP，进行4-12h将CALB物理吸附至纳米颗粒上来制备。
在一些实施方案中，可在除了微米或纳米尺寸的催化颗粒以外还存在硅胶微珠的情况下进行所述方法。
在一个实施方案中，微米或纳米尺寸的催化颗粒是微生物的细胞，其中颗粒的小体是细胞的小体，与小体结合的催化装置是在细胞的小体中产生的或从细胞的小体产生的用于催化FFA至脂肪酸酯的转化的酶。与小体结合的催化装置可以是可以相同或不同的多个酶。酶可以是脂肪酶例如甘油三酯脂肪酶(EC3.1.1.3)。在一个实施方案中，酶包括水解酶。水解酶可以是来自或来源于下列脂肪酶的脂肪酶：粘质沙雷氏菌脂肪酶(SML)、疏绵状嗜热丝孢菌脂肪酶(TLL)、南极假丝酵母脂肪酶A(CALA)、南极假丝酵母脂肪酶B(CALB)、米赫根毛霉脂 肪酶、黑曲霉菌脂肪酶、皱褶念珠菌脂肪酶、娄地青霉菌脂肪酶、雪白根霉脂肪酶、稻根霉菌脂肪酶、产碱菌属脂肪酶、无色杆菌属脂肪酶、洋葱伯霍尔德杆菌(Burkholderia cepacia)脂肪酶、施氏假单胞菌脂肪酶、米黑毛霉(Mucor miehei)脂肪酶、洋葱假单胞菌脂肪酶和米曲霉脂肪酶，以及任何变体，所述变体具有与这些脂肪酶之一具有至少约70％同源性/同一性，至少约80％同源性/同一性，至少约90％同源性/同一性，至少约95％同源性/同一性，至少约96％同源性/同一性，至少约97％同源性/同一性，至少约98％同源性/同一性，至少约99％同源性/同一性或约100％同源性/同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，变体可与上文所列脂肪酶之一具有达到10个、达到9个、达到8个、达到7个、达到6个或达到5个氨基酸的改变，其中每一个氨基酸改变是任意组合的氨基酸置换、缺失或添加。在一个实施方案中，氨基酸置换是保守置换。
微生物可以是表达水解酶的微生物的野生型菌株。在一个实施方案中，微生物的野生型菌株是或来源于粘质沙雷氏菌、疏绵状嗜热丝孢菌、南极假丝酵母、米赫根毛霉、黑曲霉菌、米曲霉菌、米黑毛霉、皱褶念珠菌、娄地青霉菌、雪白根霉、稻根霉菌、米赫根毛霉、产碱菌属、无色杆菌属、洋葱伯霍尔德杆菌、施氏假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)、洋葱假单胞菌、短小芽胞杆菌(Bacillus pumilus)、热链形芽孢杆菌(B.thermocatenulatus)、枯草芽孢杆菌(B.subtilis)、地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)、芽孢乳酸菌(B.coagulans)、蜡样芽孢杆菌(B.Cereus)、洋葱伯霍尔德杆菌和嗜碱芽孢杆菌(B.halodurans)。其它属如不动杆菌属(Acinetobacter)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、链球菌属(Streptococcus)、伯霍尔德杆菌属(Serratia)、无色杆菌属(Achromobacter)、节杆菌属(Arthrobacter)、产碱菌属(Alcaligenes)和色杆菌属(Chromobacterium)。微生物还可以是表达一种或多种是/来源于一个或多个野生型菌株的水解酶的重组微生物。因此，重组微生物可包含编码一个或多个来源于上文中提供的微生物的列表的一个 或多个外源核酸序列。
在一个实施方案中，重组微生物是或来源于大肠杆菌(E.coli),稻根霉菌,巴斯德毕赤酵母或酿酒酵母的至少一种。在一个实施方案中，在大肠杆菌中克隆和表达来源于野生型菌株的水解酶(其基因序列已被报道)。在一个实施方案中，水解酶来源于南极假丝酵母的脂肪酶CALB(Genbank登录号Z30645.1)。因此，在一些实施方案中，还可在重组大肠杆菌中克隆和表达来自野生型菌株的基因序列。
编码南极假丝酵母(Genbank登录号Z30645.1)的脂肪酶CALB的核苷酸序列示于下文的SEQ ID No1中。
SEQ ID No1：脂肪酶B的南极假丝酵母核酸序列(Genbank登录号Z30645.1)
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来自南极假丝酵母的脂肪酶CALB的多肽序列(Genbank登录号Z30645.1)示于下列SEQ ID No2中。
SEQ ID No2：脂肪酶B的南极假丝酵母氨基酸序列(Genbank登录号Z30645.1)
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编码来自疏绵状嗜热丝孢菌的脂肪酶TLL的核苷酸序列(Genbank登录号AF054513.1)示于下列SEQ ID No3中。
SEQ ID No3：脂肪酶TLL的疏绵状嗜热丝孢菌核酸序列(Genbank登录号EU022703.1)
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来自疏绵状嗜热丝孢菌的脂肪酶TLL的多肽序列(Genbank登录号EU022703.1)示于下列SEQ ID No4。
SEQ ID No4：脂肪酶TLL的疏绵状嗜热丝孢菌氨基酸序列(Genbank登录号EU022703.1)
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鉴于上述内容，在一个实施方案中，还提供了获得上述细胞催化剂的方法。在一个实施方案中，方法包括a)从产生水解酶的微生物的文库鉴定微生物的菌株，所述鉴定的微生物的菌株相较于文库中至少约50％的其它微生物菌株能够催化更多FFA至脂肪酸酯的转化；b)从步骤a)中鉴定的菌株鉴定水解酶的基因序列，所述水解酶能够催化FFA至脂肪酸酯的转化；和c)将基因序列引入宿主细胞以获得重组宿主细胞，所述重组宿主细胞能够在大体上相似的条件下以比步骤a)中鉴定的微生物的菌株更多的量表达水解酶，其中重组宿主细胞能够催化包含按重量计至少10％的FFA的组合物中的至少80％的FFA至脂肪酸酯的转化。水解酶可以是选自上述脂肪酶的脂肪酶。鉴定的微生物菌株可以是相较于文库中至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％的其它微生物菌株能够催化更多的FFA至脂肪酸酯的转化的微生物菌株。在一个实施方案中，鉴定的微生物菌株可以是能够相较于文库中的所有其它微生物菌株催化更多的FFA至脂肪酸酯的转化的微生物菌株。有利地，公开的方法提供了简单高效的方式来发现具有高脂肪酶活性的新型菌株，例如通过施加选择压力。方法还可用于使用于生物柴油生产的酶来源多样化。通过使用开发的完整细胞生物催化剂，生物柴油的生产成本可因它们可以以低成本大量容易地获得而潜在地极大地降低。
在一个实施方案中，步骤c)中获得的重组宿主细胞能够在大体上相同的条件下相较于步骤a)中鉴定的微生物菌株将更多的FFA转化为脂肪酸酯。通过步骤c)中获得的重组微生物产生的FFA至脂肪酸酯的转化百分比可以为步骤a)中鉴定的微生物菌株的至少1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、1.6倍、1.7倍、1.8倍、1.9倍、2倍、3倍、4倍、5倍或10倍。通过步骤c)中获得的重组微生物产生的用于FFA至脂肪酸酯的转化的水解酶的量可以为步骤a)中鉴定的微生物菌株的至少1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、1.6倍、1.7倍、1.8倍、1.9倍、2倍、3倍、4倍、5倍或10倍。通过步骤c)中获得的重组微生物产生的FFA至脂肪酸酯的转化活性为步骤a)中鉴定的微生物菌株的至少1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、1.6倍、1.7倍、1.8倍、1.9倍、2倍、3倍、4倍、5倍或10倍。
步骤c)的引入可包括载体的使用。因此，可制备鉴定的外源基因，并将其插入表达载体，随后将载体转染入宿主细胞，随后可在适合于表达所述外源基因的培养条件下生长所述宿主细胞。适当的培养条件是培养基pH、离子强度、营养物含量等；温度；氧气/CO2/氮气含量；温度的条件；以及允许通过宿主微生物即通过微生物的代谢作用产生化合物的其它培养条件。
在一些实施方案中，可在生物反应器中培养重组微生物。生物反应器可用于培养微生物细胞，贯穿它们的生理周期的各个时期。生物反应器还可允许控制一个或多个培养条件例如温度、pH、氧张力、二氧化碳水平等，以及其组合。还可将细胞培养在摇瓶、试管、小瓶、微量滴定皿、皮氏培养皿等或其组合中。
在一个实施方案中，鉴定能够催化FFA至脂肪酸酯的转化的微生物菌株的步骤a)包括a1)获得土壤的样品；a2)筛选土壤中的显示水解酶活性的微生物；和a3)从在步骤a2)中的鉴定的显示水解酶活性的文库筛选微生物的菌株，所述菌株相较于文库中的至少约50％的其它微生物菌株能够催化更多的FFA转化为脂肪酸酯。
在一个实施方案中，鉴定的基因的核苷酸序列示于SEQ ID No. 5。
SEQ ID No5：粘质沙雷氏菌的脂肪酶TLL的核酸序列(Genbank登录号DQ841349)
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在一个实施方案中，鉴定的基因编码包含SEQ ID No.6所示的氨基酸序列的多肽。
SEQ ID No6：粘质沙雷氏菌的脂肪酶的氨基酸序列(Genbank登录号DQ841349)
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由于遗传密码的简并性性质，因此应理解，多个核苷酸序列不同的DNA化合物可用于编码本公开内容的给定的氨基酸序列。编码本文中描述的生物合成酶的天然DNA序列仅仅举例说明本公开内容的实施方案，本公开内容包括编码用于本公开内容的方法的酶的多肽和蛋白质的氨基酸序列的任何序列的DNA化合物。因此，应理解，编码与本文中描述的多肽/酶同源的多肽的分离的核酸分子还可通过将一个或多个核苷酸置换、添加或缺失引入编码特定多肽的核苷酸序列(以便将一个或多个氨基酸置换、添加或缺失引入编码的蛋白质而无期望的活性的丢失或显著丢失)来产生。可通过标准方法例如定点诱变和PCR介导的诱变将突变引入多核苷酸。
因此，本文中公开的微生物的一些实施方案可包含编码能够催化FFA至脂肪酸酯的转化的水解酶的DNA序列，所述DNA序列与SEQ ID No.1、SEQ ID No.3或SEQ ID No.5的至少一个具有至少约70％同源性/同一性，至少约80％同源性/同一性，至少约90％同源性/同一性，至少约95％同源性/同一性，至少约96％同源性/同一性，至少约97％同源性/同一性，至少约98％同源性/同一性，至少约99％同源性/同一性或约100％同源性/同一性。在一个实施方案中，微生物是包含与SEQ ID1具有至少80％的同源性/同一性的DNA序列和与SEQ ID3具有至少约80％同源性/同一性的DNA序列的重组微生物。在一个实施方案中，微生物是包含与SEQ ID5具有至少80％的同源性/同一性的DNA序列的重组微生物。
同样地，多肽通常可耐受其氨基酸序列的一个或多个氨基酸置换、缺失和插入而不丧失或明显丧失期望的活性。因此，本文中公开的微生物的一些实施方案还可表达能够催化FFA至脂肪酸酯的转化的多肽，所述多肽包含与SEQ ID No.2和/或SEQ ID No.4和/或SEQ ID No.6具有至少约70％的同源性/同一性，至少约80％的同源性/同一性，至少约90％的同源性/同一性，至少约95％的同源性/同一性，至少约96％的同源性/同一性，至少约97％的同源性/同一性，至少约98％的同源性/同一性，至少约99％的同源性/同一性或约100％的同源性/同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，多肽可与SEQ ID No.2或SEQ ID No.4或SEQ ID No.6具有达到10个、达到9个、达到8个、达到7个、达到6个或达到5个氨基酸的改变，其中每一个氨基酸的改变是任意组合的氨基酸置换、缺失或添加。在一个实施方案中，氨基酸置换是保守置换。在一个实施方案中，微生物是表达与SEQ ID No.2具有至少80％的同源性/同一性的水解酶和与SEQ ID No.4具有至少80％的同源性/同一性的水解酶的重组微生物。在一个实施方案中，微生物是表达与SEQ ID No.6具有至少80％的同源性/同一性的水解酶的重组微生物。
在一个实施方案中，修饰/改变的多肽或酶的催化活性相对于未修饰的多肽或酶的催化活性可减小不超过约5％，不超过约10％，不超过约15％或不超过约20％。本公开内容包括这样的具有替代氨基酸序列的多肽，并且由本文中描述的DNA编码的氨基酸序列仅仅举例说明本公开内容的实施方案。
为了重组蛋白的最佳表达，可有益地使用产生具有被待转化的宿主细胞优先使用的密码子的mRNA的编码序列。因此，为了增强转基因的表达，可将转基因的密码子使用与期望在其中表达所述转基因的生物体的特定密码子偏爱匹配。因此，本公开内容还在一些实施方案中提供了利用分离的核酸分子转化的重组微生物，所述分离的核酸分子包括针对重组微生物中的表达进行了密码子优化的核酸序列。在一些实施方案中，本公开内容还提供了利用分离的核酸分子转化的重组微生物，所述核酸分子包括有效地连接于一个或多个表达控制元件的核酸序列。
在一些实施方案中，通过适当的表达载体的引入利用外源基因转化本公开内容的重组微生物。表达载体可以是质粒、质粒的一部分、 病毒构建体、核酸片段等或其组合。可通过阅读本公开内容，利用在本领域技术人员的能力范围内的转化和/或转染技术将载体引入原核和真核细胞。用于将外来核酸(例如，外源DNA)引入宿主细胞的方法可包括磷酸钙和/或氯化钠共沉淀、DEAE-葡聚糖-介导的转染、脂转染、自然感受态、化学介导的转移、电穿孔、颗粒轰击等或其组合。
