OSMSH4蛋白及其编码基因在调控植物花粉育性中的应用.pdf

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1、10申请公布号CN104193810A43申请公布日20141210CN104193810A21申请号201410397435422申请日20140813C07K14/415200601C12N15/29200601C12N15/84200601C12N1/15200601C12N1/19200601C12N1/21200601A01H5/0020060171申请人中国科学院遗传与发育生物学研究所地址100101北京市朝阳区北辰西路1号院2号72发明人程祝宽张蕾唐丁李亚非沈懿杜桂杰74专利代理机构北京纪凯知识产权代理有限公司11245代理人关畅54发明名称OSMSH4蛋白及其编码基因在调控植物。

2、花粉育性中的应用57摘要本发明公开了一种OSMSH4蛋白及其编码基因在调控植物花粉育性中的应用。本发明所提供的应用具体为由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质OSMSH4蛋白或其编码基因OSMSH4基因在调控植物花粉育性中的应用。实验证明，在水稻的发育过程中，通过RNA干扰技术将水稻中OSMSH4蛋白表达水平下调，可导致水稻表现出与野生型水稻种子相比，花粉育性降低。结合采用组织特异性抑制基因表达的方法，OSMSH4基因可以用于水稻杂交种子生产和育性控制，因此本发明在水稻育种上具有重要意义，可以为增加水稻产量、提高水稻品质提供重要生物资源。51INTCL权利要求书2页说明书11页序列表9页。

3、附图4页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书2页说明书11页序列表9页附图4页10申请公布号CN104193810ACN104193810A1/2页21由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质或其编码基因在调控植物花粉育性中的应用。2由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质或其编码基因在选育花粉育性降低的植物品种中的应用。3培育花粉育性降低的转基因植物的方法，包括如下步骤A在目的植物中对由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的编码基因进行抑制表达，得到转基因植物；B从步骤A所得转基因植物中得到与所述目的植物相比，花粉育性降低的转基因植物。4根据权利要求13中。

4、任一所述的应用或方法，其特征在于所述由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的编码基因是如下1至4中任一所述的DNA分子1序列表中序列2的第1372533位所示的DNA分子；2序列表中序列2所示的DNA分子3在严格条件下与1或2所限定的DNA分子杂交且编码由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的DNA分子；4与1或2或3所限定的DNA分子具有90以上同源性且编码由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的DNA分子。5根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于所述在目的植物中对由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的编码基因进行抑制表达，是通过将如下式I所示的DNA片段转入所述。

5、目的植物中实现的SEQ反向XSEQ正向I所述SEQ正向是序列表中序列3的第6661079位核苷酸；所述SEQ反向的序列与所述SEQ正向的序列反向互补；所述X是所述SEQ正向与所述SEQ反向之间的间隔序列，在序列上，所述X与所述SEQ正向及所述SEQ反向均不互补。6根据权利要求5所述的方法，其特征在于所述式I所示的DNA片段的核苷酸序列为序列表中的序列3的第191079位。7根据权利要求36中任一所述的方法，其特征在于所述式I所示的DNA片段是通过RNA干扰表达载体的形式转入所述目的植物中的；所述RNA干扰表达载体上启动所述式I所示的DNA片段转录的启动子是ACTIN启动子。8根据权利要求17中。

6、任一所述的应用或方法，其特征在于所述植物为单子叶植物或双子叶植物。9如下式I所示的DNA片段SEQ反向XSEQ正向I所述SEQ正向是序列表中序列3的第6661079位核苷酸；所述SEQ反向的序列与所述SEQ正向的序列反向互补；所述X是所述SEQ正向与所述SEQ反向之间的间隔序列，在序列上，所述X与所述SEQ正向及所述SEQ反向均不互补；所述DNA片段的核苷酸序列具体为序列表中的序列3的第191079位。权利要求书CN104193810A2/2页310含有权利要求9所述DNA片段的重组载体、重组菌、表达盒或转基因细胞系。权利要求书CN104193810A1/11页4OSMSH4蛋白及其编码基因在。

7、调控植物花粉育性中的应用技术领域0001本发明属于植物分子生物学技术领域，涉及一种水稻OSMSH4蛋白及其编码基因在调控水稻花粉育性中的应用。背景技术0002水稻是人类最重要的粮食作物之一，世界上近一半的人口，包括东亚和东南亚的绝大部分人口，都以大米为食。水稻更是我国的第一大粮食作物，因此如何提高水稻的产量是我国农业生产上的关键问题。从二十世纪六十年代开始，随着半矮品种的推广，水稻和小麦的产量得到了突破性的增长。在推广绿色革命的11个国家中，水稻单产80年代末比70年代初提高了63。因此，这次矮化育种被称为近代谷物生产的一次“绿色革命”。在我国，二十世纪七十年代由袁隆平研究出的三系法杂交水稻也。

