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1、10申请公布号CN104195103A43申请公布日20141210CN104195103A21申请号201410394740822申请日20140812C12N5/0735201001A61K31/704200601A61P39/06200601A61P35/00200601A23L1/3020060171申请人中国科学院动物研究所地址100101北京市朝阳区北辰西路1号院5号申请人中国科学院遗传与发育生物学研究所72发明人周琪王秀杰顾奇郝捷韩伟方刘鑫王磊王柳74专利代理机构北京泛华伟业知识产权代理有限公司11280代理人郭广迅54发明名称一种诱导多能干细胞的培养基及其用途57摘要本发明提供。
2、了一种培养诱导多能干细胞的培养基，所述培养基中含有人参皂苷单体RB1、人参皂苷单体RB3和/或人参皂苷单体RD。本发明还提供一种诱导多能干细胞的方法，所述方法包括以下步骤1将多能性相关基因导入供体细胞；2将已导入多能性相关基因的供体细胞制备为单细胞悬液，使用本发明的培养基培养步骤1中导入多能性相关基因的供体细胞；3鉴定诱导多能干细胞克隆。鉴于目前IPS应用于临床的瓶颈，本发明发现了人参皂苷单体RB1、人参皂苷单体RB3、人参皂苷单体RD能显著提高IPS诱导效率，并可以显著延缓细胞的衰老和促进细胞的增殖，将对整个干细胞研究及新药研发领域产生深远影响。51INTCL权利要求书2页说明书8页附图4页。
3、19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书2页说明书8页附图4页10申请公布号CN104195103ACN104195103A1/2页21一种用于培养诱导多能干细胞的培养基，其特征在于，所述培养基由常规诱导多能干细胞培养基以及人参皂苷单体RB1、人参皂苷单体RB3和/或人参皂苷单体RD组成。2根据权利要求1所述的培养基，其中，所述培养基为含有人参皂苷单体RB1、人参皂苷单体RB3和/或人参皂苷单体RD的KOSR培养基。3根据权利要求1或2所述的培养基，其中，所述培养基中人参皂苷单体RB1、人参皂苷单体RB3和/或人参皂苷单体RD的浓度为1100M，优选地，浓度为5100M，进一。
4、步优选地，浓度为25100M，更优选为5075M。4一种制备如权利要求13中任一项所述的培养基的方法，包括将人参皂苷单体RB1、人参皂苷单体RB3和/或人参皂苷单体RD溶解于微量的DMSO中得到溶液，然后将上述溶液加入到常规培养基中，使所述培养基中人参皂苷单体RB1、人参皂苷单体RB3和/或人参皂苷单体RD的浓度为1100M，优选地，浓度为5100M，进一步优选地，浓度为25100M，更优选为5075M。5一种诱导多能干细胞的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤1将多能性相关基因导入供体细胞；2将已导入多能性相关基因的供体细胞制备为单细胞悬液，使用权利要求13中任一项所述的培养基培养步骤1中。
5、导入多能性相关基因的供体细胞，得到诱导多能干细胞；优选地，所述方法还包括鉴定诱导多能干细胞的步骤。6根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤1是通过包括以下步骤的方法实现的A将供体细胞接种到含有SP的10DMEM培养液中；优选地，所述细胞的接种密度为152104/CM2；B一天后，将所述含有SP的10DMEM培养液换成不含SP的10DMEM，并使用含有多能性相关基因的病毒感染供体细胞；优选地，所述多能性相关基因为KLF4、SOX2、NANOGE和OCT4；优选地，在感染的同时，加入8G/ML聚凝胺；C诱导24小时后，弃去含有病毒的培养液，换上含有SP的10DMEM，隔天再换液一次；D感染。