载体还可包括促进目标转基因(例如，外源脂肪酶基因)表达的序列，例如启动子，以及可任选地包括用于在真核细胞中表达的内含子序列、具有多腺苷酸化信号的序列等或其组合。或者，载体不包含与目标基因有效连接的启动子，则可将基因转化进入细胞以便其将通过同源重组、位点特异性整合和/或载体整合有效地连接于内源启动子。
由于本公开内容提供了用于异源表达一个或多个参与水解酶表达的基因，因此包括这样的核酸的重组表达载体包括在本公开内容的范围内。
本公开内容的多核苷酸可按照本领域技术人员的能力之内的PCR扩增技术和下文实施例部分中描述的那些方法，使用cDNA、mRNA或可选择地基因组DNA(作为模板)和适当的寡核苷酸引物来进行扩增。可将所扩增的核酸克隆进入适当的载体，利用DNA序列分析来表征。此外，对应于核苷酸序列的寡核苷酸可通过在本领域技术人员的能力范围内的合成技术，例如使用自动化DNA合成仪来制备。
在一个实施方案中，本文中描述的微米或纳米尺寸的催化颗粒是微生物的冻干细胞。微生物的细胞的冷冻干燥可通过真空冷冻干燥约24小时至约72小时来进行。
在一个实施方案中，本文中描述的微米或纳米尺寸的催化颗粒是微生物的冻干细胞，并且适用于重复多循环使用，其中包含按重量计约10％的(FFA)的组合物中的至少约80％的FFA在每一个循环中被转化为脂肪酸。多个循环可以是2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个循环。可通过施加离心力以进行收集来收集冻干细胞，以进行再循环或再使用。
因此，还提供了从混合物分离本文中公开的催化颗粒的方法，所 述方法包括施加离心力以将催化颗粒聚集在一起；和从聚集的催化颗粒除去混合物的其余部分。还提供了从包含按重量计至少10％的游离脂肪酸(FFA)的组合物产生脂肪酸酯的方法，所述方法包括将多个获自上述分离法的再循环的微米或纳米尺寸的催化颗粒与所述组合物温育，以催化FFA至脂肪酸酯的转化，以便至少80％的FFA被转化为脂肪酸酯。
附图概述
图1是显示按照本文中公开的一个实施方案，在使用纳米-和微米-生物催化剂，利用在一锅法中同时进行的酯化和转酯反应从隔油池油(GTO)产生脂肪酸甲酯(FAME)中发生的化学反应的示意图。图1中的Rx、R1、R2和R3代表可以彼此相同或不同的脂肪族基团。
图2是显示按照本文中公开的一个实施方案，在通过两个步骤：a)使用纳米和微米生物催化剂利用甲醇酯化游离脂肪酸(FFA)；b)使用碱催化剂利用甲醇对甘油三酯(TG)进行转酯从隔油池油(GTO)产生脂肪酸甲酯(FAME)中发生的化学反应流程图的示意图。图2中的Rx、R1、R2和R3代表可以彼此相同或不同的脂肪族基团。
图3是显示按照本文中公开的一个实施方案，包含水解酶MNA(磁性纳米生物催化剂聚集体)的磁性纳米-和微米-生物催化剂的合成的流程图的示意图，其中水解酶可以是MNA CA(CA：南极假丝酵母脂肪酶B)或MNA TL(TL：疏绵状嗜热丝孢菌脂肪酶)。
图4是按照本文中公开的一个实施方案的CHO-MNP的透射电子显微镜(TEM)图像。
图5a是按照本文中公开的一个实施方案的MNA CA的显微图像。
图5b是按照本文中公开的一个实施方案，在冷冻干燥和在GTO中重新分散后MNA TL的显微图像。
图6显示按照本文中公开的一个实施方案通过在时间a)t＝0和b)t＝1min通过使用磁铁从混合物分离MNA CA的照片，和按照本文中公开的另一个实施方案在时间c)t＝0和d)t＝1min通过使用磁铁从 GTO分离MNA TL的照片。
图7是显示按照本文中公开的一些实施方案的磁性纳米-和微米-生物催化剂颗粒，即水解酶PMMP、水解酶PSP、水解酶EDAP和水解酶GAP的合成方案的示意图。如本文中所述，水解酶可以是南极假丝酵母脂肪酶B(CA)，以便催化颗粒包括根据本文中公开的一些实施方案的PMMP CA、PSP CA、EDAP CA和GAP CA。
图8a是按照本文中公开的一些实施方案的PMMA-MNP的透射电子显微镜(TEM)图像。
图8b是按照本文中公开的一个实施方案的PS-MNP的透射电子显微镜(TEM)图像。
图8c是按照本文中公开的一个实施方案的EDA-MNP的透射电子显微镜(TEM)图像。
图9a是按照本文中公开的一个实施方案的FAME标准产生的GC色谱图。
图9b是按照本文中公开的一个实施方案在利用MNA TL催化的一锅法反应中从GTO产生的FAME的GC色谱。
图10是按照本文中公开的一些实施方案在一锅法反应中从GTO产生FAME的图，其中将12小时后FFA转化和FAME产率针对不同的MNA TL的载荷作图。(●)表示FFA转化，(■)表示FAME产率。
图11是显示按照本文中公开的一些实施方案，通过利用不同的生物催化剂在一锅法反应中利用甲醇生物转化润滑脂产生FAME的时间过程的曲线图，在1g的规模上：(■)表示3.3wt％的MNA TL(0.2wt％的TLL)，(●)表示3.3wt％的![]()
表示0.2wt％的游离TLL；在30g的规模上：(▲)表示3.3wt％的MNA TL。
图12是显示根据本文中公开的一些实施方案，当将MNA TL再循环进行不同循环次数时从GTO的FAME转化的条形图。
图13是显示按照本文中公开的一些实施方案，在利用不同量的MNA CA进行4小时后GTO中的FFA的酯化转化的曲线图。
图14是显示按照本文中公开的实施方案，利用由(■)表示的0.45 wt％的MNA CA(0.01wt％的CALB)；由(●)表示的0.01wt％的游离CALB，和由(▲)表示的0.45wt％的![]()
催化的利用甲醇进行的润滑脂的生物转化的FFA转化的时间过程的曲线图。
图15是显示按照本文中公开的一些实施方案，当将MNA CA再循环不同循环次数时从GTO的FFA酯化转化的条形图。
图16是显示按照本文中公开的一些实施方案，利用PMMAP-30CA和PMMAP-4CA催化的GTO中的FFA的酯化的时间过程的曲线图。
图17是显示按照本文中公开的一些实施方案，利用PSP-30CA和PSP-4CA催化的GTO中的FFA的酯化的时间过程的曲线图。
图18是显示按照本文中公开的一些实施方案，利用GAP-30CA、GAP-4CA和EDAP-30CA催化的GTO中的FFA的酯化的时间过程的曲线图。
图19是显示按照本文中公开的一些实施方案，当将PMMAP CA再循环不同循环次数时从GTO的FFA酯化转化的的条形图。
图20是显示按照本文中公开的一个实施方案，通过两个步骤从润滑脂产生生物柴油(在该情况下，FAME)中发生的化学反应的示意图，所述两个步骤是：a)I)使用可再循环的纳米-或微米-尺寸顺磁性固体酸催化剂，利用甲醇酯化润滑脂中的FFA；II)使用碱催化剂，利用甲醇对润滑脂中的剩余甘油三酯进行转酯；b)I)使用可再循环的纳米-或微米-尺寸顺磁性固体酸催化剂，利用甘油酯化润滑脂中的FFA；II)使用碱催化剂利用甲醇对润滑脂中的甘油三酯进行转酯。图20中的Rx、R1、R2和R3表示可以彼此相同或不同的脂肪族基团。
图21是显示按照本文中公开的一些实施方案的可再循环的纳米-和微米-尺寸顺磁性固体酸催化剂的合成方案的示意图。
图22是按照本文中公开的一些实施方案的纳米-尺寸SO3H-PGMA-MNP的透射电子显微镜(TEM)图像。
图23是显示按照本文中公开的一些实施方案，在通过使用纳米-和微米-尺寸固体酸催化剂，相较于Amberlyst15，利用甲醇酯化FFA 后润滑脂中的FFA含量的曲线。
图24显示按照本文中公开的一个实施方案，通过在时间t＝0和时间t＝5s时使用磁铁从混合物分离纳米-尺寸固体酸催化剂SO3H-PGMA-MNP的照片。
图25是显示按照本文中公开的一些实施方案，当将纳米-尺寸固体酸催化剂SO3H-PGMA-MNP再循环不同循环次数时，在甲醇存在的情况下润滑脂中的FFA的酯化转化的条形图。
图26是按照本文中公开的一些实施方案的纳米尺寸SO3H-PS-MNP的透射电子显微镜(TEM)图像。
图27是按照本文中公开的一些实施方案，当将纳米-尺寸固体酸催化剂SO3H-PS-MNP再循环不同循环次数时，在甲醇存在的情况下润滑脂中的FFA的酯化转化的条形图。
图28是按照本文中公开的一些实施方案，微米-尺寸SO3H-PS-MNP的扫描电子显微镜(SEM)图像。
图29是显示按照本文中公开的一些实施方案，通过在小规模系统中和在大规模系统中使用微米-尺寸固体酸催化剂SO3H-PS-MNP，利用甲醇酯化FFA后润滑脂中的FFA含量的曲线图。
图30是显示按照本文中公开的一个实施方案，通过使用微米-尺寸固体酸催化剂SO3H-PS-MNP，相较于Amberlyst15，在利用甘油酯化FFA后润滑脂中的FFA含量的曲线图。
图31是显示按照本文中公开的一些实施方案，当将微米-尺寸固体酸催化剂SO3H-PS-MNP再循环不同循环次数时，在甲醇存在的情况下润滑脂中的FFA的酯化转化的条形图。
图32是按照本文中公开的一些实施方案的纳米-尺寸SO3H-Si-MNP的透射电子显微镜(TEM)图像。
图33显示按照本文中公开的一个实施方案，通过在时间a)0min、b)15min、c)30min和d)1小时时使用磁铁从混合物分离纳米-尺寸固体酸催化剂SO3H-Si-MNP的照片。
图34是显示按照本文中公开的一些实施方案，当将纳米-尺寸固 体酸催化剂SO3H-Si-MNP再循环不同循环次数时，在甲醇存在的情况下润滑脂中的FFA的酯化转化的条形图。
图35是显示按照本文中公开的一些实施方案，在通过一锅法反应中的酯化和转酯反应，使用完整细胞生物催化剂从隔油池油(GTO)或废弃润滑脂产生FAME中发生的化学反应的示意图。
图36是显示按照本文中公开的一些实施方案，在通过两步合成策略：1)使用完整细胞生物催化剂，利用甲醇酯化FFA；2)使用碱催化剂利用甲醇对甘油三酯进行转酯，从隔油池油(GTO)或废弃润滑脂产生FAME中发生的化学反应的示意图。
图37是按照本文中公开的一个实施方案的从土壤分离和筛选产生脂肪酶的菌株的流程的示意图。
图38是显示按照本文中公开的一些实施方案，使用6个不同的分离株，使用甲醇在催化过程中获得的FAME的产率的条形图。反应在30℃和250rpm进行72小时，利用基于GTO的2wt％的催化剂载荷和3:1的甲醇/GTO的摩尔比，以24-h的间隔以3个相等的量添加甲醇。
图39是显示按照本文中公开的一些实施方案，在使用6个分离株利用甲醇酯化GTO中的FFA(作为图38中显示的两步反应中的第一步骤)过程中获得的FFA转化的条形图。反应在30℃和250rpm进行72小时，利用基于GTO的2wt％的催化剂载荷和3:1的甲醇/GTO的摩尔比，以24-h的间隔以3个相等的量添加甲醇。
图40是显示按照本文中公开的一个实施方案，使用表达脂肪酶SML的重组大肠杆菌，利用甲醇在一锅法反应中从GTO产生FAME的时间过程的曲线图。在磁力搅拌下，利用基于GTO的5wt％的催化剂载荷和4:1的甲醇/GTO的摩尔比在30℃和500rpm下进行反应96h，以24-h的间隔以4个相等的量添加甲醇。
图41是显示按照本文中公开的一些实施方案，在使用表达脂肪酶SML的重组大肠杆菌，利用甲醇酯化GTO中的FFA(作为图40中显示的两步策略中的第一步骤)的过程中获得的FFA转化的时间过程的 曲线图。在磁力搅拌系统下，利用基于GTO的5wt％的催化剂载荷和4:1的甲醇/GTO的摩尔比在30℃和500rpm下进行反应96h，以24-h的间隔以4个相等的量添加甲醇。
图42是显示按照本文中公开的一个实施方案，使用不同量的表达脂肪酶SML的重组大肠杆菌完整细胞，利用甲醇在一锅法反应中从GTO产生FAME的时间过程的曲线图。在磁力搅拌下，利用4:1的甲醇/GTO的摩尔比在30℃和500rpm下进行反应96h，以24-h的间隔以4个相等的量添加甲醇。
图43是按照本文中公开的一个实施方案，使用表达脂肪酶CALB的重组大肠杆菌，利用甲醇从GTO产生FAME的时间过程的曲线图。利用基于GTO的4wt％的催化剂载荷和3:1的甲醇/GTO的摩尔比，在40℃和250rpm下进行反应，以12-h的间隔以4个相等的量添加甲醇。
图44是显示根据本文中公开的一些实施方案，在使用表达脂肪酶CALB的重组大肠杆菌，利用甲醇酯化GTO中的FFA(作为图36中显示的两步策略中的第一步骤)的过程中获得的FFA转化的时间过程的曲线图。利用基于GTO的4wt％的催化剂载荷和3:1的甲醇/GTO的摩尔比，在40℃和250rpm下进行反应，以12-h的间隔以3个相等的量添加甲醇。
图45是重组大肠杆菌菌株的无细胞提取物的十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)图像。M：标志物，1：利用一个质粒表达两种酶的大肠杆菌(CALB/TLL)，2：大肠杆菌(CALB)，3：大肠杆菌(TLL)，4：利用两个质粒表达两种酶的大肠杆菌(CALB-TLL)。
图46是显示按照本文中公开的一个实施方案，使用在一个质粒上表达脂肪酶CALB和TLL的重组大肠杆菌，利用甲醇从GTO产生FAME的时间过程的曲线图。利用4wt％的基于GTO的催化剂载荷和3:1的甲醇/GTO的摩尔比，在30℃和500rpm下进行反应，以6-h的间隔以3个相等的量添加甲醇。![]()
表示利用湿细胞的FAME产率，(■)表示利用干细胞的FAME产率，(▲)表示利用湿细胞的FFA含量， (●)表示利用干细胞的FFA含量。
图47是显示按照本文中公开的一些实施方案，当将在一个质粒中表达脂肪酶CALB和TLL的重组大肠杆菌再循环许多个循环时，利用甲醇从GTO产生的相对FAME产率的条形图。
图48是按照本文中公开的一个实施方案的磁性微米-或纳米-催化颗粒的示例性代表。
