一种漆酶介体ABTSSIO2纳米粒子及其制备方法和应用.pdf

本发明公开了一种漆酶介体ABTS-SiO2纳米粒子及其制备方法和应用，属于生物技术、纳米材料和环境治理技术领域。本发明的技术方案要点为：将ABTS修饰到SiO2纳米粒子上制得漆酶介体ABTS-SiO2纳米粒子，制得的ABTS-SiO2纳米粒子作为漆酶介体在酶催化反应完成后，用还原性物质与氧化的ABTS发生还原反应使其还原，然后通过离心回收漆酶介体ABTS-SiO2纳米粒子，从而实现漆酶介体ABTS-SiO2纳米粒子重复循环使用。本发明制备方法简单、成本低廉、重复性好，也能够很好地满足大量生产的要求，在环境污染控制、化学合成、造纸、漂白和能源等领域具有广泛的应用前景。

权利要求书
1.  一种漆酶介体ABTS-SiO2纳米粒子的制备方法，其特征在于包括以下步骤：（1）将ABTS溶于无水甲醇中，再加入叔丁醇钾，超声分散均匀后搅拌反应1-3h，过滤后用无水甲醇洗涤多次，然后干燥除去甲醇，得到灰白色的2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二钾盐；（2）将三苯基磷溶于无水乙腈中并在冰浴条件下滴加溴至溶液呈浅黄色，再加入三苯基磷使溶液变成无色，得到二溴三苯基膦；（3）在步骤（2）制得的二溴三苯基膦中加入步骤（1）制得的2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二钾盐，搅拌反应1-3h，得到2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酰溴)；（4）在步骤（3）的反应液中加入表面氨基化的SiO2纳米粒子和三乙胺，继续搅拌反应完全后，离心收集沉淀，所得沉淀分别用甲醇和水多次洗涤后得到漆酶介体ABTS-SiO2纳米粒子。

2.  一种权利要求1所述的漆酶介体ABTS-SiO2纳米粒子的制备方法制得的在SiO2纳米粒子表面共价接枝ABTS的漆酶介体ABTS-SiO2纳米粒子，其具有如下结构：
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3.   权利要求2所述的漆酶介体ABTS-SiO2纳米粒子在去除水体中污染物的应用，其特征在于具体方法为：（1）取制得的漆酶介体ABTS-SiO2纳米粒子加入到pH=4.5的醋酸缓冲溶液中，再加入漆酶，然后加入含有污染物的水体，振荡反应至完全；（2）在步骤（1）的酶催化反应完全后，加入抗坏血酸，搅拌反应至ABTS-SiO2纳米粒子从绿色变成浅黄色，然后将反应混合液离心，倒掉上清液，随后用蒸馏水洗涤沉淀物多次，回收得到的漆酶介体ABTS-SiO2纳米粒子进一步重复使用。