6、后第六天得到感染好的供体细胞。7根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于，所述步骤2是通过包括以下步骤的方法实现的将已导入多能性相关基因的供体细胞制备为单细胞悬液，并接种到饲养层细胞上；优选地，使用胰酶将供体细胞消化成单细胞，优选地，所述胰酶的浓度为025G/100ML；优选地，供体细胞与饲养层细胞的数量比优选为1619，更优选为18；优选地，所述饲养层细胞为经丝裂霉素C处理过的无分化能力的小鼠成纤维细胞；将步骤1中接种好的细胞使用10DMEM的培养液培养12天；弃去10DMEM的培养液，使用如权利要求13中任一项所述培养基培养细胞；每隔一天更换一次培养基；权利要求书CN104195103A2。
7、/2页3培养34天后，得到诱导多能性干细胞克隆。8人参皂苷单体RB1、人参皂苷单体RB3和/或人参皂苷单体RD在制备用于防治衰老的药物组合物或者在制备用于延缓衰老的保健品或生活产品中的用途。9人参皂苷单体RB1、人参皂苷单体RB3和/或人参皂苷单体RD在制备用于促进细胞增殖的药物中的用途。权利要求书CN104195103A1/8页4一种诱导多能干细胞的培养基及其用途技术领域0001本发明属于生物技术领域，涉及人参皂苷的用途，具体涉及含有人参皂苷单体的多能干细胞培养基在提高细胞重编程效率、延缓细胞衰老、促进细胞增殖方面的用途。技术背景0002中草药为药物提供广阔的来源，在传统医学中起重要作用。一。
8、些中药对脑部发育、免疫性等有显著疗效，但具体的分子机制还不清楚，包括比如作用靶标、信号通路等。中国传统医学中，中药人参能增强记忆力，明目定神。分析发现人参含有特定活性物质人参皂苷GINSENOSIDE，GS。人参皂苷具有类似基本化学结构，大致可分类为达玛烷型和齐墩果烷型。由于对单体进行生物活性研究，易于阐明其确切的药理作用，发现活性较强的化合物，随着现代分离和分析技术的进步，人参化学成分得到了进一步的阐明，人参皂苷是人参主要的生物活性物质，现已确证人参皂苷单体约40种；根据人参皂苷的皂甙元，可以将他们分为两组人参二醇例如RG1，RB1，RE，RF，RC，RB2，RB3等和原人参三醇型例如RS3。
9、，RK1，RG5，RS4，RS5等。其中，RD、RG1已用于研究神经细胞增殖的。但是人参皂苷在正常细胞中尤其是在干细胞中固定功能和作用机制并不清楚。0003其中，现有技术表明，人参皂苷RB1在西洋参花旗参中含量最多，可影响动物睾丸的潜力，小鼠的胚胎发育等。协调胆碱系统的功能，增加乙酰胆碱合成、释放，改善记忆力。人参皂苷RB3可增强心肌功能，保护人体自身免疫系统。可以用于各种不同原因引起的心肌收缩性衰竭的治疗。人参皂苷RD可减少乙酰胆碱诱发的豚鼠离体子宫收缩。对大鼠有减慢心率和双相性血压先升后降作用。可抑制猫的行为和脑电图。此外有抗疲劳作用。00042006年，YAMANAKA等人建立了一种新的。
10、重编程技术，建立了诱导多能性干细胞INDUCEDPLURIPOTENTSTEMCELL，IPSCELL系。2007年，YAMANAKA和THOMSON研究组分别建立了人的IPS细胞系。这一重大科学进展使体细胞重编程研究具体到了基因层面，为研究和应用提供宝贵的细胞资源。由于IPS细胞来自于体细胞而非胚胎，可避免伦理争议，具有广阔的应用前景。0005细胞重编程是组织修复、器官重建和个体化的再生医疗的基石。如果能掌握细胞重编程技术，将为组织器官重建等重大科学问题扫除屏障。利用自身体细胞重编程为IPS细胞，通过体内外诱导技术获得目标组织和器官，既解决了免疫排斥问题，也解决供型不足的问题，将会成为人类医。