图49是按照本文中公开的一个实施方案的细胞催化颗粒的示例性代表。
实施例
根据下列实施例以及适用时结合附图，本公开内容的示例性实施方案将被更好地理解并且对于本领域技术人员来说是明显的。
实施例1.磁性纳米和微米生物催化剂MNA TL的制备
通过共沉淀法合成具有5-20nm的直径的油酸涂覆的超顺磁性氧化铁磁性纳米颗粒(OA-MNP)。
可如下进行共沉淀法的实例：向100mL的去离子(DI)水中添加0.01mol(2.703g)的氯化铁六水合物(FeCl3.6H2O)，在80℃于机械搅拌下添加0.005mol(0.994g)的氯化亚铁四水合物(FeCl2.4H2O)并吹氩30min。随后，将0.01mol(8.014g)的油酸钾添加进上述溶液，将混合物再连续搅拌另外30min。通过将35mL的氢氧化铵(4％溶液)快速注射入上述混合物来起始氧化铁沉淀，使反应持续另外30min。通过在20℃以16700g离心10min来收集油酸稳定化的氧化铁磁性纳米颗粒(OA-MNP)。在通过将其经历高梯度磁选机(HGMS)进一步纯化后，OA-MNP即准备好了，用于进行涂覆。
随后，在通过共沉淀法获得OA-MNP后，将9mg过硫酸铵(APS)和0.126mL甲基丙烯酸缩水甘油酯(GMA)添加至25mL浓度为0.27-1mg/mL的OA-MNP的悬浮液，使混合物反应1.5h以获得包含直径为40-300nm的聚(甲基丙烯酸缩水甘油酯)壳的GMA-MNP。随后将0.011mol(2.4mL)的4,7,10-三氧-1,13-十三烷 二胺添加至48mL的包含0.112g的GMA-MNP的含水悬浮液，将混合物在80℃搅拌24h。通过以12000-21000g离心10-30min收集在表面上包含氨基的所得到的Trioxa-MNP，利用去离子水洗涤数次。将0.05-0.2g Trioxa-MNP在室温于135mL戊二醛(10％的溶液)中搅拌18h。在去离子(DI)水洗涤产生的含醛纳米颗粒(CHO-MNP)数次以产生65nm的平均直径(图4)。
为了进行酶的固定，将35mL的磷酸盐缓冲液(7mM,pH5-8)中的3.5-21mg疏绵状嗜热丝孢菌脂肪酶(TLL或TL)和0.07gCHO-MNP在4℃(或室温)摇动0.5-12h。获得的生物催化剂MNATL(固定有疏绵状嗜热丝孢菌脂肪酶的磁性纳米生物催化剂聚集体)包含成簇的在单个MNP表面上含有酶的磁性纳米颗粒(MNP)。通过施加磁场收集微米-生物催化剂，随后洗涤和冷冻干燥。获得的MNA TL显示具有60nm-100μm的尺寸的规则形状(图5b)，并且具有20-100mg TL/克颗粒的单位载荷。
实施例2.磁性纳米-和微米-生物催化剂MNA CA的制备
35mL磷酸盐缓冲液(7mM,pH5-8)中的5.85-35.1mg的CALB和0.117g的CHO-MNP(基于实施例1中描述的步骤制备的)在4℃(或室温)摇动0.5-12h以产生具有60nm至100μm的直径和10-100mg/g颗粒的酶载荷的非交联簇的形式的MNA CA(固定有CALB的磁性纳米生物催化剂聚集体)。
实施例3.磁性纳米-生物催化剂PMMAP CA的制备
将0.025g过硫酸铵和0.316mL甲基丙烯酸甲酯单体添加至30mL含有OA-MNP(0.4-0.8mg/mL)的DI水，在80℃搅拌混合物1h。在以16700g离心10min和利用DI水洗涤数次后，获得具有50-500nm的直径的PMMA-MNP(聚(甲基丙烯酸甲酯)磁性纳米颗粒)(图8a)。为了固定南极假丝酵母脂肪酶B(CALB)，将1-20mL具有浓度为0.75-1mg/mL的酶的磷酸盐缓冲液和MMA-MNP(其以400mg CALB/克颗粒的比率存在)在不同pH(pH从5至8)于4-30℃、30rpm温育12小时。在以5000rpm离心5min后在磁场 下收集所得到的纳米生物催化剂颗粒。将45-147mg酶固定在1克PMMA-MNP上，从而产生PMMAP CA(固定有CALB的聚(甲基丙烯酸甲酯颗粒))。
实施例4.磁性纳米-生物催化剂PSP CA的制备
将0.025g过硫酸铵和0.316mL苯乙烯添加至30mL含有OA-MNP(0.4-0.8mg/mL)的DI水，将混合物在80℃搅拌1h。在以16700g离心10min和用DI水洗涤数次后，获得具有80-800nm的直径的PS-MNP(图8b)。为了固定CALB，将1-20mL具有浓度为0.75-1mg/mL的酶的磷酸盐缓冲液和PS-MNP(其以400mgCALB/克颗粒的比率存在)在不同的pH(pH从5至8)于30℃,30rpm温育12h。在以5000rpm离心5min后在磁场下收集所得到的纳米生物催化剂颗粒。将100-300mg酶固定在1克PS-MNP上。
实施例5.磁性纳米-生物催化剂EDAP CA的制备
将0.025g过硫酸铵和0.316mL甲基丙烯酸缩水甘油酯(GMA)添加至30mL含有OA-MNP(0.4-0.8mg/mL)的DI水，将混合物在80℃搅拌1h。在以16700g离心10min并用DI水洗涤数次后，将产生的GMA-MNP重悬浮于30mL DI水中。添加3mL乙二胺(EDA)，将混合物在80℃搅拌12小时。在以16700g离心10min并用DI水洗涤数次后，获得具有50-500nm的尺寸的EDA-MNP(乙二胺磁性纳米颗粒)(图8c)。为了固定CALB，将1-20mL具有浓度为0.75-1mg/mL的酶的磷酸盐缓冲液、戊二醛和EDA-MNP(其以400mg CALB/克颗粒的比率存在)在不同的pH于30℃,30rpm温育12h。在以5000rpm离心5min后在磁场下收集所得到的纳米生物催化剂颗粒。将10-30mg酶固定在1克EDA-MNP上。
实施例6.磁性纳米-生物催化剂GAP CA的制备
将30mL的EDA-MNP溶液(于实施例5中制备的)缓慢添加入30mL戊二醛(GA)溶液中以避免任何不想要的聚集。将混合物在 80℃搅拌3小时，随后以12000g离心10min，用DI水洗涤数次。将收集的GA-MNP(戊二醛磁性纳米颗粒)用于CALB的固定。将1-20mL具有浓度为0.75-1mg/mL的酶的磷酸盐缓冲液和GA-MNP(其以400mg CALB/克颗粒的比率存在)在不同的pH于30℃,30rpm温育12h。在以5000rpm离心5min后在磁场下收集所得到的纳米生物催化剂颗粒。将10-30mg酶固定在1克GA-MNP上。
实施例7.利用纳米-和微米-生物催化剂MNA TL通过一锅法反应从GTO和甲醇制备FAME
将含有0.1-300mg的TLL的MNA TL、1-30g的GTO(17wt％的FFA)、MeOH(7.6mol的MeOH:1mol的FFA)和0.1-9g的硅胶微珠的冷冻干燥的混合物在30℃和30rpm摇动8-12h。在反应后，通过施加外部磁场分离MNA TL。随后通过以21500g离心10min从生物柴油除去硅胶微珠和甘油。通过使用具有INNOWAX柱的Agilent气相色谱(GC)在220℃的入口温度和275℃的FID温度分析FAME的浓度。将5μL的样品溶解在995μL的含有2mmol/L正-十六烷的正己烷(作为内部标准)中。如下设置温度程序：以15℃/min的速度从150升高至225℃，以5℃/min的速度从225℃升高至260℃，在260℃保持3min。GC色谱图示于图9b中。基于利用FAME标准的校准曲线计算FAME浓度(图9a)。在两步法中从润滑脂制备生物柴油(FAME)标准。首先，将0.75g![]()
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与2.08g MeOH(3.5:1mol的MeOH:FFA)一起用于酯化30g废弃润滑脂，将其在30℃和500rpm搅拌以酯化FFA。2h后，通过离心分离![]()
通过滴定测定润滑脂的FFA含量。仅0.5wt％FFA留在预处理的润滑脂中。在第二步骤中，将0.17gKOH与2.22g MeOH(6:1mol的MeOH:润滑脂)一起用于10g预处理的润滑脂的转酯，将其在65℃和500rpm搅拌18h。在利用GC分析之前，纯化产生的生物柴油。首先将样品以13,500rpm在25℃离心5min，随后将底层弃去以除去副产品甘油。随后，通过 旋转蒸发器除去顶层中过量的MeOH。随后，利用HCl溶液(0.2％)、随后利用DI水洗涤生物柴油直至洗涤液的pH为中性。通过添加硫酸镁干燥生物柴油过夜，过滤后获得终产物。
在本实施例中，纳米-和微米-生物催化剂MNA TL的总FAME产率达到90-99％(图10)。为了比较，将游离酶TLL和商购可得固定化酶(Lipozyme TLL IM)用于进行相同实验，但相较于上述MNA TL实现的转化非常低(图11)。
实施例8.MNA TL在通过一锅法反应从GTO产生FAME中的再循环
使用针对实施例7描述的方法，利用MNA TL作为催化剂进行利用甲醇对隔油池油(具有17wt％的FFA的GTO)的转化。反应后，在外部磁场下分离催化剂，用叔-丁醇(或正己烷)洗涤，冷冻干燥，随后添加至含有GTO(17wt％的FFA)、MeOH和硅胶微珠的新反应介质。在与第一批次相同的条件下进行新的批次的反应。再次回收生物催化剂并再使用。总共进行10次再循环，在每一个反应循环中获得了高FAME产率(85-96％)(图12)。
实施例9.使用纳米-和微米-生物催化剂MNA CA通过利用甲醇酯化来将GTO中的FFA转化为FAME
将含有0.1-1mg的CALB的MNA CA、1g的GTO(17％wtFFA)、MeOH(3.8mol的MeOH:1mol的FFA)的混合物在30℃和30rpm摇动4或8h。在于外部磁场下分离MNA CA后，通过滴定测定剩余GTO中的FFA的量。GTO中的酸值降至<0.5％(图13和图14)。
实施例10.MNA CA在利用甲醇酯化GTO中的FFA以制备FAME中的再循环
使用实施例9中描述的相似方法，利用MNA CA作为催化剂，使用甲醇酯化GTO(17％wt的FFA)。反应后，在外部磁场下分离催化剂，用叔-丁醇(或正己烷)洗涤，冷冻干燥，随后将其添加至含有GTO(17wt％的FFA)和MeOH的新的反应介质。在与第一批次 相同的条件下进行新的批次的反应。再次回收生物催化剂并再使用。总共进行11次再循环，在每一个反应循环中酸值下降至<2％(图15)。
实施例11.通过利用甲醇进行酯化来将GTO中的FFA转化为FAME
纳米-生物催化剂(PMMAP CA、PSP CA、EDAP CA或GAPCA)进行的GTO的酯化：将1g GTO(14wt％FFA)、甲醇(6mol的MeOH:1mol的FFA)和磁性纳米生物催化剂(以1wt％的颗粒的PMMAP CA、PSP CA、EDAP CA或GAP CA对GTO)的混合物在30℃和30rpm下摇动。脂肪酸值在0.5-1h内下降至<2％(图16-18)。为了进行比较，将商购可得的固定化酶Novozym435用于在相同条件下进行酯化反应。磁性纳米生物催化剂的比活性约为Novozym435的2倍。
实施例12.纳米-生物催化剂PMMAP CA在利用甲醇酯化GTO中的FFA以制备FAME中的再循环
使用实施例11中描述的相似方法，利用PMMAP CA作为催化剂(1wt％的载荷)，使用甲醇酯化GTO(15wt％FFA)。反应后，在外部磁场下分离催化剂，用正己烷洗涤，冷冻干燥，随后将其添加至含有GTO(15wt％的FFA)和MeOH的新的反应介质。在与第一批次相同的条件下进行新的批次的反应。再次回收生物催化剂并再使用。总共进行5次再循环，在每一个循环中脂肪酸值下降至<2％(图19)，从而显示FFA转化的效率即使在数轮再循环后仍然维持在高水平。
实施例1-12的概述
下面提供根据本文中公开的一些实施方案的概述和/或其它信息，所述概述或信息可更好地帮助理解上述实施例1-12。
用于制备纳米-和微米-生物催化剂的一个示例性途径示于图3中。首先通过共沉淀法合成具有5-20nm的直径的油酸涂覆的氧化铁磁性纳米颗粒，随后将其与聚(甲基丙烯酸缩水甘油酯)反应以产 生具有40-200nm的直径的包含环氧表面官能(GMA-MNP)的具有磁性核心-壳结构的纳米颗粒。
GMA-MNP与4,7,10-三氧-1,13-十三烷二胺的反应提供了包含氨基表面基团的Trioxa-MNP。利用戊二醛对这些颗粒的进一步处理产生了在颗粒表面上具有醛基的CHO-MNP。TEM测量显示GMA-MNP具有大体上相同的形状和尺寸(图4)。
通过温和地摇动磷酸盐缓冲液中的酶和CHO-MNP将水解酶例如CALB和TLL分别固定在CHO-MNP上，以分别形成MNACA和MNA TL。
在洗涤和冷冻干燥后，获得具有60nm-100μm的尺寸的纳米-和微米-生物催化剂MNA CA(图5a)和MNA TL(图5b)。微米-生物催化剂通过单个纳米-生物催化剂经由颗粒上酶间的物理相互作用非交联成簇来形成。两种生物催化剂的总体合成是简单的且可高度重现的，具有70-90％的产率。
分别获得每克颗粒10-100mg CALB的单位酶载荷(对于MNACA)和每克颗粒20-100mg TL的单位酶载荷(对于MNA TL)。在洗涤过程中不存在酶的浸出，这确认了通过共价键合的稳定固定。
图6显示在外部磁场下GTO与FAME的混合物中的生物催化剂在1分钟内的分离。分离是快速且完全的。
制备纳米-生物催化剂的其它可能途径概述于图7中。具有氧化铁核心和聚合物壳例如聚苯乙烯(PS)和聚(甲基丙烯酸甲酯)(PMMA)的MNP通过用对应的单体例如甲基丙烯酸甲酯或苯乙烯分别处理OA MNP来合成。所得的PS-MNP(图8b)或PMMA-MNP(图8a)显示50-800nm的直径。
通过将酶与颗粒在磷酸盐缓冲液中混合来分别进行CALB在PMMA-MNP和PS-MNP上的物理吸附。这分别导致产生包含45-147mg酶/g颗粒的纳米-生物催化剂PMMAP CA和包含100-300mg酶/g颗粒的PSP CA。