8、是“绿色革命”杰出代表。杂交水稻的推广极大的提高了水稻的单产，缓解了我国人口迅速增长与粮食短缺的矛盾。三系法杂交水稻中的三系是指雄性不育系，保持系和恢复系。水稻雄性不育系是杂交水稻制种的关键，不育系水稻雌蕊发育正常，但本身没有花粉或者花粉败育，即不能正常的自交结实。将恢复系的花粉授给不育系植株即可生产出杂交种子。杂交种后代雄蕊育性恢复正常，可以自交结实。选育出有增产优势或品质优良的杂交种即可用于大规模生产。保持系水稻雌雄蕊都正常，用它的花粉给不育系授粉，最终仍然得到雄性不育的植株，从而保证了不育系的繁殖。0003虽然，雄性不育系的利用在杂交水稻的制备和选育过程中起到了至关重要的作用，但是自然界。

9、里的自发雄性不育植株极少，鉴定困难，需耗费大量人力物力。因此，通过基因工程途径获得雄性不育水稻成为一个上好的选择。水稻花粉形成的过程也就是雄配子体的发生过程。植物雄配子体花粉的形成包括小孢子的发生和雄配子的形成两个过程。小孢子的发生这一过程都在幼小的花药中进行，包括小孢子母细胞的形成，减数分裂过程以及四分体的分散过程。雄配子体即花粉粒是小孢子经过两次有丝分裂形成的，其中包含被称作雄配子的精细胞。在花粉发育的这一系列过程中涉及到众多相关基因，只有他们按照一定的时空顺序正常表达，才能保证可育花粉的形成。0004通常生物的生活周期由二倍体时期与单倍体时期的交替组成。二倍体细胞经由减数分裂进程形成染色。

10、体数目减半的单倍体细胞即雌雄配子或卵细胞和精子；而单倍体的细胞通过受精作用，也就是核融合形成新的二倍体细胞。减数分裂在整个生活周期中起着至关重要的作用，使每种生物代代都能够保持二倍体的染色体数目。在减数分裂过程中，同源染色体间通过重组发生部分交换产生交叉，结果使配子的遗传基础多样化，使后代对环境条件的变化有更大的适应性，促进了生物物种的进化。早在19世纪，生物学家们根据对不同生物的研究提出了一系列重要成果。孟德尔通过对豌豆的观察，提出了遗传学的两个基本定律分离定律和自由组合定律。而摩尔根则是以果蝇为模式生物阐明了遗传学的第三大定律连锁交换定律。在这些发现中，模式生物都起到了重要作用。水稻不但是。

11、重要的粮食作物，也是单子叶植物研究中的模式生物。近些年来，科学家以水稻为研究对象对减数说明书CN104193810A2/11页5分裂过程进行了研究，获得了许多控制减数分裂的基因。发明内容0005本发明的目的是提供一种水稻OSMSH4蛋白及其编码基因在调控水稻花粉育性中的应用。0006本发明所提供的应用，具体为由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质命名为OSMSH4蛋白或其编码基因命名为OSMSH4基因在调控植物花粉育性中的应用。0007由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质OSMSH4蛋白或其编码基因OSMSH4基因在培育花粉育性降低的植物品种中的应用也属于本发明的保护范围。000。

12、8本发明的再一个目的是提供一种培育花粉育性降低的转基因植物的方法。0009本发明所提供的培育花粉育性降低的转基因植物的方法，具体可包括如下步骤0010A在目的植物中对由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的编码基因进行抑制表达，得到转基因植物；0011B从步骤A所得转基因植物中得到与所述目的植物相比，花粉育性降低的转基因植物。0012在本发明中，所述花粉育性的降低，除了花粉形态学外，还体现为减数分裂过程中所形成的交叉的数目越少。0013在上述应用或方法中，所述由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质OSMSH4蛋白的编码基因OSMSH4基因是如下1至4中任一所述的DNA分子00141。