4.   根据权利要求3所述的漆酶介体ABTS-SiO2纳米粒子在去除水体中污染物的应用，其特征在于：所述的污染物为染料、三氯苯酚或苯酚。

说明书一种漆酶介体ABTS-SiO2纳米粒子及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于生物技术、纳米材料和环境治理技术领域，具体涉及一种漆酶介体ABTS-SiO2纳米粒子及其制备方法和应用。
背景技术
漆酶（EC 1.10.3.2，苯二酚氧化酶）是一种多铜离子的蛋白，属于蓝色氧化酶，能催化多种有机底物包括酚类、芳香胺和无机化合物，其以氧作为电子受体，产生的副产物只有水。由于漆酶有很广泛底物范围，在许多工业和生物技术中得到应用，它们是一类非常重要的酶。研究报道表明，在单独应用漆酶时，其对氧化还原电位较高的底物，不能够发生完全的催化作用。但是，在加入一些被称为漆酶介体的物质后，如2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐（ABTS）等，能够显著促进漆酶对非酚类或非酶类底物的催化作用。这些介体作为电子载体，能使电子在酶和非酚类底物之间转移。漆酶介体体系的发现，进一步促进了漆酶的广泛使用，目前漆酶介体体系在造纸工业、有机合成、生物传感器和环境处理等多个领域有广泛应用。然而，大部分作用效果强的介体属于人工合成的化合物（如ABTS），这些合成的介体是小分子化合物，而漆酶的催化反应在溶液中完成，因此介体在使用的过程中处于一种水溶的状态，如果大量的使用这些介体，会存在以下些问题：其一，由于介体使用后难以回收，随着废液流失，从而提高了漆酶介体系统使用成本；其二，合成的介体有一定的毒性，使用后丢弃会造成环境污染；其三，使用后的介体如何进一步再生利用。解决这些问题的主要思路是将介体小分子连接到固体材料中，将其固定化处理，易于回收，从而使其再生，能够重复使用。
纳米材料具有高比表面积和高活性等特点，其中SiO2纳米粒子的制备和表面修饰技术已经取得了较大成功，使其在医学、生物技术、纺织、粘合剂和涂料等诸多领域得到了较为广泛的应用。将ABTS修饰到SiO2纳米粒子上，有效利用了纳米SiO2的生物相容性，另外纳米级别的粒子对反应的传质过程影响较小。ABTS是一种最早使用的漆酶介体，具有催化效率高和使用方便等优点，而如何利用化学合成的方法，将ABTS共价连接到SiO2纳米粒子上，这是一个十分重要的研究课题。修饰有ABTS的纳米粒子可以作为一种漆酶介体，能够大大扩展漆酶的应用范围，甚至可以扩展到能使用ABTS作为介体的其他氧化酶类如胆红素氧化酶和木质素氧化酶等，因此具有重要的应用价值。
在染料生产和纺织的过程中会使用到大量的染料，而很多染料具有良好的水溶性，生产过程和洗涤过程中产生的染料废水，对于水体会造成明显的污染。大部分染料具有一定的毒性，难以被环境吸收和生物降解，影响水生生物的生存和人体健康，造成严重的环境污染问题，因此当今面临的一个重大环境污染问题是如何除去污水中的染料。寻找高效且低成本的除去工业废水中染料的方法是一个重大的挑战，现已应用的方法有吸附、混凝、生物降解、化学降解和光降解等，但这些方法普遍存在效率低和成本高等缺陷。
发明内容
本发明解决的技术问题是提供了一种工艺简单、成本低廉、重复性好且能够较好地满足量产要求的漆酶介体ABTS-SiO2纳米粒子的制备方法，该制备方法是将ABTS通过共价接枝到氨基化的SiO2纳米粒子表面形成漆酶介体ABTS-SiO2纳米粒子。
本发明解决的另一个技术问题是上述制得的漆酶介体ABTS-SiO2纳米粒子在去除水体中污染物的应用，在SiO2纳米粒子固定化的ABTS漆酶介体完成催化作用后，再用还原性物质（如抗坏血酸等）与氧化后的ABTS发生还原反应，重新生成ABTS，然后通过离心或者过滤来回收ABTS-SiO2纳米粒子，进而实现SiO2纳米粒子固定化的ABTS漆酶介体循环使用。
本发明为解决上述技术问题采用如下技术方案，一种漆酶介体ABTS-SiO2纳米粒子的制备方法，其特征在于包括以下步骤：（1）将ABTS溶于无水甲醇中，再加入叔丁醇钾，超声分散均匀后搅拌反应1-3h，过滤后用无水甲醇洗涤多次，然后干燥除去甲醇，得到灰白色的2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二钾盐；（2）将三苯基磷溶于无水乙腈中并在冰浴条件下滴加溴至溶液呈浅黄色，再加入三苯基磷使溶液变成无色，得到二溴三苯基膦；（3）在步骤（2）制得的二溴三苯基膦中加入步骤（1）制得的2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二钾盐，搅拌反应1-3h，得到2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酰溴)；（4）在步骤（3）的反应液中加入表面氨基化的SiO2纳米粒子和三乙胺，继续搅拌反应完全后，离心收集沉淀，所得沉淀分别用甲醇和水多次洗涤后得到漆酶介体ABTS-SiO2纳米粒子。
本发明所述的由上述制备方法制得的在SiO2纳米粒子表面共价接枝ABTS的漆酶介体ABTS-SiO2纳米粒子，其具有如下结构：