在另一个方面，GMA-NMP与乙二胺的反应产生在表面上具 有胺基的EDA-MNP，利用戊二醛对EDA-NMP的进一步处理产生包含表面醛基官能团的GA-MNP。CALB在GA-MNP上的共价结合产生纳米-生物催化剂GAP CA。或者，CALB与戊二醛和EDA-NMP的反应产生EDAP CA。在两种情况下，酶载荷为10-30mg/g颗粒。
GTO通过一锅法酯化和利用甲醇的转酯至FAME的高效转化通过使用纳米-和微米-生物催化剂颗粒来实现。
作为说明性实例，将冻干的MNA TL用于在催化剂载荷为0.2wt％的TLL对GTO的硅胶微珠存在的情况下催化利用MeOH(7.6mol的MeOH:1mol的FFA)进行的包含17％的FFA的GTO的生物转化。在30℃进行反应12h，生物柴油形成后进行GC分析(图9b)。通过使用0.1-0.5wt％的酶载荷(基于TLL)，FAME产率达到90-99％(图10)。硅胶的添加帮助除去存在的水，从而将酯化反应驱向生物柴油的形成。利用纳米-和微米-生物催化剂实现的高产率比利用游离酶TLL和大固体载体上的固定化TLL例如商购可得的TLL IM实现的产率好得多，如图11中显示的。
MNA TL的再循环能力示于图12中。在每一轮生物转化后，在外部磁场下快速分离MNA TL，将其洗涤，冷冻干燥，随后添加至新的一批包含GTO、MeOH和二氧化硅的反应培养基以进行下一轮生物转化。催化剂可被再循环10次，甚至在第11轮时FAME的产率>85％。很明显，在该情况下，生物催化剂的高效再循环可有效地降低催化剂的成本，从而降低生物柴油的生产成本。
开发的纳米-和微米-生物催化剂还用于通过利用甲醇的酯化将GTO中的FFA高产率地转化为FAME。这是图2中显示的从润滑脂两步制备生物柴油中的第一步。在代表性实例中，MNA CA用于利用MeOH进行的包含16％FFA的GTO中的FFA的酯化。以0.01-0.1wt％的CA对GTO，3.8:1(mol:mol)的MeOH对FFA在30℃检查反应。通过滴定测定GTO中FFA的减少的量。如图13中所示，当使用0.03-0.1wt％(基于CALB)的催化剂载荷时，在4h 内实现酯化反应的高转化(对应于<0.5％的FFA浓度)。对于甚至仅0.01wt％的CALB，在8h的反应后，GTO的酸值也下降至<0.5％(图14)。经显示MNA CA被再循环11次(图15)。即使在第12轮，GTO中的FFA亦下降至低于2％，一个可利用用于生物柴油生产的转化方法，使用碱催化剂来容易地处理的酸浓度。
纳米-生物催化剂PMMA CA、PSP CA、EDAP CA和GAP CA的其它类型也经证明对于利用甲醇将GTO中的FFA酯化成FAME是高效的。在低催化剂载荷(1-2wt％；基于纳米-催化剂)下在0.5-1h的反应内酸值从15％下降至<2％(图16-18)。这些纳米生物催化剂的比活性为利用商业固定化脂肪酶Novozym435进行相同转化达到的比活性的2倍。
如图19中所示，也将生物催化剂再循环和再使用6次，在每一轮反应中将酸降至<2％。
可将微米-或纳米-生物催化剂在一锅法反应中用于游离脂肪酸至FAME的酯化，如图1中显示的甘油三酯至FAME的转酯或在图12中显示的两步反应中用作游离脂肪酸至FAME的预处理步骤酯化。
作为另外的举例说明性实例，图48提供了可被实施例1-12中描述的一些颗粒采用的磁性微米-或纳米-催化颗粒的示例性图示。参照图48，颗粒420包含具有被外壳424封装的磁性核心422的外壳424。通过接头428将催化实体426固定在外壳424上。
实施例13.纳米-尺寸的顺磁性固体酸催化剂SO3H-PGMA-MNP的合成
通过共沉淀法合成油酸稳定的超顺磁性氧化铁磁性纳米颗粒(OA-MNP)，产生具有5-20nm的直径的颗粒。将25mg过硫酸铵和0.316mL甲基丙烯酸缩水甘油酯添加至30mL含有6.75mg OA-MNP的去离子(DI)水，将混合物于80℃搅拌1h。所得的聚(甲基丙烯酸缩水甘油酯)-涂覆的磁性纳米颗粒(PGMA-MNP)具有直径90nm的核心-壳结构。以16700g将PGMA-MNP离心10min，用DI水洗涤数次， 将其重悬浮于DI水中。随后将7.28g Na2SO3添加至PGMA-MNP溶液中，通过添加DI水将体积调整至72mL。将混合物在80℃搅拌24h。所得的磺化颗粒用DI水重复洗涤。随后用48mL HCl溶液(4％)质子化颗粒。在利用DI水重复洗涤和冷冻干燥后，获得具有90nm的直径的纳米-尺寸固体酸催化剂SO3H-PGMA-MNP(图22)。通过针对0.02M KOH溶液的滴定，催化剂经测试具有2.3mmol H+/g的酸载荷。
实施例14.通过使用纳米-尺寸顺磁性固体酸催化剂SO3H-PGMA-MNP利用甲醇酯化润滑脂中的FFA
将8mg催化剂、0.195g润滑脂和0.18mL甲醇的混合物在70℃和1000rpm下摇动。2h后，将催化剂和过量甲醇与预处理的润滑脂分离。通过针对0.02M KOH溶液滴定，测试预处理的润滑脂中的FFA含量，结果显示FFA从16wt.％降至0.63wt.％(对应于96％的转化)，如图23中显示的。
实施例15.纳米-尺寸固体酸催化剂SO3H-PGMA-MNP用于利用甲醇酯化润滑脂中的FFA的再循环
在如实施例14中所述酯化后，将催化剂与产物混合物分离，利用正己烷洗涤，冷冻干燥。随后，将催化剂用于以与第一批次相似的条件进行的新一轮反应。SO3H-PGMA-MNP的磁性性质允许在5s内将催化剂与产物混合物分离(图24)。纳米-尺寸SO3H-PGMA-MNP可再使用至少10个循环而无需任何再生，其中在每一轮反应中获得96％的转化(图25)。
实施例16.纳米-尺寸顺磁性固体酸催化剂SO3H-PS-MNP的合成
将25mg过硫酸铵和0.316mL苯乙烯添加至40mL含有16mgOA-MNP DI中，将混合物在80℃搅拌2.5h。所得的聚苯乙烯-涂覆的磁性纳米颗粒(PS-MNP)具有直径80nm的核心-壳结构。通过使用高梯度磁性分离器(HGMS)来纯化PS-MNP，随后将其冷冻干燥。最后，将150mg PS-MNP粉剂添加至7.5mL的硫酸中，将混合物在25℃搅拌15min。在利用DI水重复洗涤和冷冻干燥后，获得具有80nm 的直径的纳米-尺寸固体酸催化剂SO3H-PS-MNP(图26)。通过针对0.02M KOH溶液滴定，催化剂经测试具有1.11mmol H+/g的酸载荷。
实施例17.通过纳米-尺寸顺磁性固体酸催化剂SO3H-PS-MNP利用甲醇酯化润滑脂中的FFA
将8mg催化剂、0.195g润滑脂和0.18mL甲醇的混合物在70℃和1000rpm摇动。30min后，将催化剂和过量甲醇与预处理的润滑脂分离。通过针对0.02M KOH溶液滴定，测试预处理的润滑脂中的FFA含量，结果显示FFA从16wt.％降至0.32wt.％(对应于98％的转化)，如图23中显示的。
实施例18.纳米-尺寸顺磁性固体酸催化剂SO3H-PS-MNP用于利用甲醇酯化润滑脂中的FFA的再循环
在如实施例17中所述酯化后，将催化剂与产物混合物分离，利用正己烷洗涤，干燥。随后，将催化剂用于以与第一批次相似的条件进行的新一轮反应。纳米-尺寸SO3H-PS-MNP可再使用至少8个循环而无需任何再生，其中在每一轮反应中获得高至72-95％的转化(图27)。
实施例19.微米-尺寸固体酸催化剂SO3H-PS-MNP的合成
使用实施例16中的方法制备PS-MNP，通过使用HGMS将其纯化，随后真空干燥以获得微米-尺寸PS-MNP颗粒。随后，将150mg的颗粒添加至7.5mL硫酸，将混合物在39℃搅拌1.5小时。在利用DI水重复洗涤和真空干燥后，获得具有尺寸60-500μm的微米-尺寸固体酸催化剂SO3H-PS-MNP(图28)。通过针对0.02M KOH溶液滴定，催化剂经测试具有2.25mmol H+/g的酸载荷。
实施例20.通过使用微米-尺寸固体酸催化剂SO3H-PS-MNP利用甲醇酯化润滑脂中的FFA
将16mg催化剂、0.39g润滑脂和0.35mL甲醇的混合物在70℃和1000rpm下摇动。2小时后，将催化剂和过量甲醇与预处理的润滑脂分离。通过针对0.02M KOH溶液滴定，测试预处理的润滑脂中的FFA含量，结果显示FFA从16wt.％降至0.4wt.％(对应于97％的转化)。为了比较，将毫米-尺寸离子交换树脂Amberlyst15用作用于润 滑脂的预处理的固体酸催化剂。在相同反应条件下和利用相同量的催化剂，在2小时的反应后，Amberlyst15仅能够使FFA含量降至5.3wt％(对应于67％的转化)(图23)。
实施例21.通过使用微米-尺寸固体酸催化剂SO3H-PS-MNP利用甲醇对润滑脂中的FFA进行按比例放大酯化
将310mg催化剂、7.6g润滑脂和6.8mL甲醇的混合物在70℃和1000rpm摇动。2小时后，将催化剂和过量甲醇与预处理的润滑脂分离。通过针对0.02M KOH溶液滴定，测试预处理的润滑脂中的FFA含量，结果显示FFA从16wt.％降至0.4wt.％(对应于97％的转化)，如图29中显示的。
实施例22.通过使用微米-尺寸固体酸催化剂SO3H-PS-MNP利用甘油酯化润滑脂中的FFA
将260mg催化剂、2.6g润滑脂和0.53g甘油的混合物在100℃和1000rpm摇动。26小时后，将催化剂和过量甘油与预处理的润滑脂分离。通过针对0.02M KOH溶液滴定，测试预处理的润滑脂中的FFA含量，结果显示FFA从16wt.％降至1wt.％(对应于93％的转化)，如图30中显示的。
实施例23.微米-尺寸固体酸催化剂SO3H-PS-MNP用于利用甲醇酯化润滑脂中的FFA的再循环
在如实施例20中所述酯化后，将催化剂与产物混合物分离，利用正己烷洗涤，干燥。随后，将催化剂用于以与第一批次相似的条件进行的新一轮反应。微米-尺寸SO3H-PS-MNP可再使用至少6个循环而无需任何再生，其中在每一轮反应中获得高至74-97％的转化(图31)。
实施例24.纳米-尺寸顺磁性固体酸催化剂SO3H-Si-MNP的合成
使用实施例13中描述的相似方案合成OA-MNP。随后，将2mLOA-MNP、5mL氨水、160mL乙醇和1mL TEOS(四乙基正硅酸酯)添加至40mL DI水，将混合物在室温和400rpm搅拌24小时。将所得的二氧化硅涂覆的磁性纳米颗粒(Si-MNP)具有平均直径200nm的的多核心-壳结构。利用DI水重复洗涤Si-MNP，并冷冻干燥。将60mg Si-MNP、10mL乙醇和1mL3-巯基丙基三甲基硅烷(MPTMS)添加至10mL的DI水中，将混合物在室温和400rpm搅拌24小时。利用DI水重复洗涤所得的巯基官能化的二氧化硅涂覆的磁性纳米颗粒(SH-Si-MNP)。随后，将SH-Si-MNP、10mL甲醇和10mL过氧化氢添加至10mL DI水中，在室温和400rpm下搅拌混合物24小时。最后，将从先前步骤回收的颗粒添加至10mL的1M H2SO4中，在室温和400rpm下搅拌混合物6小时。在利用DI水重复洗涤和冷冻干燥后，获得具有200nm的平均直径的纳米-尺寸固体酸催化剂SO3H-Si-MNP(图32)。通过针对0.02M KOH溶液滴定，催化剂经测试具有0.54mmol H+/g的酸载荷。
实施例25.通过使用纳米-尺寸顺磁性固体酸催化剂SO3H-Si-MNP利用甲醇酯化润滑脂中的FFA
将8mg催化剂、0.195g润滑脂和0.18mL甲醇的混合物在70℃和1000rpm摇动。5小时后，将催化剂和过量甲醇与预处理的润滑脂分离。通过针对0.02M KOH溶液滴定，测试预处理的润滑脂中的FFA含量，结果显示FFA从16wt.％降至1wt.％(对应于94％的转化)，如图23中显示的。
实施例26.纳米-尺寸固体酸催化剂SO3H-Si-MNP用于利用甲醇酯化润滑脂中的FFA的再循环
在如实施例25中所述酯化后，将催化剂与产物混合物分离，利用正己烷和甲醇洗涤，冷冻干燥。随后，将催化剂用于以与第一批次相似的条件进行的新一轮反应。SO3H-Si-MNP的磁性性质允许催化剂在30min内与水分离(图33)。纳米-尺寸SO3H-Si-MNP可再使用至少3个循环而无需任何再生(图34)。
实施例13至26的概述
下面提供根据本文中公开的一些实施方案的概述和/或其它信息，所述概述或信息可更好地帮助理解上述实施例13-26。
在这些实施例中，纳米-尺寸固体酸催化剂是由磁性氧化铁(Fe3O4)核心、保护Fe3O4核心的外部包衣壳以及移植至包衣壳的表 面上的酸官能团组成的顺磁性核心-壳纳米颗粒(图21)。
磁性核心通过共沉淀法合成，从而产生具有5-20nm的直径的尺寸的Fe3O4纳米颗粒，所述尺寸在颗粒显示超顺磁性性质所需的尺寸的范围内。
通过利用自由基聚合法或![]()
法，将3种类型的涂层成功地用于Fe3O4核心，即聚(甲基丙烯酸缩水甘油酯)(PGMA)、聚苯乙烯(PS)和二氧化硅(Si)。在具体实施方案中，通过将总共30-40mL的混合物体积中的约6.75-16mg的OA-MNP添加至25mg过硫酸铵(APS)引发剂和0.316mL单体来进行聚合反应。将混合物在80℃搅拌1-2.5h以获得聚合物涂覆的-MNP。在具体的实施方案中，通过将2mL OA-MNP、5mL氨水、160mL乙醇和1mL TEOS(四乙基正硅酸酯)与40mL DI水混合来进行![]()
法，将混合物在室温和400rpm搅拌24小时以提供二氧化硅涂覆的MNP。
使用的涂覆法有利于完美核心-壳结构的合成，这对于防止Fe3O4的沥滤和增强纳米-载体的稳定性是有利的。PGMA链包含环氧化物基团，所述基团在具有化学活性，从而允许通过磺化反应来容易地连接磺酸，从而产生在表面上具有酸功能的纳米颗粒。PS链包含可利用磺酸部分移植的反应性苯环。Si以硅烷醇官能团终结，所述官能团可被修饰成硫醇，随后被氧化成磺酸。