13、序列表中序列2的第1372533位所示的DNA分子；00152序列表中序列2所示的DNA分子；00163在严格条件下与1或2所限定的DNA分子杂交且编码由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的DNA分子；00174与1或2或3所限定的DNA分子具有90以上同源性且编码由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的DNA分子。0018上述严格条件可为用6SSC，05SDS的溶液，在65下杂交，然后用2SSC，01SDS和1SSC，01SDS各洗膜一次。0019其中，序列2由2853个核苷酸组成，其中第1372533位为所述OSMSH4基因的编码序列ORF；序列2的ORF编码序列表中序列1所。

14、示的蛋白质，序列1由798个氨基酸残基组成。0020在上述方法中，所述在目的植物中对由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的编码基因进行抑制表达，可为任何可降低所述目的植物中所述OSMSH4基因的表达的方法。0021在本发明中，所述在目的植物中对由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的编码基因进行抑制表达，具体是通过将如下式I所示的DNA片段转入所述目的植物中实现的0022SEQ反向XSEQ正向I0023所述SEQ正向是序列表中序列3的第6661079位核苷酸；说明书CN104193810A3/11页60024所述SEQ反向的序列与所述SEQ正向的序列反向互补；0025所述X是所述。

15、SEQ正向与所述SEQ反向之间的间隔序列，在序列上，所述X与所述SEQ正向及所述SEQ反向均不互补。0026在本发明中，所述式I所示的DNA片段的核苷酸序列具体为序列表中的序列3的第191079位。0027序列3由1097个核苷酸组成。其中，第6661079位为所述OSMSH4基因的一个片段的正向序列对应上述式I中的SEQ正向，与序列表中序列2的第6981111位一致，第433665位第450648位为GA20内含子核苷酸序列对应上述式I中的X，第19432位为所述OSMSH4基因的一个片段的反向序列对应上述式I中的SEQ反向，为序列表中序列2的第6981111位的反向互补序列。0028进一步。

16、，所述式I所示的DNA片段是通过RNA干扰表达载体的形式转入所述目的植物中的；所述RNA干扰表达载体上启动所述式I所示的DNA片段转录的启动子是ACTIN启动子。具体的，所述RNA干扰表达载体为在PCAMBIA2300ACTIN载体的多克隆位点处插入所述OSMSH4基因的RNA干扰序列序列3后得到的重组质粒；更为具体的，所述RNA干扰表达载体是按照包括如下步骤的方法制备得到的用PSTI酶切序列表中序列3所示的DNA片段，胶回收后与经过PSTI酶切的PCAMBIA2300ACTIN载体骨架大片段相连，得到所述RNA干扰表达载体。0029在上述培育转基因植物的方法中，将携带有所述OSMSH4基因的。

17、所述重组表达载体或所述OSMSH4基因的所述RNA干扰表达载体导入所述目的植物，具体可为通过使用TI质粒、RI质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。0030在上述各应用或各方法中，所述植物即可为单子叶植物，也可为双子叶植物。在本发明中，所述植物具体为单子叶植物水稻，如粳稻品种盐稻8号。0031如下式I所示的DNA片段也属于本发明的保护范围0032SEQ反向XSEQ正向I0033所述SEQ正向是序列表中序列3的第6661079位核苷酸；0034所述SEQ反向的序列与所述SEQ正向的序列反向互补；0035所述。

18、X是所述SEQ正向与所述SEQ反向之间的间隔序列，在序列上，所述X与所述SEQ正向及所述SEQ反向均不互补；0036所述DNA片段的核苷酸序列具体为序列表中的序列3的第191079位。0037含有所述DNA片段的重组载体、重组菌、表达盒或转基因细胞系也属于本发明的保护范围。0038所述重组载体既可以为重组表达载体，也可以为重组克隆载体。在本发明的一个实施例中，所述重组表达载体中启动所述RNA干扰序列转录的启动子为ACTIN启动子，具体的，所述重组表达载体为在PCAMBIA2300ACTIN载体的多克隆位点处插入所述OSMSH4基因的RNA干扰序列序列3后得到的重组质粒；更为具体的，所述RNA干。

19、扰表达载体为在PCAMBIA2300ACTIN载体的多克隆位点处插入所述OSMSH4基因的RNA干扰序列序列3后得到的重组质粒；更为具体的，所述重组表达载体是按照包括如下步骤的方法制备得到的用PSTI酶切序列表中序列3所示的DNA片段，胶回收后与经过PSTI酶切的说明书CN104193810A4/11页7PCAMBIA2300ACTIN载体骨架大片段相连，得到所述RNA干扰表达载体。0039实验证明，在水稻的发育过程中，通过RNA干扰技术将水稻中OSMSH4基因的表达水平下调，可导致水稻表现出与野生型水稻种子相比，花粉育性降低。结合采用组织特异性抑制基因表达的方法，OSMSH4基因可以用于水稻。