11、疗历史上重要里程碑。细胞重编程建立疾病模型IPS细胞系可作为疾病机制机理的研究材料，为采取相应的治疗手段提供最可靠的医学依据。肿瘤、糖尿病和神经系统疾病等疑难疾病的发生、发展受表观遗传修饰调控，相对应的，细胞重编程对基因定向编辑的研究将对这些疑难疾病的预防、治疗提供新的思路。0006在开展人类ESC、IPSC治疗疾病进程中，需要解决很多科学问题。比如高效获得非病毒非整合完全重编程IPSC，高效诱导IPSC分化为目的细胞、高效去除未分化的残留细胞，快速准确的将多能性干细胞进行胚胎干细胞与IPSC的多能性研究，确认分化获得的目说明书CN104195103A2/8页5的细胞功能、表观遗传修饰等与体内。
12、细胞完全一致性，大规模培养非动物源性XENOFREE干细胞及分化细胞等问题。目前在某些领域取得一些进展，比如WARREN等通过MRNA诱导IPSC，能高效获得非病毒非整合IPSC。但要将IPSC应用于临床治疗，还有很长一段路需要摸索。早期IPSC诱导效率仅为00105，与体细胞核移植为技术基础重编程效率存在很大差距，因此，如何提高IPSC诱导效率是IPSC研究领域的热点研究内容之一。筛选新供体细胞、添加活性小分子诱导是有效提高IPSC重编程效率方法之一,特别是候选小分子能大幅度提高IPS诱导效率，现在急需解决的问题是临床前安全性确认。0007因此，筛选安全有效的重编程活性小分子具有重要实用价值。
13、。发明内容0008如本文中所使用地，术语“IPS”与“诱导多功能干细胞”可互换地使用，二者具有相同的含义。0009本发明涉及的人参皂苷单体为人参皂苷单体RB1、人参皂苷单体RB3、人参皂苷单体RD。0010本发明的一个目的在于，提供一种诱导多能干细胞培养基，所述培养基含有RB1、人参皂苷单体RB3和/或人参皂苷单体RD，并提供了所述培养基在制备诱导多能干细胞中的用途。0011本发明的又一个目的在于，提供人参皂苷单体RB1、人参皂苷单体RB3和/或人参皂苷单体RD在制备用于防治衰老的药物组合物或者在制备用于延缓衰老的保健品或生活产品中的用途。0012本发明的目的还在于，提供人参皂苷单体RB3和/。
14、或人参皂苷单体RD在制备用于促进细胞增殖的组合物中的用途。0013本发明的目的还在于提供采用人参皂苷单体RB3和/或人参皂苷单体RD促进细胞增殖的方法。0014本发明的目的是通过以下技术方案来实现的。0015在本发明的一个方面，本发明提供了一种培养诱导多能干细胞的培养基，其特征在于，所述培养基由常规诱导多能干细胞培养基以及人参皂苷单体RB1、人参皂苷单体RB3和/或人参皂苷单体RD组成。0016优选地，所述培养基为含有人参皂苷单体RB1、人参皂苷单体RB3和/或人参皂苷单体RD的KOSR培养基。0017优选地，所述培养基中人参皂苷单体RB1、人参皂苷单体RB3和/或人参皂苷单体RD的工作浓度为。
15、1100M，优选地，浓度为5100M，进一步优选地，浓度为25100M，更优选地，浓度为5075M。优选地，在制备所述培养基时，将所述人参皂苷单体RB1、人参皂苷单体RB3和/或人参皂苷单体RD溶解于微量的DMSO中，然后添加到培养基中。0018在本发明的另一个方面，本发明提供一种诱导多能干细胞的方法，所述方法包括以下步骤00191将多能性相关基因导入供体细胞；00202将已导入多能性相关基因的供体细胞制备为单细胞悬液，使用本发明的培养基培养步骤1中导入多能性相关基因的供体细胞，得到诱导多能干细胞说明书CN104195103A3/8页60021优选地，所述方法还包括鉴定诱导多能干细胞的步骤。0。