随后，将磺酸官能团移植至每一个Fe3O4-涂覆的纳米颗粒的表面上。磺酸因其低廉的成本和高催化活性而被选择作为酸官能团。磺酸基团被共价地连接在纳米-载体上，从而产生可被再循环和再使用而无需任何再生步骤的稳定的纳米-尺寸固体酸催化剂。获得的微米-尺寸固体酸催化剂是在真空下干燥获得的聚集的纳米-尺寸固体酸催化剂。制造的催化剂，即纳米-尺寸磺化聚(甲基丙烯酸缩水甘油酯)-涂覆的磁性纳米颗粒(纳米-尺寸SO3H-PGMA-MNP)、纳米-尺寸磺化聚苯乙烯涂覆的磁性纳米颗粒(纳米-尺寸SO3H-PS-MNP)、微米-尺寸磺化聚苯乙烯涂覆的磁性纳米颗粒(微米-尺寸SO3H-PS-MNP)和纳米-尺寸磺化二氧化硅涂覆 的磁性纳米颗粒(SO3H-Si-MNP)分别具有90nm、80nm、60-500μm和200nm的直径(分别地图22、26、28和32)。
4种类型的催化剂已被成功地用于从润滑脂产生生物柴油的预处理步骤，以降低高FFA含量。甲醇因其低成本而被用于酯化。或者，甘油，碱催化的转酯过程的一种副产品，也用于预处理步骤以减少润滑脂中的FFA。廉价甘油的使用可进一步降低生物柴油的生产成本。
通过使用4wt％(基于润滑脂重量)的纳米-尺寸SO3H-PGMA-MNP固体酸催化剂，以40:1的甲醇:FFA摩尔比，在70℃利用甲醇酯化润滑脂2h将润滑脂的FFA含量从16wt.％降至0.63wt.％(对应于96％的转化)，如图23中显示的。
SO3H-PGMA-MNP的顺磁性性质允许催化剂在5s内被分离(图24)。容易分离的催化剂可被再使用至少10个循环而无需任何再生，从而潜在地能够降低生物柴油的生产成本(图25)。在每一个循环中，酸浓度对于下一步生物柴油合成是足够低的。
通过使用4wt％(基于润滑脂重量)的纳米-尺寸SO3H-PS-MNP固体酸催化剂，以40:1的甲醇:FFA摩尔比，在70°C利用甲醇酯化润滑脂30min将润滑脂的FFA含量从16wt.％降至0.32wt.％(对应于98％的转化)，如图23中显示的。
对于利用微米-尺寸SO3H-PS-MNP固体酸催化剂进行的相同反应，润滑脂的FFA含量在2小时内从16wt.％降至0.4wt.％(对应于97％的转化)，如图23中显示的。
为了比较，将毫米-尺寸离子交换树脂Amberlyst15用作用于在相同反应条件下预处理润滑脂的固体酸催化剂，在2小时反应后FFA含量仅降至5.3wt％(对应于67％的转化)。因此，此处开发的纳米-尺寸和微米-尺寸SO3H-PS-MNP固体酸催化剂就酯化反应而言比Amberlyst15好得多(图23)。
在利用微米-尺寸固体酸催化剂SO3H-PS-MNP进行的大规模实验中，其中反应物的量增加至19.5倍，催化剂活性与小规模实 验中的活性相似。在2小时反应后，润滑脂中的FFA含量从16wt.％降至0.4wt.％(对应于97％的转化)(图29)。该结果显示了利用催化剂进行按比例放大的可行性。
纳米-和微米-尺寸固体酸催化剂SO3H-PS-MNP可被简单地分离并且再使用至少8和6个循环，而无需任何再生，从而使其适用于降低生物柴油的生产成本(分别地，图27和31)。在每一个循环中，酸浓度对于下一步生物柴油合成是足够低的。
在通过使用10wt％(基于润滑脂重量)的微米-尺寸SO3H-PS-MNP固体酸催化剂，以4:1的甘油对:FFA的摩尔比，在100℃利用甘油酯化润滑脂中，FFA含量可在26小时内从16wt.％降至1wt.％(对应于93％的转化)。然而通过在相同反应条件下使用Amberlyst15，5.3wt％FFA仍然留在润滑脂(对应于67％的转化)中。因此，微米-尺寸SO3H-PS-MNP固体酸催化剂就利用甘油的酯化而言相较于Amberlyst15具有更高的活性(图30)。
通过使用4wt％(基于润滑脂重量)的纳米-尺寸SO3H-Si-MNP固体酸催化剂，以40:1的甲醇:FFA的摩尔比，在70℃利用甲醇酯化润滑脂使润滑脂的FFA含量在5小时内从16wt.％降至1wt.％(对应于94％的转化)(图23)。为了比较，将毫米-尺寸离子交换树脂Purolite CT-275用作用于在甚至更严苛的条件(75℃，40:1的甲醇:FFA的摩尔比和10wt.％催化剂载荷(基于润滑脂重量))下预处理润滑脂的固体酸催化剂，其仅能够在4小时内将FFA含量从18wt.％降至7.6wt.％(对应于58％的转化)。因此，SO3H-Si-MNP固体酸催化剂就酯化反应而相较于Purolite CT-275具有更高的活性。
SO3H-Si-MNP的顺磁性性质允许催化剂在30min内被分离(图33)。容易分离的催化剂可被再使用至少3循环而无需任何再生，从而潜在地能够降低生物柴油的生产成本(图34)。
作为另外的举例说明性实例，图48提供了可被实施例13-26中描述的一些颗粒采用的磁性微米-或纳米-催化颗粒的示例性代表。 参照图48，颗粒400包含具有被外壳424封装的磁性核心422的外壳424。通过接头428将催化实体426固定在外壳424上。
实施例27.从土壤筛选产生脂肪酶的菌株
将2g的土壤样品悬浮于10mL的M9培养基中，该培养基为每升自来水含有8.5g Na2HPO4.2H2O、3.0g KH2PO4、0.5g NaCl、1.0gNH4Cl、2mL MgSO4(1M)和1mL Tris-甲基(MT)溶液。用0.1g的橄榄油作为唯一碳源补充悬浮液。在30℃和300rpm进行2-3天富集培养。在富集培养后，取出100μL的混合物的样品，稀释106倍，随后将100μL稀释溶液涂板在罗丹明B选择琼脂培养基上，所述培养基由每升自来水1g(NH4)2SO4、1g K2HPO4、5g KCl、0.5g MgSO4.7H2O、0.1g FeSO4.7H2O、5g酵母提取物、5g蛋白胨、120mL橄榄油乳剂(橄榄油:聚乙烯醇＝1:3，v/v)、0.01g罗丹明B和2g琼脂组成。将在UV照射下具有清晰的荧光区域的琼脂上产生的集落选择用于最后的筛选。将通过初步筛选分离的具有明显脂肪酶的菌株单个地接种入3mL的溶原性肉汤(Lysogeny Broth)(LB)培养基，培养12h，将2.5mL的预培养物接种至50mL的发酵培养基(葡萄糖8.0g/L、酵母提取物5.0g/L、蛋白胨5.0g/L、K2HPO40.5g/L、KH2PO40.5g/L、NaCl1.0g/L、MgSO4.7H2O0.4g/L、橄榄油5g/L，pH7.0)。随后将培养物在30℃和250rpm培养另外12h。应当理解，在其它实例中，可以在约20℃至约40℃和在约150至约400rpm培养约6至18小时。还应理解，在其它实例中，可在约15℃至约30℃和约150至约400rpm进行酶表达约6至18小时。培养后，通过以8000rpm离心5min来收集细胞，用去离子水洗涤2次，随后将湿细胞于-80℃贮存6h，随后使用真空冷冻干燥器将其经历冷冻干燥，进行1天，以获得冻干的细胞。将冻干的细胞用作用于从GTO生产生物柴油或酯化GTO中的FFA的催化剂。
实施例28.使用从土壤分离的菌株从GTO生产FAME
将2.0g GTO和0.04g冻干的细胞(2wt％的催化剂载荷)一起添加以形成混合物。以24h的间隔以相等的量添加甲醇(甲醇:GTO的摩尔 比，3:1)。在30℃和300rpm进行反应72h。反应后，取出50μL反应混合物，用50μL去离子水洗涤，随后以15,000rpm离心10min。将5μL的上层与995μL含有2mM正-十六烷的正己烷(作为内部对照)混合。使用具有INNOWAX柱的Agilent GC以及220℃的入口温度、275℃的火焰电离检测器(FID)温度，将混合物经历GC分析以定量FAME。温度程序如下：将温度以15℃/min的速率从150℃升高至225℃，以5℃/min的速率从225℃升高至260℃，并于260℃保持3min。基于从上述反应产生的FAME和从利用Novozyme435和KOH催化的两步反应(如上文实施例7中描述的)产生的FAME标准计算FAME转化。在所有从土壤分离的菌株中，菌株P1-28显示最高FAME产率，并且从GTO的FAME产率达到32％(图38)。
实施例29.使用来自土壤的分离菌株酯化GTO中的FFA
将2.0g GTO和0.04g冻干细胞(2wt％的催化剂载荷)一起添加以形成混合物。以24h的间隔以相等的量添加甲醇(甲醇:FFA的摩尔比，3:1)。在30℃和300rpm进行反应72h。反应后，取出150μL反应混合物，以1,000rpm离心10min，将上清液与异丙醇(5mL)混合，随后使用KOH溶液(20mM)滴定以测定GTO中剩余的酸含量。在所有从土壤分离的菌株中，菌株P1-28显示最高的酯化活性，并且FFA转化达到55％(图39)。
实施例30.表达脂肪酶SML的大肠杆菌完整细胞生物催化剂的制备
在于37℃和250rpm培养12h后，将表达脂肪酶SML(粘质沙雷氏菌脂肪酶)的重组大肠杆菌T7接种至5mL溶源性肉汤(LB)培养基，将1％(v/v)的预培养物转移至250mL的装有50mL的Terrific肉汤(TB)培养基的Erlenmeyer瓶，所述培养基为每升自来水包含12g蛋白胨、24g酵母提取物、4mL甘油、2.3g KH2PO4、16.37gK2HPO4.3H2O、50mg卡那霉素。将培养物在37℃和250rpm温育达到0.6-0.8的OD(光密度)600nm。随后，通过添加异丙硫半乳糖苷(IPTG,终浓度0.1mM)诱导脂肪酶表达。应理解，在其它实例中，使用的IPTG 浓度可从约0.05变化至5mM。将培养物在20℃和250rpm生长另外12h，随后通过以6000rpm离心5min收集细胞。在利用去离子水洗涤2次后，将收集的细胞在-80℃保持6h，使用真空冷冻干燥器将其经历冷冻干燥24-36h以获得冻干的细胞。随后将冻干的大肠杆菌完整细胞用于从GTO产生生物柴油或酯化GTO中的FFA。
实施例31.使用表达脂肪酶SML的重组大肠杆菌在一锅法反应中从GTO产生FAME
将2.0g的GTO与0.1g的表达脂肪酶SML的重组大肠杆菌的冻干细胞(5wt％的催化剂载荷)一起添加以形成混合物。以24-h的间隔以相等的量添加甲醇(甲醇:GTO的摩尔比，4:1)。在500rpm的磁力搅拌下于30℃进行反应。以指定的时间间隔，取出反应样品如实施例24中所述进行GC分析。在96h的反应时间后，FAME产率达到82.1％(图40)。当催化剂载荷增加至10wt％时，获得更高的FAME产率(92.0％)，如图42中显示的。
实施例32.使用表达脂肪酶SML的重组大肠杆菌酯化GTO中的FFA
将2.0g的GTO与0.1g的表达脂肪酶SML的重组大肠杆菌的冻干细胞(5wt％的催化剂载荷)一起添加以形成混合物。以24-h的间隔以相等的量添加甲醇(甲醇:GTO的摩尔比，4:1)。在500rpm的磁力搅拌下于30℃进行反应。以指定的时间间隔，取出反应样品如实施例25中所述测定GTO的酸含量。在96h的反应后，GTO中FFA转化达到>95％，使GTO的酸水平降至低于1.0％(图41)。
实施例33.表达脂肪酶CALB的大肠杆菌完整细胞生物催化剂的制备
将重组大肠杆菌BL21接种至5mL的LB培养基，在培养12h后，将2％(v/v)的预培养物转移至装有100mL LB培养基(补充有50mg/L的卡那霉素)的500mLErlenmeyer瓶。将培养物在37℃和250rpm温育达到0.6-0.8的OD600nm。随后，通过添加异丙硫半乳糖苷(IPTG,终浓度1mM)来诱导脂肪酶表达。将培养物30℃和250rpm 下再生长另外6h，通过以6000rpm离心5min收集细胞。在用去离子水洗涤2次后，将收集的湿细胞在-80℃保持6h，随后使用真空冷冻干燥器将其经历冷冻干燥24-36h以获得冻干的细胞。随后将冻干的大肠杆菌完整细胞用于从GTO生产生物柴油或酯化GTO中的FFA。
实施例34.使用表达脂肪酶的重组大肠杆菌(CALB)从GTO产生FAME
将2.0g GTO和0.08g的表达脂肪酶CALB的重组大肠杆菌的冻干细胞(4wt％的催化剂载荷)一起添加以形成混合物。以12-h的间隔以相等的量添加甲醇(甲醇:GTO的摩尔比，3:1)。在摇床中在40℃和250rpm下进行反应。在指定的时间间隔，如实施例2中所述测定FAME产率。在84h的反应后，获得34％FAME产率(图43)。
实施例35.使用表达脂肪酶(CALB)的重组大肠杆菌酯化GTO中的FFA
将2.0g GTO和0.08g的表达脂肪酶CALB的重组大肠杆菌的冻干细胞(4wt％的催化剂载荷)一起添加以形成混合物。以12-h的间隔以相等的量添加甲醇(甲醇:GTO的摩尔比，3:1)。在摇床中在40℃和250rpm下进行反应。如图44中所示，96％的润滑脂中的FFA被转化为FAME。
实施例36.表达脂肪酶CALB和TLL的大肠杆菌完整细胞生物催化剂的制备
将在一个质粒中表达脂肪酶CALB和TLL的重组大肠杆菌BL21(DE3)接种至5mL的溶源肉汤(LB)培养基，在于37℃和250rpm培养12h小时后，将1％(v/v)的预培养物转移至500mL的装有100mL的补充有50mg卡那霉素的LB培养基的Erlenmeyer瓶。将培养物在37℃和250rpm温育达到0.6的OD(光密度)600nm。随后，通过添加异丙硫半乳糖苷(IPTG，终浓度0.2mM)诱导脂肪酶表达。应理解，在其它实例中，使用的IPTG浓度可从约0.05变化至5mM。将培养物在30℃和250rpm生长另外4h至OD600nm为3，随后通过以6000 rpm离心5min收集细胞。随后将大肠杆菌完整细胞用于从GTO产生生物柴油或酯化GTO中的FFA。通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析脂肪酶CALB和TLL的表达(图45)。通过用匀浆器在20psi下破坏收集的细胞、随后进行离心来制备无细胞提取物。将可溶性细胞裂解物(对应于0.5mL细胞培养物)加载至SDS-PAGE，用考马斯亮蓝对凝胶进行染色。