20、杂交种子生产和育性控制，因此本发明在水稻育种上具有重要意义，可以为增加水稻产量、提高水稻品质提供重要生物资源。附图说明0040图1为突变体OSMSH4表型分析。其中，A为抽穗期的野生型植株左和抽穗期的OSMSH4植株右；B为野生型的穗子左和突变体的穗子右；C为野生型花粉；D为突变体的不育花粉。标尺长度，C和D中50M。0041图2为OSMSH4基因结构图。0042图3为OSMSH4基因的组织特异性表达分析。0043图4为野生型中籼3037的减数分裂时期表型。其中，A为粗线期；B为终变期；C为中期I；D为后期I。标尺长度，5M。0044图5为突变体OSMSH4的减数分裂时期表型。其中，A为粗线期。

21、；B为终变期；C为中期I，无二价体；D为中期I，2个二价体；E为中期I，3个二价体；F为后期I。标尺长度，5M。0045图6为野生型和突变体OSMSH4交叉数目统计。其中，A为野生型中期I时交叉数目；B为突变体OSMSH4中期I时交叉数目。0046图7为OSMSH4基因RNAI水稻植株的PCR鉴定结果。其中，泳道M为DNA分子量标注，各条带由大到小依次为5000BP、3000BP、2000BP、1000BP、750BP、500BP、250BP、100BP；其余条带为供试植株，扩增出588BP目的条带的株系为阳性株系。0047图8为OSMSH4基因RNAI水稻植株的荧光定量PCR鉴定结果。004。

22、8图9为野生型和OSMSH4基因RNAI水稻植株的花粉育性表型鉴定结果。0049图10为突变体OSMSH4与OSMSH4基因RNAI水稻中期I的染色体表型。其中，A为突变体OSMSH4中期I；B为OSMSH4基因RNAI水稻中期I。具体实施方式0050下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。0051下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。0052PUCCRNAI载体参见“HENGXIUYU，MOWANG，DINGTANGETALOSSPO111ISESSENTIALFORBOTHHOMOLOGOUSCHROMOSOMEPAIRINGANDCROSSOV。

23、ERFORMATIONINRICECHROMOSOMA2010119625636”一文，公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得。0053PCAMBIA2300ACTIN载体参见“HENGXIUYU，MOWANG，DINGTANGETALOSSPO111ISESSENTIALFORBOTHHOMOLOGOUSCHROMOSOMEPAIRINGANDCROSSOVERFORMATIONINRICECHROMOSOMA2010119625636”一文，公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得。0054PMD18T载体北京华奥正生科技有限公司产品，其产品目录号为6011。说明书CN10419。

24、3810A5/11页80055水稻品种中籼3037记载于“WANG,K,TANG,D,HONG,L,XU,W,HUANG,J,LI,M,GU,M,XUE,YANDCHENG,Z2010DEPANDAFOREGULATEREPRODUCTIVEHABITINRICEPLOSGENETICS,6”一文中的“ZHONGXIAN3037”，公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得。0056粳稻品种盐稻8号常规的水稻栽培品种，可以从江苏省盐城市明天种业科技有限公司购买。0057水稻品种日本晴中国农科院作物科学研究所水稻种质资源中心保藏，库编号I1A13071。0058实施例1、OSMSH4基因的图位。

25、克隆及其组织特异性表达分析0059一、突变体表型分析0060本发明的发明人在60CO辐射诱导后的水稻品种中籼3037中发现一株不育突变体，与野生型的中籼3037植株相比，突变体在营养生长及开花时间等方面均无明显差异图1中A。抽穗以后突变体才表现出典型的不育表型且最终不结实图1中B。野生型植株的成熟花药为黄色，花药中充满花粉，花粉用I2KI染色可变为蓝色，而突变体的成熟花药表现为白色，花粉用I2KI染色不会变蓝，且呈现典型不育花粉特征图1中C和D。本发明的发明人将突变体授予野生型的花粉，发现它仍然不能正常结实，表明突变体雌性也不育，说明该基因的突变不仅影响雄育性，还影响雌育性。0061二、突变性。