16、022优选地，所述步骤1中通过包括以下步骤的方法实现的0023A将供体细胞接种到含有SP青链霉素双抗溶液的10DMEM培养液中；优选地，所述细胞的接种密度为152104/CM2；0024B一天后，将所述含有SP的10DMEM培养液换成不含SP的10DMEM，并使用含有多能性相关基因的病毒感染供体细胞；0025优选地，所述多能性相关基因为KLF4、SOX2、NANOGE和OCT4；0026优选地，在感染的同时，加入8G/ML聚凝胺；0027C诱导24小时后，弃去含有病毒的培养液，换上含有SP的10DMEM，隔天再换液一次；0028D感染后第六天得到感染好的供体细胞。0029优选地，所述步骤2中通。
17、过包括以下步骤的方法实现的0030将已导入多能性相关基因的供体细胞制备为单细胞悬液，并接种到饲养层细胞上；0031优选地，使用胰酶将供体细胞消化成单细胞，优选地，所述胰酶的浓度为025G/100ML；0032优选地，供体细胞与饲养层细胞的数量比优选为1619，更优选为18；0033优选地，所述饲养层细胞为经丝裂霉素C处理过的无分化能力的小鼠成纤维细胞；0034将步骤1中接种好的细胞使用10DMEM的培养液培养12天；0035弃去10DMEM的培养液，使用本发明的培养基培养细胞；0036每隔一天更换一次培养基；0037培养34天后，得到诱导多能干细胞；0038在本发明的再一个方面，本发明提供了人。
18、参皂苷单体RB1、人参皂苷单体RB3和/或人参皂苷单体RD在制备用于防治衰老的药物组合物或者在制备用于延缓衰老的保健品或生活产品中的用途。0039在本发明的再另一个方面，本发明提供了人参皂苷单体RB1、人参皂苷单体RB3和/或人参皂苷单体RD在制备用于促进细胞增殖的药物中的用途。0040本发明具有以下的意义0041鉴于目前IPS应用于临床的瓶颈，本发明发现了人参皂苷单体RB1、人参皂苷单体RB3、人参皂苷单体RD能显著提高IPS诱导效率，并可以显著延缓细胞的衰老和促进细胞的增殖，由于包括人参皂苷在内的中草药提取物通过临床实践证明安全性较高。因此，本申请的发现可以加速其在临床上的应用并开发出基于。
19、干细胞调控的药物，将对整个干细胞研究及新药研发领域产生深远影响。附图说明0042以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中0043图1显示了在IPS诱导过程中，加入不同人参皂苷单体处理后的克隆数统计结果。结果表明相对于对照组DMSO组，经RD、RB1、RB3处理后的IPSC克隆数显著增多，提示说明书CN104195103A4/8页7RD、RB1、RB3对IPS诱导有显著的促进作用，柱状图是一个统计的结果。0044图2是流式细胞仪分析的结果，对诱导第10天的MEF细胞进行OCT4GFP阳性细胞数的统计，结果表明经人参皂苷单体RD，RB3处理过的实验组中GFP阳性细胞数目远远多于对照组DMSO。
20、组，其中VC是作为阳性对照组，VC在促进细胞重编程中的作用已经被报道过。0045图3显示的是MEF细胞的细胞周期分析，HOECHST核定位，EDUS对S期细胞进行标记染色，PHH3对M期细胞进行标记染色，对不同细胞周期包括M，S和细胞总数进行了标记，以验证药物对细胞的增殖影响，结果表明人参皂苷单体RB1，RB3，RD可以部分提高细胞增殖。0046图4显示的是MEF细胞中M期细胞所占的比例，经人参皂苷单体处理后的MEF细胞处于M期的细胞比例高于对照组。0047图5显示的是MEF细胞的状态，传到第7代时状态变得不好，有很多细胞开始凋亡，如对照中所示。在培养过程中加入了人参皂苷单体的MEF却能保持很。