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本发明所述的由上述方法制得的漆酶介体ABTS-SiO2纳米粒子在去除水体中污染物的应用，其特征在于具体方法为：（1）取上述制得的漆酶介体ABTS-SiO2纳米粒子加入到pH=4.5的醋酸缓冲溶液中，再加入漆酶，然后加入含有污染物的水体，振荡反应至完全；（2）在步骤（1）的酶催化反应完全后，加入抗坏血酸，搅拌反应至ABTS-SiO2纳米粒子从绿色变成浅黄色，然后将反应混合液离心，倒掉上清液，随后用蒸馏水洗涤沉淀物多次，回收得到的漆酶介体ABTS-SiO2纳米粒子进一步重复使用。
进一步限定，所述的污染物为染料、三氯苯酚或苯酚。
本发明将ABTS修饰到SiO2纳米粒子后，像液体介体分子一样可以有效地作为漆酶的介体使用，便于回收重复使用，能够循环再生，可以大大降低漆酶-介体系统的使用成本，减少使用后废弃的介体对环境的二次污染。
经试验表明，本发明能够高效地制备出漆酶介体ABTS-SiO2纳米粒子，使用漆酶介体ABTS-SiO2纳米粒子和漆酶混合物来去除有机染料靛胭脂（Acid Blue 74，AB）溶液的测试结果表明，漆酶介体ABTS-SiO2纳米粒子可以有效地作为漆酶介体使用，能完成对AB的催化降解作用，同时使用后的漆酶介体ABTS-SiO2纳米粒子能再生重复使用。从理论上可以预测，漆酶介体ABTS-SiO2纳米粒子可作为多种氧化酶的介体而广泛的应用于污染物降解、造纸工业、木质素降解及有机合成等环境治理和能源与化学等相关领域。
附图说明
图1是本发明实施例1制得的漆酶介体ABTS-SiO2纳米粒子的扫描电镜图，图2是本发明实施例1制得的漆酶介体ABTS-SiO2纳米粒子的红外光谱图，图3是本发明实施例1制得的ABTS-SiO2纳米粒子作为漆酶介体对靛胭脂去除效果和重复使用变化图。
具体实施方式
以下通过实施例对本发明的上述内容做进一步详细说明，但不应该将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例，凡基于本发明上述内容实现的技术均属于本发明的范围。
实施例1  漆酶介体ABTS-SiO2纳米粒子的制备
（1）称取0.548g ABTS溶于10mL无水甲醇中，再加入0.224g叔丁醇钾，超声分散处理至分散均匀，搅拌反应2h，过滤后用无水甲醇洗涤3次，然后在45℃烘箱中干燥除去甲醇，得到灰白色的2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二钾盐；
（2）称取0.524g三苯基磷溶于20mL无水乙腈中，在冰浴的条件下小心滴加约104μL溴至溶液保持浅黄色，再加入少量的三苯基磷，使溶液变成无色，得到二溴三苯基膦；
（3）在步骤（2）制得的二溴三苯基膦中加入步骤（1）制得的2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二钾盐，搅拌反应2h，得到2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酰溴)；
（4）在步骤（3）的反应液中加入400mg表面氨基化的SiO2纳米粒子（购买于南京先丰纳米材料科技有限公司）和1.0mL三乙胺，继续搅拌反应24-48h，离心收集沉淀，所得沉淀分别用甲醇和水洗涤5次，洗涤后的沉淀物分散在蒸馏水中于4℃低温保存备用。
图1是本实施例制得的漆酶介体ABTS-SiO2纳米粒子的扫描电镜图，由图可知，所得到的纳米粒子粒径在30-50纳米左右。
图2是本实施例制得的漆酶介体ABTS-SiO2纳米粒子的红外光谱图，由图可知，纳米粒子修饰前后红外光谱明显发生变化，表明纳米粒子表面基团发生改变。
实施例2   ABTS-SiO2纳米粒子作为漆酶介体的再生使用
（1）取漆酶介体ABTS-SiO2纳米粒子40mg加入到2mL的pH=4.5的醋酸缓冲溶液中，再加入2.0U的漆酶，振荡反应至完全，至漆酶介体ABTS-SiO2纳米粒子变绿；
（2）在步骤（1）的酶催化反应完全后的混合液中，加入摩尔浓度为0.2mol/L抗坏血酸30uL，搅拌反应至漆酶介体ABTS-SiO2纳米粒子从绿色变成浅黄色，然后将反应混合液离心，倒掉上清液，随后蒸馏水洗涤沉淀物5次，回收得到的漆酶介体ABTS-SiO2纳米粒子进一步重复使用。
实施例3  ABTS-SiO2纳米粒子作为漆酶介体对染料的去除应用
（1）取漆酶介体ABTS-SiO2纳米粒子40mg，加入到2mL的pH=4.5的醋酸缓冲液中，再加入0.5U的漆酶，然后加入0.04mg染料靛胭脂，振荡反应至完全，蓝色溶液变成无色；
（2）在步骤（1）的酶催化反应完全后的混合液中加入摩尔浓度为0.2mol/L的抗坏血酸30uL，搅拌反应1min，将反应混合液离心，倒掉上清液，随后蒸馏水洗涤沉淀物5次，回收得到的漆酶介体ABTS-SiO2纳米粒子重复上述循环使用。其对靛胭脂去除效果和重复使用变化图见图3，由图可知循环使用4次后，仍然保持对AB有较高的去除作用效果。
使用漆酶介体ABTS-SiO2纳米粒子和漆酶混合物来去除有机染料靛胭脂溶液的测试结果表明，漆酶介体ABTS-SiO2纳米粒子可以有效地作为漆酶介体使用，能完成对有机染料靛胭脂的催化降解作用，同时使用后的漆酶介体ABTS-SiO2纳米粒子能再生重复使用。
以上实施例描述了本发明的基本原理、主要特征及优点，本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明原理的范围下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进均落入本发明保护的范围内。