26、状的遗传分析0062为了研究该不育突变的遗传行为，本发明的发明人在分离出不育突变体的株系中，按单株收获可育植株的种子，并将这些种子按单株进行种植。对再次分离出不育突变体的株系中的可育株与不育株的数目进行统计后发现，在98株的株系群体中，正常表型株为73株，不育株为25株，卡方测验表明分离比符合31的分离2022；P005，说明不育表型是由隐性单基因控制的。0063三、突变基因的图位克隆0064为了克隆这个控制不育表型的基因，本发明的发明人采取了图位克隆的方法。由于这个突变体是雌雄均不育的，所以选取了分离株系中的6株正常植株理论上包含AA和AA与粳稻品种中花11进行杂交，在F2和F3群体中，共获。

27、得732株不育株以用于图位克隆。利用已有的STS标记，将该基因初步定位在7号染色体的长臂上。通过比较粳稻与籼稻的序列差异，本发明的发明人在此范围内又发展了STS分子标记表1，最终将基因定位在两个STS分子标记P4和P5之间的110KB范围内。利用RGP网站HTTP/RGPDNAAFFRCGOJP上的RICEGAASRICEGENOMEAUTOMATEDANNOTATIONSYSTEM系统进行基因预测，最终在这个范围内发现一个预测为含有MUTS家族结构域IV的蛋白。将相应的候选基因命名为OSMSH4，该突变体命名为OSMSH4。水稻基因组注解数据库RICEGAAS信息表明，该基因的全基因组长99。

28、95BP，含有24个外显子和23个内含子图2。本发明的发明人对突变体和野生型中的该候选基因OSMSH4基因的全长CDNA都进行了扩增并测序，结果发现野生型中的OSMSH4基因的全长CDNA的序列如序列表中序列2所示编码序列表中序列1所示的OSMSH4蛋白，而在突变体中发现一个G到A的转换序列2的第708位的G突变为了A，导致编码色氨酸TRP的TGG被终止密码子TAG替换，使该蛋白的翻译提前终止。因此，可以推断可能是功能蛋白的缺失导致了突变体不育的表型。说明书CN104193810A6/11页90065表1图位克隆使用的STS引物0066正向引物反向引物P15TGCCCTACACTGGAGAAT。

29、35CAGCCACAGTACATAACA3P25GGCTCGATCTCATTCTATAT35ACGTACCAAATGTAAAGTGT3P35AGCAGTACTAAAGTTCAGC35GACTTACCAAAGTGGCTCA3P45AGGTACTGATTCTCATGCTCG35CAACATTGGCACAATCAAGG3P55CTCCCTCTCGACGACTTGA35TACCAGCAGATTCAGGATT3P65CCAGCACTACCATAAAACA35CTGGTGCTAGGTAATGATG3P75AAATATCTGATCCCAGTG35AAATATCTGATCCCAGTG30067四、全长CDNA。

30、的获得0068根据已知的信息设计基因特异的引物进行5RACE和3RACERAPIDAMPLICATIONOFCDNAENDS以获得全长的CDNA信息。00695RACE采用BDSMARTRACECDNAAMPLICATIONKITCLONTECH，以高质量的水稻品种日本晴的5CM稻穗RNA为模板，进行第一条CDNA链的合成。之后用基因特定引物OUTERPRIMER与试剂盒中给予的通用接头引物5PCRPRIMERIIA试剂盒中自带结合进行第一轮扩增反应。第二轮扩增反应使用另一个基因特定引物INNERPRIMER与通用接头引物5PCRPRIMERIIA结合，将第一轮扩增产物稀释十倍用作扩增的模板。。

31、将两次PCR的产物一起进行琼脂糖凝胶电泳，比较两次PCR产物的带型，切下可能的目的片段，进行胶回收后克隆至PMD18T载体然后进行测序。00703RACE用3RACEOLIGODT引物反转录第一链CDNA后，用引物3RACEOUTERPRIMER和3RACE接头引物ADAPTORPRIMER进行第一轮扩增，再用3RACEINNERPRIMER和3RACE接头引物ADAPTORPRIMER进行第二轮扩增。扩增产物回收后连接到PMD18T载体上，然后进行测序。00713RACE引物0072OUTERPRIMER5GTTGCTCGTAGATCTTTCTGT3；0073INNERPRIMER5ACTT。