21、好的生长状态。0048图6为不同培养液培养的MEF细胞中衰老基因的表达情况，在加入人参皂苷培养液中生长的MEF细胞表达衰老基因明显低于对照组。当细胞传代至第七代时，正常培养液中的细胞出现明显的凋亡现象，而在加入人参皂苷单体的培养液中生长的MEF细胞状态良好，极少出现凋亡0049图7为衰老基因P21、BTG2、GADD45B的表达水平比较，在加入人参皂苷培养液中生长的MEF细胞表达衰老基因明显低于对照组DMSO，图中将对照组的基因表达水平设置为1，人参皂苷培养液中培养的细胞的衰老基因表达水平明显低于对照组。具体实施方式0050主要材料和试剂0051低温保存箱购自中国，海尔；制冰机购自中国，唯利安。
22、；液氮罐购自中国，东亚；四度离心机购自美国，BECKMAN；生物安全柜、二氧化碳培养箱和NANODROP购自美国，THERMO；体式显微镜、石蜡切片机购自德国，LEICA；细胞计数仪、纯水仪、病毒超滤离心管AMICONULTRA15CENTRIFUGALLTERUNIT购自美国，MILLIPORE；电子天平购自德国，赛多利斯；移液枪、多聚酶链式反应PCR仪购自德国，EPPENDORF；激光共聚焦显微镜购自德国，CARLZEISS；实时荧光定量PCR仪购自美国，TALENT；灭菌锅购自日本，SANYO；正置显微镜购自日本，OLYMPUS；0052电泳仪套装，GELDOCXR凝胶成像系统购自美国，。
23、BIORAD；圆形玻片COVERSLIP购自美国BELLCOGLASS。除非特别指明，本文中的试剂来源如下OPTIMEM培养液，INVITROGEN公司；KNOCKOUTTMDMEM培养液，INVITROGEN公司；KNOCKOUTTM血清KOSR，INVITROGEN公司；胎牛血清FETALBOVINESERUM，FBS，INVITROGEN公司；005及025胰蛋白酶，INVITROGEN公司；100X链霉素青霉素SP，INVITROGEN公司；二甲基亚砜DMSO，INVITROGEN公司；人参皂苷单体RD，RB1，RB3，上海智化医药科技有限公司；100X非必需氨基酸NONESSENTI。
24、ALAMINOACIDS，NEAA，INVITROGEN公司；100谷氨酰胺，INVITROGEN公司；N2SUPPLEMENT，INVITROGEN公司；B27SUPPLEMENTS，INVITROGEN公司；MERCAPTOETHANOL巯基乙醇，100M，INVITROGEN公司；100X链霉素/青霉说明书CN104195103A5/8页8素STREPTOMYCIN/PENICILLIN，SP，INVITROGEN公司；TRYPLETM，INVITROGEN公司；明胶，SIGMA公司；丝裂霉素C，SIGMA；SYBRGREENREALTIMEPCRMASTERMIXPLUS，REALTI。
25、ME试剂盒，日本TOYOBO公司；TRIZOL，INVITROGEN公司；PMXOCT4，PMXSOX2，PMXCMYC和PMXKLF4质粒，ADDGENE公司；RNAREVERSE试剂盒，INVITROGEN公司；AP试剂盒，碧云天；感受态DH5菌株，TRANSGEN公司；TRITONX100，北京索莱宝科技有限公司；多聚甲醛PFA，SIGMA；HOECHST33342，INVITROGEN。0053除非特别指明，本文中所用到的细胞，购自中国科学院动物研究所。0054除非特别指明，以下实施例中所用的试剂均为分析纯级试剂，且可从正规渠道商购获得。0055实施例1培养基的制备0056KOSR培养。
26、基为一种用于培养干细胞的常规培养基，本实施例中的KOSR培养基购自INVITROGEN公司。配方如表1所示0057表1KOSR培养基的配方00580059将人参皂苷单体RB1、人参皂苷单体RB3和人参皂苷单体RD分别溶于微量DMSO中配成一定浓储溶液，然后根据需要添加相应体积的浓储溶液到上述KOSR培养基中，使人参皂苷单体RB1、人参皂苷单体RB3和人参皂苷单体RD的浓度梯度为1M、5M、25M、50M、75M、100M。DMSO对照组即在上述KOSR培养基中加入人参皂苷单体浓储溶液等体积的DMSO；阳性对照组为含有50G/MLVC的KOSR培养基。0060实施例2小鼠IPS细胞的诱导与培养0。