实施例37.使用表达脂肪酶CALB和TLL的重组大肠杆菌从GTO产生FAME
将2.0g GTO和0.08g的在一个质粒上表达脂肪酶CALB和TLL的重组大肠杆菌的湿细胞(4％的载荷)一起添加以形成混合物。以6-h的间隔以相等的量添加甲醇(甲醇:GTO的摩尔比，3:1)。在30℃和500rpm进行反应。以指定的时间间隔，如实施例2中所述测定FAME产率。在72h的反应后，获得87％的FAME产率(图46)。
实施例38.表达脂肪酶CALB和TLL的重组大肠杆菌用于从GTO产生FAME的再循环
在如实施例33中所述产生FAME后，将完整大肠杆菌细胞与产物混合物分离，用叔-丁醇洗涤，随后在30℃干燥2h。随后，将完整大肠杆菌细胞用于以与第一批次相同的条件下进行的新一轮反应。在5轮反应后细胞保持75％的原始生产率(FAME产率)(图47)。
实施例27至38的概述
下面提供根据本文中公开的一些实施方案的概述和/或其它信息，所述概述或信息可更好地帮助理解上述实施例27-38。
用于被一些实例采用的从土壤筛选产生脂肪酶的菌株的筛选方法示于图37中。此处，开发了两步骤筛选策略：脂肪酶活性的初步筛选和酯化或转酯活性的最终筛选。
用于初步筛选的示例性方法如下：从新加坡的不同地方收集土壤样品，将每一个土壤样品(1-5g)悬浮于10mL矿物盐培养基中。用油或脂肪酸酯作为碳源补充悬浮液以产生0.5-5％(v/v)的终浓度，在20-30℃和150-300rpm进行富集培养2～3天。在富集培养 后，将混合物的样品涂板在含有橄榄油和罗丹明B的富集培养基琼脂上，所述培养基用于筛选产生脂肪酶的菌株。如果在琼脂板上发生的菌株可产生脂肪酶，则其将水解橄榄油以产生游离脂肪酸，所述游离脂肪酸可与罗丹明B反应以形成在紫外(UV)光下具有荧光的化合物。在UV照射下具有清晰荧光区域的集落被选择用于使用GTO作为底物的酯化和转酯活性测试。
用于最终筛选的示例性方法如下：将71个具有明显的脂肪酶活性的菌株用于使用GTO作为底物的酯化和转酯活性测试。将菌株单个地接种入3-5mL的LB培养基，培养8-16h，将1-5％(v/v)的预培养物接种至发酵培养基以在20-30℃和150-300rpm进一步培养。在12h的培养后，通过离心收集细胞，用去离子水洗涤2次。随后将细胞于-80℃贮存4-12h，使用真空冷冻干燥器将其经历冷冻干燥1-3天以获得冻干细胞。将冻干细胞用作分别用于酯化或转酯活性测试的催化剂。在所有测试的菌株中，6个菌株显示明显的酯化或转酯活性。利用6个菌株的冻干细胞(1-10wt％，基于GTO)，使用GTO作为底物进行的FAME产生和FFA转化示于图38和39中。菌株P1-28分别显示最高的FAME产率(32％)和FFA转化(55％)。
根据16S rDNA基因测序和分类学分析，菌株P1-28被鉴定为粘质沙雷氏菌。随后克隆菌株p1-28(粘质沙雷氏菌YXJ-1002)的水解酶。用于从粘质沙雷氏菌YXJ-1002构建表达水解酶的重组大肠杆菌的方法如下：使用DNA聚合酶以及正向(5'-ACTCATATGGGCATCTTTAGCTATAAGGATCTG-3')和反向(5'-TGCAAGCTTTTAGGCCAACACCACCTGATCGG-3')引物的组合通过聚合酶链式反应(PCR)扩增酶基因sml，其中下划线分别代表NdeI和Hind III位点。将来自粘质沙雷氏菌YXJ-1002的DNA基因组用作模板。用NdeI和Hind III消化PCR产物，将其插入质粒pET-28a的对应限制性酶切位点以构建重组表达质粒pET28a-sml。将重组表达质粒转化进入大肠杆菌T7Express，随 后使用补充有卡那霉素的LB琼脂板选择卡那霉素抗性转化体。在大肠杆菌中克隆和表达酶后，重组大肠杆菌细胞的水解活性得到极大增强。如表1中所示，与野生型菌株粘质沙雷氏菌YXJ-1002相比较，重组大肠杆菌的脂肪酶产量从457U/l的初始水平极大地增加至2304U/l，从而比活性也增加约3倍。
表1.野生型菌株粘质沙雷氏菌YXJ-1002(P1-28)和表达脂肪酶SML的重组大肠杆菌的细胞生长和水解活性
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实施例中用于从南极假丝酵母构建表达水解酶例如脂肪酶CALB的重组大肠杆菌的方法如下：由GenScript合成最优化的CALB基因(登录号Z30645.1)。用BamH I和Kpn I消化CALB基因，将其插入质粒pRSFDuet的对应限制性酶切位点以构建重组表达质粒pRSFDuet-Calb。将重组表达质粒转化进入大肠杆菌BL21(DE3)，随后使用补充有卡那霉素的LB琼脂板选择卡那霉抗性转化体。随后通过培养来制备表达脂肪酶CALB的重组大肠杆菌细胞，用DI水洗涤通过离心收集的细胞3次，立即将其冷冻干燥以获得上述细胞粉剂，随后用作用于生产生物柴油的完整细胞生物催化剂。
通过使用完整细胞生物催化剂，通过利用甲醇的一锅酯化和转酯实现GTO至FAME的高效转化。作为示例性实例，将表达脂肪酶SML的冻干大肠杆菌完整细胞用作催化剂以5wt％的基于GTO的催化剂载荷，利用MeOH(4mol的MeOH:1mol的GTO) 转化包含17.4％的FFA的GTO。在溶剂例如叔-丁醇、正己烷等不存在的情况下，在无溶剂系统中在磁力搅拌下，在30℃和500rpm进行反应，以24-h的间隔以4个相等的量添加甲醇，通过GC检测生物柴油的形成。在反应进行96h后，从润滑脂的总FAME产率达到82.1％(图40)。通过将催化剂载荷增加至10wt％，如图42中所示，润滑脂至FAME的总产率在96h达到92％。此处开发的完整细胞催化剂显示非常良好的性能，表明在从GTO至生物柴油的实际产生中的极大潜能。
开发的完整细胞生物催化剂也用于通过利用甲醇的酯化进行的GTO中的FFA至FAME的高产率转化。这是图36中显示的用于从润滑脂产生生物柴油的两步策略中的第一步骤。在代表性实例中，表达脂肪酶SML的大肠杆菌完整细胞用于利用MeOH进行的包含17.4％的FFA的GTO中的FFA的酯化。在磁力搅拌下，在30℃和500rpm下，利用5wt％的催化剂:GTO、4:1(mol:mol)的MeOH:GTO检查反应，以24-h的间隔以4个相等的量添加甲醇。通过滴定测定GTO中FFA的减少的量。如图41中所示，在反应96h后，获得高FFA转化(>95％)(对应于<1.0％的酸值)。
作为另一个代表性实例，表达脂肪酶CALB的大肠杆菌完整细胞还用于利用MeOH酯化包含21.4％的FFA的GTO中的FFA。如图44中所示，在40℃和250rpm下，以4wt％的基于GTO的催化剂载荷进行反应，甲醇:GTO的摩尔比是3:1，以12-h的间隔以3个相等的量添加甲醇。在84h结束时获得酯化的高转化(>95％)。如图44中所示，完整细胞生物催化剂能够将润滑脂中的高含量的FFA转化为FAME，并且可用作高效预处理步骤。必要时，润滑脂中剩余的甘油三酯也可通过常规碱催化容易地转化为FAME。
作为另一个代表性实例，在一个质粒中表达脂肪酶CALB和TLL的大肠杆菌完整细胞也用于利用甲醇酯化包含21.4％的FFA的GTO的FFA。在30℃和500rpm下，以4wt％的基于GTO 的催化剂载荷进行反应，并且甲醇:GTO的摩尔比为3:1，以6-h的间隔以3个相等的量添加甲醇。如图46中所示，在72h内获得87％的FAME产率。还可将这些细胞再循环达到5次，同时保留75％的原始生产率，图47中显示的。
因此，细胞催化剂可在一锅法反应中用于将游离脂肪酸酯化成FAME和将甘油三酯转酯成FAME，如图35中显示的，或在图36中显示的两步反应中用作将游离脂肪酸酯化成FAME的预处理步骤。
作为另外的示例性实例，图49提供了可被实施例27-38中描述的一些颗粒采用的细胞催化颗粒的示例性图示。参照图49，颗粒430包含产生用于将FFA催化成脂肪酸酯的催化实体436的细胞小体432。虚线438代表通过细胞小体432产生和/或分泌的催化实体436。应用
本公开内容的实施方案有利地使得能够以高转化率将游离脂肪酸(FFA)转化为脂肪酸酯，特别是脂肪酸甲酯(FAME)。更具体地，可从包含超过按重量计10％以上的FFA，例如15％至40％wt的FFA的组合物将至少80％的FFA转化为FAME。
本公开内容的实施方案可允许以高转化效率在一锅法反应中从润滑脂产生FAME，而不必经历可能导致额外成本和降低效率的常规两步骤酯化/转酯反应。或者，本公开内容的实施方案还具有在常规两步骤酯化/转酯反应中被采用的灵活性，其中本文中公开的催化剂的实施方案可用于两步反应的酯化过程。
有利地，本文中公开的方法的实施方案不需要高热或高压来进行反应。例如，在一些实施方案中，可以在大体上环境条件下进行润滑脂中的FFA至FAME的转化。此外，本文中公开的方法的实施方案可通过使用无毒性非腐蚀性催化剂在温和反应条件下进行，从而不会不利地影响环境。常规酯化/转酯反应法中使用的腐蚀酸催化剂对于本文中公开的方法的一些实施方案可以不是必需的。此 外，在一些实施方案中，相较于常规方法，本文中公开的方法不需要使用毒性溶剂例如叔-丁醇。因此，在一些实施方案中，本文中公开的方法和催化剂可被认为是环境友好的。
更有利地，在一些实施方案中，本文中公开的催化剂可以以快速简单的方式被再循环和再使用。再循环的催化剂可有益地用于多个游离脂肪酸至脂肪酸酯的转化循环，同时仍然维持高转化率，即可将至少80％的FFA从包含按重量计超过10％的FFA的组合物转化为FAME。催化剂的一些实施方案的再循环能力和再使用性可潜在地降低生物柴油/生物燃料生产的成本，因为每一个循环后催化剂替代的成本被降至最低。
有利地，本文中公开的催化剂的实施方案可以以快速高效的方式以及以低本本产生。这可潜在地降低生物柴油/生物燃料生产的总体生产成本。
一些实施方案(SE)
下面引用本公开内容的一些实施方案。
SE1：一种方法，其从包含按重量计至少10％的游离脂肪酸(FFA)的组合物产生脂肪酸酯，所述方法包括：
将多个微米或纳米尺寸的催化颗粒与组合物温育，以催化FFA至脂肪酸酯的转化，以便至少80％的FFA被转化为脂肪酸酯。
SE2：SE1的方法，其中所述脂肪酸酯包含脂肪酸烷基酯。
SE3：前述SE的任一项的方法，其中所述温育步骤包括在醇存在的情况下将多个微米或纳米尺寸的催化颗粒与所述组合物温育。
SE4：前述SE的任一项的方法，其中在低于150℃的温度进行所述温育步骤。
SE5：前述SE的任一项的方法，其中在低于121kPa的压力下进行所述温育步骤。
SE6：前述SE的任一项的方法，其中在30至5760分钟内进 行所述温育步骤。
SE7：前述SE的任一项的方法，其中所述微米或纳米尺寸的催化颗粒具有不超过800μm的平均粒度或直径。
SE8：前述SE的任一项的方法，其中所述组合物还包含甘油酯，优选甘油三酯。
SE9：前述SE的任一项的方法，其中所述组合物包含润滑脂，优选褐色润滑脂。
SE10：SE8的方法，其中微米或纳米尺寸的催化颗粒能够额外地催化甘油酯至脂肪酸酯的转化。
SE11：SE10的方法，其中同时进行FFA至脂肪酸酯的转化和甘油酯至脂肪酸酯的转化。
SE12：SE11的方法，其中FFA至脂肪酸酯的转化和甘油酯至脂肪酸酯的转化是一步法。
SE13：SE10的方法，还包括将甘油酯暴露于碱以催化甘油酯至脂肪酸酯的转化。
SE14：SE3至13的任一项的方法，其中所述醇选自甲醇、甘油、乙醇、丙醇、丁醇、戊醇及其混合物。
SE15：SE3至14的任一项的方法，其中所述醇与所述组合物的摩尔比为2:1至40:1。
SE16：前述SE的任一项的方法，其中所述微米或纳米尺寸的催化颗粒选自聚合物颗粒、二氧化硅颗粒、微生物细胞及其混合物。
SE17：SE16的方法，其中所述聚合物颗粒或二氧化硅颗粒为磁性颗粒。
SE18：SE17的方法，其中所述磁性颗粒为顺磁性颗粒。
SE19：SE17的方法，其中所述磁性颗粒包含：
外壳；
被所述外壳至少部分封装的磁性核心；和
被固定在所述外壳上的催化实体，用于催化FFA至脂肪酸酯 的转化。
SE20：SE17的方法，其中所述磁性核心的磁性性质由金属氧化物，优选氧化铁提供。
SE21：SE19至20的任一项的方法，其中所述磁性核心包含多个磁性纳米-尺寸颗粒。
SE22：SE21的方法，其中所述磁性纳米-尺寸颗粒用封端剂、优选油酸涂覆。
SE23：SE21至22的任一项的方法，其中所述磁性纳米-尺寸颗粒具5-20nm的平均直径。
SE24：SE18至23的任一项的方法，其中所述外壳是聚合物壳或二氧化硅壳的至少一种。
SE25：SE24的方法，其中所述聚合物壳包含选自聚(甲基丙烯酸缩水甘油酯)(PGMA)、聚苯乙烯(PS)和聚(甲基丙烯酸甲酯)(PMMA)的聚合物。
SE26：SE19至25的任一项的方法，其中所述催化实体选自酶和酸基团的至少一种。
SE27：SE26的方法，其中所述酶包括水解酶。
SE28：SE26的方法，其中所述酸基团包括磺酸。
SE29：SE27的方法，其中所述水解酶选自南极假丝酵母脂肪酶B(CALB)和疏绵状嗜热丝孢菌脂肪酶。
SE30：SE19至29的任一项的方法，其中通过接头将所述水解酶固定在聚合物壳上，所述接头选自含环氧化物官能团接头、含胺官能团接头、含醛官能团接头、含苯官能团接头、含酯官能团接头及其混合物。
SE31：SE30的方法，其中所述接头为4,7,10-三氧-1,13-十三烷二胺。
SE32：SE16的方法，其中所述微生物为表达水解酶的微生物的野生型菌株。
SE33：SE15的方法，其中所述微生物为表达水解酶的重组 微生物。
SE34：SE32至33的任一项的方法，其中所述水解酶包括脂肪酶.