32、CACGGATCACAGAACA3；0074ADAPTORPRIMER5CTGATCTAGAGGTACCGGATCC3。00755RACE引物0076OUTERPRIMER5CTGATAAATGTTGCGAAG3；0077INNERPRIMER5CTAGTTGAGTCAATGTTCA3。0078将5RACE产物测序结果与3RACE产物的测序结果进行序列拼接，得到OSMSH4基因的全长CDNA，全长2853BP序列2，其中ORF全长2397BP序列2的第1372533位。编码序列表中序列1所示是OSMSH4蛋白，由798个氨基酸组成。说明书CN104193810A7/11页100079为了进一步。

33、验证上述拼接所得OSMSH4基因的全长CDNA序列序列2的准确性，本发明的发明人进一步根据序列2设计引物RTF和RTR。采用这对引物，以水稻品种日本晴的总RNA反转录所得CDNA为模板进行PCR扩增。并对PCR产物进行序列测定。结果显示，PCR产物的序列正为序列表中序列2所示。从而证实了以上拼接序列的准确性。0080CDNA扩增引物0081RTF5AGGGCCAAGATGCCAAGCTTG3序列2的第121位；0082RTR5TGCTTAGCTCTAAATTTGAG3序列2的第28342853位的反向互补序列。0083五、OSMSH4基因的组织特异性表达分析0084为了研究OSMSH4基因在水。

34、稻不同部位的表达情况，本发明的发明人采用荧光定量PCR检测了OSMSH4基因在野生型水稻中籼3037植株的根、茎、叶、幼穗5CM中的表达。0085QRTPCR采用SYBRGREENIINVITROGEN嵌合荧光法进行，PCR扩增反应及数据处理使用BIORADCFX96REALTIMEPCRDETECTIONSYSTEM完成。利用HOTSTARTTAQ聚合酶TAKARA。运行程序如下9520SEC、5820SEC、7220SEC，76和82分别读板一次。每个样品重复3次。UBIQUITIN基因作为内参。0086QRTPCR引物0087QRTF5ATCACAATACGAAGACACT3序列2的第2。

35、91309位；0088QRTR5CTAGTTGAGTCAATGTTCA3序列2的第645663位的反向互补序列。0089UBIF5CAAGATGATCTGCCGCAAATGC3；0090UBIR5TTTAACCAGTCCATGAACCCG3。0091结果显示，OSMSH4基因在所有组织中都有表达，但在幼穗中表达量最高图3。0092实施例2、OSMSH4突变体细胞学表型分析0093一、野生型中的细胞学表型分析0094在野生型水稻中籼3037的花粉母细胞中，细线期时，染色体呈现很细并相互缠绕的线状。在偶线期时，同源染色体开始配对和联会。在粗线期时，联会复合体已经组装完成，覆盖在全部的同源染色体上，。

36、并且在这个时期，交叉也开始出现图4中A。到终变期末期时，染色体极度浓缩成点状，并且可以清晰的看到12个呈环状或者棒状的二价体图4中B。中期I时，12个二价体整齐得排列在赤道板上图4中C。后期I时，同源染色体相互分离，在纺锤丝的牵引下，分别向细胞两极移动图4中D，最终形成两个子细胞。减数第二次分裂与有丝分裂相似，每条染色体的两个姊妹染色单体相互分离，在纺锤丝牵引下移向细胞两极，最终产生染色体数目减半的四分体。0095二、突变体中的细胞学分析0096在突变体OSMSH4中，从细线期到粗线期，染色体行为与野生型中的一样，同源染色体也能识别、配对和联会图5中A。但在终变期，可以清晰地看到数目不等的单价。

37、体的出现，点状染色体的数目远远超出野生型中的12个二价体图5中B。在中期I图5中C、D、E，突变体中的二价体与野生型相比急剧减少，而单价体则随机地分布在整个细胞核中。在后期I图5中F，由于突变体中单价体无法被两极纺锤丝正确牵引，在细胞中只能发生随机分离图5中C、D、E，从而导致移向两极的染色体在数量上不均衡图5中F，这种不均衡最终必然使随后形成的小孢子内染色体组的紊乱，导致花粉败育。说明书CN104193810A108/11页110097突变体中二价体数目的减少，单价体的增多，也就意味着在二价体之间形成的交叉的数目的减少。在以往的研究中，通常通过研究中期I时二价体的形状来统计细胞的交叉数目，呈。