27、061本申请的发明人分别制备了含有人参皂苷单体RB1、人参皂苷单体RB3和人参皂苷单体RD的培养基，所述培养基中人参皂苷的浓度分别为1M、5M、25M、50M、75M、100M。0062以下的实验步骤中，除了上述培养基不同，其余均相同。0063阴性对照为含有等体积的DMSO的KOSR培养基；阳性对照组为含有50UG/MLVC的KOSR培养基。0064使用实施例1制备的培养基诱导小鼠IPS细胞，其中还用到MEF培养液10DMEM，其配方如表1所示0065表一MEF培养液0066说明书CN104195103A6/8页90067所述方法包括以下步骤0068首先，通过以下方法将多能性相关基因KLF4、。
28、SOX2、NANOGE和OCT4导入所述供体细胞00691将供体细胞按152104/CM2的密度接种到含有SP青链霉素双抗溶液的10DMEM培养液中；00702一天后，将所述含有SP的10DMEM培养液换成不含SP的10DMEM，并使用含有多能性相关基因的病毒感染供体细胞；0071在感染的同时，加入8G/ML聚凝胺；00723诱导24小时后，弃去含有病毒的培养液，换上含有SP的10DMEM，隔天再换液一次；00734感染后第六天得到感染好的供体细胞。0074然后，使用本申请的培养基培养诱导细胞，所述培养包括以下步骤00751将已导入多能性相关基因的供体细胞携带OCT4绿色荧光蛋白报告基因的小鼠。
29、成纤维细胞OCT4GFPMEF接种到饲养层细胞上；0076其中，所述多能性相关基因为KLF4、SOX2、NANOGE和OCT4，0077使用025G/100ML的胰酶将供体细胞消化成单细胞。与饲养层细胞的数量比为18的比例接种到饲养层细胞上。00782将步骤1中接种好的细胞使用10DMEM的培养液培养12天；00793弃去10DMEM的培养液，将所述接种好的细胞均分为19份，分别添加实施例1的培养基和对照培养基DMSO，培养细胞；4每隔一天更换一次培养基；00805培养7天左右，均能得到诱导多能性干细胞克隆，并且经RD、RB1、RB3处理后的IPSC克隆数显著多余对照培养基DMSO。0081实。
30、施例3加入人参皂苷单体的培养液对IPS诱导的作用0082使用WANG，J，ETAL，GENERATIONOFINDUCEDPLURIPOTENTSTEMCELLSWITHHIGHEFFICIENCYFROMHUMANUMBILICALCORDBLOODMONONUCLEARCELLSGENOMICSPROTEOMICSBIOINFORMATICS112013304311和ZHAO，XY，ETAL，IPSCELLSPRODUCEVIABLEMICETHROUGHTETRAPLOIDCOMPLEMENTATIONNATURE，20094617260P8690所述的方法观察并鉴定诱导过程中细胞的状态。
31、，具体包括008321碱性磷酸酶AP染色法0084选择终浓度为25M人参皂苷单体培养液诱导的细胞，在第10天对培养板中的细说明书CN104195103A7/8页10胞进行固定，经过AP染色，通过对着色的克隆数进行计数来确定克隆数的多少。0085具体实施方式参见BCIP/NBT碱性磷酸酶染色试剂盒说明书。0086结果如图1所示，表明在IPS诱导过程中，加入不同人参皂苷单体处理后的克隆数统计结果。结果表明相对于对照组，经RD、RB1、RB3处理后的IPSC克隆数显著增多，提示RD、RB1、RB3对IPS诱导有显著的促进作用，柱状图是更为直观的统计结果。008722流式法检测诱导过程中OCT4GFP。