SE35：SE32的方法，其中所述微生物的野生型菌株为SMYXJ-1002。
SE36：SE33的方法，其中所述重组微生物为表达脂肪酶的大肠杆菌。
SE37：SE32的方法，其中使用油和/或脂肪酸酯作为碳源，优选唯一碳源来从土壤分离表达水解酶的微生物的野生型菌株。
SE38：SE37的方法，其中所述油包括橄榄油，并且所述脂肪酸酯包括棕榈酸甲酯。
SE39：一种微米或纳米尺寸的催化颗粒，其包含：
具有在微米或纳米范围内的维度的小体；和
与小体结合的用于催化游离脂肪酸(FFA)至脂肪酸酯的转化的催化装置，
其中所述催化颗粒适用于催化包含按重量计至少10％的FFA的组合物中的至少80％的FFA至脂肪酸酯的转化。
SE40：SE39的微米或纳米尺寸的催化颗粒，其中所述颗粒为磁性颗粒并且所述小体包含：
外壳；和
被所述外壳至少部分封装的磁性核心，
并且其中与所述小体结合的催化装置是固定在所述外壳上的催化实体，用于催化FFA至脂肪酸酯的转化。
SE41：SE40的微米或纳米尺寸的催化颗粒，其中所述磁性核心的磁性性质由金属氧化物提供。
SE42：SE40至41的任一项的微米或纳米尺寸的催化颗粒，其中所述磁性核心包含多个磁性纳米-尺寸颗粒。
SE43：SE42的微米或纳米尺寸的催化颗粒，其中用封端剂优选油酸涂覆所述磁性纳米-尺寸颗粒。
SE44：SE40至43的任一项的微米或纳米尺寸的催化颗粒，其中所述外壳为聚合物壳或二氧化硅壳的至少之一。
SE45：SE44的微米或纳米尺寸的催化颗粒，其中所述聚合物壳包含选自聚(甲基丙烯酸缩水甘油酯)(PGMA)、聚苯乙烯(PS)和聚(甲基丙烯酸甲酯)(PMMA)的聚合物。
SE46：SE40至45的任一项的微米或纳米尺寸的催化颗粒，其中所述催化实体选自酶和酸基团。
SE47：SE46的微米或纳米尺寸的催化颗粒，其中所述酶包括水解酶。
SE48：SE46的微米或纳米尺寸的催化颗粒，其中所述酸基团包括磺酸。
SE49：SE47的微米或纳米尺寸的催化颗粒，其中所述水解酶选自南极假丝酵母脂肪酶B(CALB)和疏绵状嗜热丝孢菌脂肪酶。
SE50：SE40至49的任一项的微米或纳米尺寸的催化颗粒，其中通过接头将所述水解酶固定在聚合物壳上，所述接头选自含环氧化物官能团接头、含胺官能团接头、含醛官能团接头、含苯官能团接头、含酯官能团接头及其混合物。
SE51：SE40至50的任一项的微米或纳米尺寸的催化颗粒，其中所述颗粒具有10-100mg酶/颗粒的单位载荷。
SE52：SE50的微米或纳米尺寸的催化颗粒，其中所述接头为4,7,10-三氧-1,13-十三烷二胺。
SE53：SE39的微米或纳米尺寸的催化颗粒，其中所述微米或纳米尺寸的催化颗粒是微生物的细胞，所述颗粒的小体是细胞的小体，并且与所述小体结合的催化装置是在细胞的小体中产生的或从细胞的小体产生的用于催化FFA至脂肪酸酯的转化的酶。
SE54：SE53的微米或纳米尺寸的催化颗粒，其中所述酶是水解酶。
SE55：SE53至54的任一项的微米或纳米尺寸的催化颗粒，其中所述微生物是表达所述水解酶的重组微生物。
SE56：SE53至55的任一项的微米或纳米尺寸的催化颗粒，其中所述水解酶包括脂肪酶。
SE57：SE55的微米或纳米尺寸的催化颗粒，其中所述重组微生物包含一个或多个编码水解酶的核酸序列，所述核酸序列与SEQ ID No.1和/或SEQ ID No.3和/或SEQ ID No.5具有至少约80％同源性/同一性，至少约90％同源性/同一性，至少约95％同源性/同一性，至少约96％同源性/同一性，至少约97％同源性/同一性，至少约98％同源性/同一性，至少约99％同源性/同一性或约100％同源性/同一性：
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SE58：SE55的微米或纳米尺寸的催化颗粒，其中所述重组微生物表达能够催化FFA至脂肪酸酯的转化的酶，所述酶包含与SEQ IDNo.2或SEQ ID No.4或SEQ ID No.6具有至少约80％同源性/同一性，至少约90％同源性/同一性，至少约95％同源性/同一性，至少约96％同源性/同一性，至少约97％同源性/同一性，至少约98％同源性/同一性，至少约99％同源性/同一性或约100％同源性/同一性的氨基酸序列
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SE59：SE55的微米或纳米尺寸的催化颗粒，其中所述重组微生物表达脂肪酶的大肠杆菌。
SE60：一种产生微米或纳米尺寸的催化颗粒的方法，所述方法包括：
形成磁性核心；
用外壳封装磁性核心的至少一部分；和
将催化实体固定在所述外壳上，
其中所述催化实体适合催化包含按重量计至少10％的FFA的组合物中的至少80％的FFA至脂肪酸酯的转化。
SE61：SE60的所述方法，其中形成磁性核心的步骤包括形成多个磁性纳米-尺寸颗粒。
SE62：SE61的方法，其中形成多个磁性纳米-尺寸颗粒的步骤包括共沉淀以获得所述磁性纳米-尺寸颗粒。
SE63：SE61至62的任一项的方法，其中所述磁性纳米-尺寸颗粒具有5-20nm的平均直径。
SE64：SE60至63的任一项的方法，其中所述外壳为聚合物壳或二氧化硅壳的至少一种。
SE65：SE64的方法，其中用所述聚合物壳封装所述磁性核心的步骤包括：
将所述磁性核心与所述聚合物壳的一个或多个单体前体以及引发剂在水中混合；和
聚合所述单体前体以形成封装所述磁性核心的聚合物壳。
SE66：SE65的方法，其中用二氧化硅壳封装所述磁性核心的步骤包括：
将所述磁性核心与四乙基正硅酸酯在含有醇和氨的水中混合以获得混合物；和
从所述混合物沉淀二氧化硅以形成封装所述磁性核心的二氧化硅壳。
SE67：SE60至66的任一项的方法，其中将催化实体固定至外壳的步骤包括将催化实体化学偶联至所述外壳或将催化实体物理吸附至所述外壳的至少之一种。
SE68：SE60至66的任一项的方法，其中将催化实体固定至所述外壳的步骤包括：
(i)将催化实体与所述外壳的与催化实体有化学反应活性的官能团共价偶联，以将催化实体固定至所述外壳；或
(ii)利用与催化实体有化学反应活性的官能团官能化所述外壳的表面；和将催化实体与所述官能团化学偶联，以将催化实体固定至所述外壳。
SE69：一种获得细胞催化剂的方法，包括：
a)从产生水解酶的微生物的文库鉴定微生物的菌株，所述鉴定的微生物菌株相较于文库中至少50％的其它微生物菌株能够催化更多FFA至脂肪酸酯的转化；
b)从步骤a)中鉴定的菌株鉴定水解酶的基因序列，所述水解酶能够催化FFA至脂肪酸酯的转化；
c)将所述基因序列引入宿主细胞以获得重组宿主细胞，所述重组宿主细胞能够在大体上相似的条件下以比步骤a)中鉴定的微 生物的菌株更多的量表达所述水解酶，
其中所述重组宿主细胞能够催化包含按重量计至少10％的FFA的组合物中的至少80％的FFA至脂肪酸酯的转化。
SE70：一种从混合物分离SE40至52的任一项的磁性催化颗粒的方法，所述方法包括：
施加外部磁场或离心力以使催化颗粒聚集在一起；和
从聚集的磁性催化颗粒除去混合物的其余部分。
SE71：一种从包含按重量计至少10％的游离脂肪酸(FFA)的组合物产生脂肪酸酯的方法，所述方法包括：
将多个获自SE68的方法的微米或纳米尺寸的催化颗粒与所述组合物温育以催化FFA至脂肪酸酯的转化，以便至少80％的FFA转化为脂肪酸酯。
在一个实施方案中，提供了用于通过使用纳米或微米生物催化剂从包含高浓度的FFA的隔油池油(GTO)产生FAME的方法。
在一个实施方案中，公开的从包含高浓度的FFA的隔油池油(GTO)产生FAME的方法通过用纳米或微米生物催化剂在一锅法中进行酯化和转酯来实现。
在一个实施方案中，公开的用于从包含高浓度的FFA的隔油池油(GTO)产生FAME的方法包括两个步骤，其中润滑脂中的FFA至FAME的转化的高产率通过在第一步骤中使用纳米或微米生物催化剂来获得，并且在第二步骤中实现剩余的甘油三酯至FAME的转化。
在一个实施方案中，公开的隔油池油(GTO)是包含14-22wt％的FFA的褐色润滑脂。
在一个实施方案中，公开的纳米-和微米-生物催化剂是固定在磁性纳米颗粒上的酶。
在一个实施方案中，公开的磁性纳米颗粒是包含磁性核心、聚合物壳和表面上的官能团的纳米颗粒。在一个实施方案中，公开的磁性核心包含多个具有超顺磁性性质和5-20nm的尺寸或直径的 亚纳米颗粒。
在一个实施方案中，公开的亚纳米颗粒是氧化铁纳米颗粒。在一个实施方案中，公开的亚纳米颗粒是具有油酸涂层的氧化铁纳米颗粒。
在一个实施方案中，公开的聚合物壳是聚(甲基丙烯酸缩水甘油酯)(PGMA)。
在一个实施方案中，公开的聚合物壳是聚苯乙烯(PS)。
在一个实施方案中，公开的聚合物壳是聚(甲基丙烯酸甲酯)(PMMA)。
在一个实施方案中，公开的表面上的官能团是环氧化物。在一个实施方案中，表面上公开的官能团是胺。
在一个实施方案中，公开的表面上的官能团是醛。
在一个实施方案中，公开的表面上的官能团是苯。
在一个实施方案中，公开的表面上的官能团是酯。
在一个实施方案中，通过环氧化物表面基团与二胺的反应引入公开的胺基。
在一个实施方案中，公开的二胺是乙二胺。在一个实施方案中，公开的二胺是4,7,10-三氧-1,13-十三烷二胺。
在一个实施方案中，通过胺表面基团与戊二醛的反应引入公开的醛基。
在一个实施方案中，公开的磁性纳米颗粒具有40-800nm的均一的尺寸分布，尺寸或直径。
在一个实施方案中，公开的酶是水解酶。在一个实施方案中，公开的水解酶是南极假丝酵母脂肪酶B(CALB)。
在一个实施方案中，公开的水解酶疏绵状嗜热丝孢菌脂肪酶(TLL)。
在一个实施方案中，公开的酶通过共价结合被固定在磁性纳米颗粒上。
在一个实施方案中，公开的酶通过物理相互作用被固定在磁性 纳米颗粒上。
在一个实施方案中，公开的微米生物催化剂是单个纳米生物催化剂的簇。
在一个实施方案中，公开的簇是非交联簇。
在一个实施方案中，公开的簇是可逆簇。
在一个实施方案中，公开的微米生物催化剂是MNA TL，其为在由氧化铁核心、聚(甲基丙烯酸缩水甘油酯)壳和醛表面基团组成的磁性纳米颗粒(CHO-MNP)上包含疏绵状嗜热丝孢菌脂肪酶(TLL)的纳米-生物催化剂的非交联簇。
在一个实施方案中，公开的微米生物催化剂MNA TL通过在4-30℃摇动磷酸盐缓冲液(7mM,pH5-8)中的TLL和CHO-MNP，进行0.5-12h来制备。
在一个实施方案中，公开的微米生物催化剂是MNA CA，其为在由氧化铁核心、聚(甲基丙烯酸缩水甘油酯)壳和醛表面基团组成的磁性纳米颗粒(CHO-MNP)上包含南极假丝酵母脂肪酶B(CALB)的纳米-生物催化剂的非交联簇。在一个实施方案中，公开的微米生物催化剂MNA CA通过在4-30℃摇动磷酸盐缓冲液(7mM,pH5-8)中的CALB和CHO-MNP，进行0.5-12h来制备。