38、现棒状二价体被认为是含有一个交叉，而呈现梭状的二价体则是含有两个交叉SANCHEZMORAN,E,ARMSTRONG,SJ,SANTOS,JL,FRANKLIN,FC,ANDJONES,GH2001CHIASMAFORMATIONINARABIDOPSISTHALIANAACCESSIONWASSILESKIJAANDINTWOMEIOTICMUTANTSCHROMOSOMERESEARCH9,121128。本发明的发明人根据这个准则对野生型和突变体中的交叉数目进行了统计。在对47个处于中期I的野生型花粉母细胞进行统计发现，野生型花粉母细胞中含有12个二价体和2038168个交叉图6中A。相应。

39、的，在204个突变体的花粉母细胞中，二价体的数目仅为165103，而交叉的数目也只有171125图6中B。在联会复合体解体后，同源染色体之间通常仅通过着丝粒和交叉相连接，交叉的存在保证了同源染色体在后期I的精确分离LI,W,ANDMA,H2006DOUBLESTRANDEDDNABREAKSANDGENEFUNCTIONSINRECOMBINATIONANDMEIOSISCELLRESEARCH16,402412和ZICKLER,D,ANDKLECKNER,N1999MEIOTICCHROMOSOMESINTEGRATINGSTRUCTUREANDFUNCTIONANNUREVGENET33,。

40、603754。因此交叉的减少，使同源染色体失去连接而相互分离形成单价体，导致子细胞中染色体数目的不均等，形成非整倍体或者导致细胞核不发生分裂HIGGINS,JD,ARMSTRONG,SJ,FRANKLIN,FC,ANDJONES,GH2004THEARABIDOPSISMUTSHOMOLOGATMSH4FUNCTIONSATANEARLYSTEPINRECOMBINATIONEVIDENCEFORTWOCLASSESOFRECOMBINATIONINARABIDOPSISGENESDEV18,25572570，最终导致了花粉的败育。0098实施例3、OSMSH4基因RNAI水稻植株的获得及功能。

41、鉴定0099为了进一步确认OSMSH4基因的突变是造成突变体不育的原因，本发明的发明人对OSMSH4进行了RNA干扰以降低或完全消除其表达，并进一步观察RNAI植株的表型是否与突变体OSMSH4表型一致。0100一、RNAI表达载体的构建0101根据序列表中序列2设计如下RNAI引物序列0102OSMSH4RNAIF5ACTGAACTGTGGGGAACTA3序列2的第698716位；0103OSMSH4RNAIR5CTGATAAATGTTGCGAAGA3序列2的第10931111位的反向互补。0104以从水稻品种日本晴的5CM小穗中提取的总RNA反转录获得的CDNA为模板，用引物OSMSH4R。

42、NAIF和OSMSH4RNAIR进行PCR扩增。将所得PCR产物回收并克隆至PMD18T载体得到重组质粒。将经测序表明在PMD18T载体中正向连入序列表中序列2所示DNA片段的重组质粒命名为PMD18OSMSH4。采用BAMH和SAL双酶切PMD18OSMSH4，回收大小约为420BP的目的片段；将回收的片段与用BAMH和SAL酶切过的PUCCRNAI载体骨架大片段相连，构建成中间载体PUCCRNAIOSMSH41。采用BAMH和SAL双酶切PMD18OSMSH4，回收大小约为420BP的目的片段；将回收的片段与用XHO与SAL为同尾酶和BGL与BAMH为同尾酶双酶切过的中间载体PUCCRNA。

43、IOSMSH41的骨架大片段相连，构建成中间载体PUCCRNAIOSMSH42，此载体含有已构建好的发卡结构。用PST单酶切PUCCRNAIOSMSH42，回收最终的发卡结构片段大小约为1040BP，与用PST酶切过的转化载体PCAMBIA2300ACTIN相连接，构建成RNAI转化载体。说明书CN104193810A119/11页120105将经测序表明在PCAMBIA2300ACTIN载体的酶切位点PST处插入序列表中序列3所示的DNA片段的重组质粒命名为PCAMBIA23AOSMSH4。在RNAI表达载体PCAMBIA23AOSMSH4中，启动序列表中序列3所示的DNA片段转录的启动子为。

44、ACTIN启动子。其中，序列3由1097个核苷酸组成。其中，第6661079位为所述OSMSH4基因的一个片段的正向序列与序列表中序列2的第6981111位一致，第450648位为来自于PUCCRNAI载体上的GA20内含子INTRON核苷酸序列，第19432位为所述OSMSH4基因的一个片段的反向序列为序列表中序列2的第6981111位的反向互补序列。正向序列和反向序列之间由一段内含子INTRON序列隔开以维持载体的稳定性；该系统在植物细胞中转录产生带发夹结构HAIRPIN的DSRNA，引发RNAI，从而抑制目的基因的表达。0106二、OSMSH4基因RNAI水稻植株的获得及鉴定01071、。