32、细胞比例0088选择终浓度为25M人参皂苷单体培养液诱导的细胞，在第10天，对MEF细胞进行OCT4GFP阳性细胞数的统计，结果如图2显示经人参皂苷单体RD，RB3处理过的实验组中GFP阳性细胞数目远远多于对照组DMSO组，其中VC是作为阳性对照组，VC在促进细胞重编程中的作用已经被报道过。0089实施例4免疫荧光染色方法检测细胞周期0090其中，细胞计数方法为0091PHH3为磷酸化组蛋白H3PHOSPHOHISTONEH3。PHH3磷酸化过程只在有丝分裂期出现，通过特定抗体染色可以检测分裂期细胞。0092EDU为胸腺嘧啶类似物，可掺入至新复制的DNA中，通过免疫荧光法对EDU标记统计S期细。
33、胞数。0093细胞总数通过HOECHST染色法统计，HOECHST33342染料透过细胞膜与双链DNA结合标记细胞。0094其中，为细胞计数所用到的方法都是通过高内涵细胞分析系统对培养皿的视野成像分析的具体模式如图3所示。0095具体实施方式00961弃去HFF细胞的培养液，加入EDU，用培养液进行稀释使EDU的终浓度为25M，37，5CO2条件下培养30MIN。00972弃去上述混合液，室温条件下用4多聚甲醛固定20MIN。00983弃去多聚甲醛，室温条件下用05TRITONX100通透5MIN。00994弃去液体，加CLICKITTM，避光，室温孵育30MIN。再用3BSA室温20MIN或。
34、4过夜进行终止。01005组蛋白染色，细胞与2G/ML的ANTIPHH3一抗室温避光孵育1H。用005TWEEN20洗三次，然后与二抗室温避光孵育1H，再用005TWEEN20洗三次。01016最后用162M的HOECHST33342室温避光染30MIN。0102结果如图4所示，处于不同时期的细胞会被不同的染料标记，通过高内涵仪器可以统计出不同时期的细胞数目。0103实施例5人参皂苷单体对细胞增殖的影响0104采用实施例4的方法，对终浓度为25M人参皂苷单体培养液诱导的细胞进行M期细胞比例的统计，结果如图5显示，加入人参皂苷单体RB1，RB3，RD后处于M期的细胞比例高于对照组，这说明人参皂苷。
35、RB1，RB3，RD可以提高M期细胞的比例，促进细胞的增殖。0105实施例6人参皂苷单体对细胞衰老的影响0106利用正常的MEF培养液与加入终浓度为25M人参皂苷单体的培养液来培养MEF说明书CN104195103A108/8页11细胞，正常传代至第七代。010761观察细胞状态0108结果如图6所示，发现当细胞传代至第七代时，正常培养液中的细胞出现明显的凋亡现象，而在加入人参皂苷单体的培养液中生长的MEF细胞状态良好，极少出现凋亡。010962QRTPCR的方法检测衰老基因的表达水平0110结果如图7所示，衰老基因P21、BTG2、GADD45B的表达水平比较，在加入人参皂苷培养液中生长的M。
36、EF细胞表达衰老基因明显低于对照组DMSO，图中将对照组的基因表达水平设置为1，人参皂苷培养液中培养的细胞的衰老基因表达水平明显低于对照组。0111本发明发现了人参皂苷单体RB1、人参皂苷单体RB3、人参皂苷单体RD能显著提高IPS诱导效率，并可以显著延缓细胞的衰老和促进细胞的增殖，由于包括人参皂苷在内的中草药提取物通过临床实践证明安全性较高。因此，本申请可以加速其在临床上的应用并开发出基于干细胞调控的药物，将对整个干细胞研究及新药研发领域产生深远影响。说明书CN104195103A111/4页12图1说明书附图CN104195103A122/4页13图2图3说明书附图CN104195103A133/4页14图4图5说明书附图CN104195103A144/4页15图6图7说明书附图CN104195103A15。