在一个实施方案中，公开的纳米生物催化剂是在由氧化铁核心、聚(甲基丙烯酸缩水甘油酯)壳和醛表面基团组成的磁性纳米颗粒(GA-MNP)上包含CALB的GAP CA。
在一个实施方案中，公开的纳米生物催化剂GAP CA通过在pH7和4-30℃摇动磷酸盐缓冲液中的CALB和GA-MNP，进行4-12h来制备。
在一个实施方案中，公开的纳米生物催化剂是EDAP CA，其在由氧化铁核心、聚(甲基丙烯酸缩水甘油酯)壳和胺表面基团组成的磁性纳米颗粒(EDA-MNP)上包含CALB。
在一个实施方案中，公开的纳米生物催化剂EDAP CA通过在pH7和4-30℃摇动磷酸盐缓冲液中的CALB、戊二醛和 EDA-MNP，进行4-12h来制备。
在一个实施方案中，公开的纳米生物催化剂是在由氧化铁核心、聚苯乙烯壳和苯基表面基团组成的磁性纳米颗粒(PS-MNP)上包含CALB的PSP CA。
在一个实施方案中，公开的纳米生物催化剂PSAP CA通过在4-30℃摇动pH7的磷酸盐缓冲液中的CALB和PS-MNP进行4-12h，通过物理吸附来制备。
在一个实施方案中，公开的纳米生物催化剂是在由氧化铁核心、聚(甲基丙烯酸甲酯)壳和酯表面基团组成的磁性纳米颗粒(PMMA-MNP)上包含CALB的PMMAP CA。
在一个实施方案中，公开的纳米生物催化剂PMMAP CA通过在4-30℃摇动pH7的磷酸盐缓冲液中的CALB和PMMA-MNP进行4-12h，通过物理吸附来制备。
在一个实施方案中，公开的微米-生物催化剂具有拥有小于100μm的尺寸或直径的规则形状。在一个实施方案中，公开的微米-生物催化剂具有10-100mg酶/克颗粒的单位载荷。
在一个实施方案中，公开的纳米-生物催化剂具有10-300mg酶/克颗粒的单位载荷。
在一个实施方案中，公开的纳米或微米生物催化剂的分离通过使用外部磁场来实现。
在一个实施方案中，公开的纳米或微米生物催化剂的分离通过离心，随后进行磁力分离来实现。
在一个实施方案中，公开的从包含高浓度的FFA的隔油池油(GTO)高产率产生FAME是通过在具有纳米或微米生物催化剂的硅胶微珠存在的情况下，将隔油池油(GTO)与MeOH反应来实现的。
在一个实施方案中，公开的生物催化剂是可再循环的，每一个循环的生物转化具有高FAME产率。
在一个实施方案中，在每一个循环的反应后，在外部磁场下从 反应混合物分离公开的生物催化剂，将其洗涤，冷冻干燥，随后用于下一个循环的反应。
在一个实施方案中，公开的GTO中的FFA至FAME的高产率转化通过利用纳米或微米生物催化剂，使隔油池油(GTO)与MeOH反应来实现，产生具有<1wt％的FFA的产物，所述产物适合用于通过常规碱催化来将剩余的甘油三酯进一步转化为FAME。
在一个实施方案中，公开的生物催化剂是可再循环的，在每一个循环的生物转化中使GTO中的FFA有效地减少至1-2wt％。
在一个实施方案中，在每一个循环的反应后，在外部磁场下将公开的生物催化剂从反应混合物分离，将其洗涤，冷冻干燥，随后用于下一个循环的反应。
在一个实施方案中，提供了用于通过使用可再循环的纳米或微米-尺寸顺磁性固体酸催化剂，通过利用醇的酯化反应来减少润滑脂中的脂肪酸的方法。
在一个实施方案中，公开的醇为甲醇。
在一个实施方案中，公开的醇为甘油。
在一个实施方案中，公开的可再循环的纳米-尺寸顺磁性固体酸催化剂为核心-壳纳米颗粒，其由磁性核心、聚合物或无机物壳和表面上的酸基团组成。
在一个实施方案中，公开的磁性核心包含多个具有超顺磁性性质和5-20nm的尺寸或直径的亚纳米颗粒。
在一个实施方案中，公开的亚纳米颗粒为氧化铁纳米颗粒。
在一个实施方案中，公开的亚纳米颗粒为涂覆有油酸的氧化铁。
在一个实施方案中，公开的聚合物壳为聚(甲基丙烯酸缩水甘油酯)。
在一个实施方案中，公开的聚合物壳为聚苯乙烯。
在一个实施方案中，公开的无机物壳为二氧化硅。
在一个实施方案中，公开的酸基团为磺酸。
在一个实施方案中，公开的可再循环的微米-尺寸顺磁性固体酸催化剂为聚集的可再循环的纳米-尺寸顺磁性固体酸催化剂。
在一个实施方案中，公开的可再循环的纳米-尺寸顺磁性固体酸催化剂通过将聚(甲基丙烯酸缩水甘油酯)-涂覆的磁性纳米颗粒与亚硫酸钠混合，随后与盐酸混合来制备。
在一个实施方案中，公开的可再循环的纳米-尺寸顺磁性固体酸催化剂通过摇动聚苯乙烯涂覆的磁性纳米颗粒与硫酸来制备。
在一个实施方案中，公开的可再循环的纳米-尺寸顺磁性固体酸催化剂通过将涂覆有二氧化硅的磁性纳米颗粒与3-巯基丙基三甲氧硅烷在乙醇和去离子水中混合，随后与过氧化氢在甲醇和去离子水中混合，随后与硫酸溶液混合来制备。
在一个实施方案中，公开的可再循环的微米-尺寸顺磁性固体酸催化剂通过在真空下干燥聚苯乙烯-涂覆的磁性纳米颗粒并摇动所得的微粒与硫酸来制备。
在一个实施方案中，公开的可再循环的纳米-尺寸顺磁性固体酸催化剂通过使用外部磁场来分离。
在一个实施方案中，公开的可再循环的微米-尺寸顺磁性固体酸催化剂通过离心来分离。
在一个实施方案中，公开的用于减少润滑脂中的脂肪酸的方法通过使用可再循环的纳米-或微米-尺寸顺磁性固体酸催化剂，将润滑脂与甲醇反应来实现，产生具有低值的游离脂肪酸的产物，将所述产物经历利用甲醇的碱催化的转酯反应以产生生物柴油。
在一个实施方案中，通过离心或在磁场下，将公开的可再循环的纳米-或微米-尺寸顺磁性固体酸催化剂从反应混合物分离，将其洗涤，干燥，随后用于下一轮反应。
在一个实施方案中，公开的可再循环的纳米-或微米-尺寸顺磁性固体酸催化剂可被再使用而无需任何再生，在每一轮反应后产生具有低值的游离脂肪酸的产物。
在一个实施方案中，公开的用于减少润滑脂中的游离脂肪酸的 方法通过使用可再循环的纳米-或微米-尺寸顺磁性固体酸催化剂，将润滑脂与甲醇反应来实现，产生具有低值的游离脂肪酸的产物，将所述产物经历利用甲醇的碱催化的转酯反应以产生生物柴油。
在一个实施方案中，通过离心或在磁场下，将公开的可再循环的纳米-或微米-尺寸顺磁性固体酸催化剂从反应混合物分离，将其洗涤，干燥，随后用于下一轮反应。
在一个实施方案中，公开的可再循环的纳米-或微米-尺寸顺磁性固体酸催化剂可被再使用而无需任何再生，在每一轮反应后产生具有低值的游离脂肪酸的产物。
在一个实施方案中，提供了通过使用完整细胞生物催化剂以高产率从包含高浓度的FFA的隔油池油产生FAME的方法。
在一个实施方案中，公开的用于从包含高浓度的FFA的隔油池油(GTO)产生FAME的方法通过在一锅法反应中利用完整细胞生物催化剂进行酯化和转酯反应来实现。
在一个实施方案中，公开的用于从包含高浓度的FFA的隔油池油(GTO)产生FAME的方法包括两个步骤，其中通过在第一步骤中使用完整细胞生物催化剂来实现润滑脂中的FFA至FAME的转化的高产率，并且在第二步骤中利用碱催化剂来实现剩余甘油三酯至FAME的转化。
在一个实施方案中，公开的隔油池油(GTO)是包含15-40wt％的FFA的褐色润滑脂。
在一个实施方案中，公开的完整细胞生物催化剂是微生物的细胞。
在一个实施方案中，公开的微生物是野生型菌株。
在一个实施方案中，公开的微生物是重组微生物。
在一个实施方案中，公开的重组微生物是重组大肠杆菌。
在一个实施方案中，公开的重组大肠杆菌用于表达酶。
在一个实施方案中，公开的酶是水解酶。
在一个实施方案中，公开的水解酶是来自野生型菌株的脂肪酶 SML。
在一个实施方案中，公开的水解酶为南极假丝酵母脂肪酶B(CALB)。
在一个实施方案中，公开的野生型菌株是粘质沙雷菌YXJ-1002。
在一个实施方案中，公开的粘质沙雷菌YXJ-1002是使用油或脂肪酸酯作为唯一碳原从土壤分离的。
在一个实施方案中，公开的油是橄榄油。
在一个实施方案中，公开的油是隔油池油(GTO)。
在一个实施方案中，公开的脂肪酸酯是是棕榈酸甲酯。
在一个实施方案中，在新加坡收集公开的土壤样品。
在一个实施方案中，公开的重组大肠杆菌是大肠杆菌T7Express。
在一个实施方案中，公开的重组大肠杆菌是大肠杆菌BL21(DE3)。
在一个实施方案中，公开的完整细胞生物催化剂是冻干细胞。
在一个实施方案中，公开的冻干细胞是冻干的表达脂肪酶SML的大肠杆菌T7表达细胞。
在一个实施方案中，公开的冻干细胞是冻干的表达脂肪酶CALB的大肠杆菌BL21(DE3)细胞。
在一个实施方案中，公开的冻干的完整细胞生物催化剂的制备包括：1)将大肠杆菌T7或大肠杆菌BL21(DE3)细胞接种至LB培养基以进行种子培养；2)将种子培养物接种至包含卡那霉素的LB或TB培养基中以进行培养；3)通过添加异丙硫半乳糖苷(TPTG)来诱导酶表达；4)通过离心收集细胞，使用去离子水洗涤细胞；5)使用真空冷冻来冻干湿的完整细胞以获得冻干细胞。
在一个实施方案中，在20-40℃和150-400rpm下进行公开的种子培养6-18h。
在一个实施方案中，用于接种的种子培养物的量为 0.5-5％(v/v)。
在一个实施方案中，用于酶诱导的OD600值为0.6-0.8。
在一个实施方案中，用于诱导的IPTG的终浓度为0.05-5mM。
在一个实施方案中，在15-30℃和150-400rpm下进行酶的表达6-18h。
在一个实施方案中，利用去离子水洗涤收集的细胞1-3次。
在一个实施方案中，进行冷冻干燥24-72h。
在一个实施方案中，通过使用完整细胞生物催化剂使隔油池油(GTO)与甲醇反应来从包含高浓度的FFA的隔油池油(GTO)高产率地产生FAME。
在一个实施方案中，完整细胞生物催化剂的催化剂载荷为基于隔油池油(GTO)1-10wt％。
在一个实施方案中，甲醇与隔油池油(GTO)的总的摩尔比为3:1-8:1。
在一个实施方案中，在20-50℃进行反应。
在一个实施方案中，GTO中的FFA至FAME的高产率转化通过使用完整细胞生物催化剂，利用甲醇与隔油池油(GTO)的反应来实现，产生具有<1wt％的FFA的产物，所述产物适合用于通过常规碱催化将剩余甘油三酯进一步转化为FAME。
在一个实施方案中，完整细胞生物催化剂的催化剂载荷为基于隔油池油(GTO)1-10wt％。
在一个实施方案中，甲醇与隔油池油(GTO)的总的摩尔比为2:1-4:1。
在一个实施方案中，在20-50℃进行反应。
本领域技术人员应理解，可对本文中公开的实施方案进行其它变化和/或变动而不背离如广泛描述的本公开内容的精神或范围。本实施方案从而可在所有方面被认为是举例说明性的而非限制性的。
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