45、OSMSH4基因RNAI水稻植株的获得0108将步骤一构建好的RNAI表达载体PCAMBIA23AOSMSH4通过农杆菌介导的遗传转化方法转入到粳稻品种盐稻8号中。0109具体如下0110采用电击的方法将RNAI表达载体PCAMBIA23AOSMSH4转入农杆菌AGROBACTERIUMTUMEFACIENS株系EHA105北京亚平宁生物中。将粳稻品种盐稻8号的幼胚经灭菌后切出，然后接种到诱导愈伤组织的培养基中。大约培养1周，挑选颜色浅黄、生长旺盛且比较松散的胚性愈伤组织，作为转化的受体。用含有PCAMBIA23AOSMSH4质粒的EHA105菌株侵染水稻愈伤组织，在黑暗处25培养3天后，在含。

46、有100MG/LG418的选择培养基上筛选抗性愈伤组织和转基因植株。将G418抗性植株T0代在培养箱中练苗，7天后移栽到水田。0111采用同样的方法将PCAMBIA2300ACTIN空载体转入粳稻品种盐稻8号。01122、OSMSH4基因RNAI水稻植株的PCR鉴定0113从步骤1获得的T0代转入RNAI表达载体PCAMBIA23AOSMSH4的转基因水稻，以及转入PCAMBIA2300ACTIN空载体的对照植株中分别提取基因组DNA。对于转入RNAI表达载体PCAMBIA23AOSMSH4的转基因水稻，以引物23AF和引物23AR进行PCR扩增，经鉴定得到大小约为588BP目的条带的植株即为。

47、转入RNAI表达载体PCAMBIA23AOSMSH4的阳性植株。同样，对于转入PCAMBIA2300ACTIN空载体的对照植株，也用引物23AF和引物23AR进行PCR扩增，经鉴定得到大小约为588BP目的条带的植株即为转入PCAMBIA2300ACTIN空载体的阳性植株。011423AF5CCTTATCTGGGAACTACTCA3；011523AR5ATCTCCTGTCATCTCACCTT3。0116部分步骤1获得的T0代转入RNAI表达载体PCAMBIA23AOSMSH4的转基因水稻的鉴定结果如图7所示。经过上述PCR鉴定，最终获得11株PCR鉴定阳性的T0代转入RNAI表达载体PCAMB。

48、IA23AOSMSH4的转基因水稻植株。01173、OSMSH4基因RNAI水稻植株的荧光定量PCR鉴定0118取步骤2鉴定阳性的T0代转入RNAI表达载体PCAMBIA23AOSMSH4的转基因水稻、转入PCAMBIA2300ACTIN空载体的对照植株、未转基因的野生型粳稻品种盐稻8号，以及实施例1获得的突变体OSMSH4植株，分别从幼穗中提取总RNA，反转录获得CDNA，以该说明书CN104193810A1210/11页13CDNA为模板，用引物QRTF和QRTR对OSMSH4基因的CDNA进行实时荧光定量PCR扩增，以UBIQUITIN为内参，引物为UBIF和UBIR。0119QRTF5。

49、ATCACAATACGAAGACACT3序列2的第291309位；0120QRTR5CTAGTTGAGTCAATGTTCA3序列2的第645663位的反向互补序列。0121UBIF5CAAGATGATCTGCCGCAAATGC3；0122UBIR5TTTAACCAGTCCATGAACCCG3。0123QRTPCR采用SYBRGREENIINVITROGEN嵌合荧光法进行，PCR扩增反应及数据处理使用BIORADCFX96REALTIMEPCRDETECTIONSYSTEM完成。利用HOTSTARTTAQ聚合酶TAKARA。运行程序如下9520SEC、5820SEC、7220SEC，76和82分别读板一次。每个样品重复3次。UBIQUITIN基因作为内参。采用POWER2CT来计算不同样品之间的模板比例来表示不同基因的相对表达量。0124结果显示，与未转基因的野生型粳稻品种盐稻8号相比，突变体OSMSH4的幼穗中OSMSH4基因的表达量显著降低。而步骤2鉴定阳性的11个T0代转入RNAI表达载体PCAMBIA23AOSMSH4。