检测多菌灵的酶联免疫试剂盒及其检测方法技术领域
本发明涉及兽药残留检测技术领域，特别是检测蔬菜中多菌灵的酶联免疫试剂盒。
背景技术
多菌灵（Carbendazin），化学名称2-（甲氧基氨基甲酰）苯并咪唑[2-（methoxy-carbanmoyl）-benzimidaxole]，是一种高效低毒杀菌剂，可用于防治多种植物病害。多菌灵是蔬菜栽培过程中常用的一种农药，我国蔬菜产品出口量很大，农药残留是一个很重要的限制指标。因此定期对多菌灵残留进行检测成为许多国家的监控的必要手段。欧盟规定多菌灵在蔬菜中的最高残留限量（MRL）为0.1mg/kg。
酶联免疫吸附法是一种准确、可靠、快速、特异的检测方法，适合于大批样品的快速筛选，近年来已广泛应用于食品安全检测行业。本发明旨在建立一种检测多菌灵的酶联免疫试剂盒及其检测方法。
发明内容
为了克服色谱法的不足，本发明提供一种检测多菌灵的酶联免疫试剂盒及其检测方法。该方法灵敏、准确、快速，操作简便、特异性强，适用于大批样品的快速检测。
本发明检测多菌灵的酶联免疫试剂盒，包括酶标板、多菌灵标准品、多菌灵抗体工作液、多菌灵酶标二抗工作液、底物液A、底物液B、终止液、浓缩稀释液和浓缩洗涤液。
本发明检测多菌灵的酶联免疫试剂盒的制备，包括以下步骤：酶标板的制备、多菌灵标准品的制备、多菌灵抗体工作液的制备、多菌灵酶标二抗工作液的制备、底物液A的制备、底物液B的制备、终止液的制备、浓缩稀释液的制备和浓缩洗涤液的制备。
其进一步特征在于：所述的酶标板经由多菌灵抗原包被制备，具体步骤是将多菌灵半抗原与载体蛋白牛血清白蛋白(BSA)偶联得到包被抗原，用0.05mol/LpH9.6的碳酸盐(CBS)缓冲液作为包被液，将多菌灵包被抗原稀释成1：40000比例，100μL/孔，37℃避光孵育2h，取出酶标板甩掉板内液体，加入经稀释的浓缩洗涤液300μL/孔，洗板2次，30s/次，然后加入0.5%牛血清白蛋白(BSA)封闭液，150μL/孔，37℃放置1.5h，甩掉封闭液直接拍干，拍干后的酶标板放置恒温间(25℃)晾干，抽检合格后将酶标板真空密封于4℃条件下保存。
多菌灵标准品浓度分别为0mg/kg、0.05mg/kg、0.15mg/kg、0.45mg/kg、1.35mg/kg、4.05mg/kg。
所述多菌灵抗体工作液是采用多菌灵人工抗原免疫小鼠得到单克隆抗体，用抗体稀释液稀释成1：60000比例制备。
所述多菌灵酶标二抗工作液由酶标二抗加稀释液稀释成1：2000比例，所述底物液A为含有0.5mmol/L的过氧化氢脲的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲溶液，所述底物液B为四甲基联苯二胺的乙醇溶液，所述终止液为2mol/L的硫酸，所述浓缩稀释液是10倍浓缩稀释液，为0.1mol/L的PBS，pH值范围7.0-7.5之间，所述浓缩洗涤液是10倍浓缩洗涤液，为含0.5%吐温-20，0.1mol/L的PBST，pH值范围7.0-7.5之间。
检测多菌灵的酶联免疫试剂盒及其检测方法，基于抗原抗体的间接竞争酶联免疫反应原理，该方法包括以下步骤：
(1)预处理待测样品，即将待测试的样品处理为液体样品，或者用有机溶剂提取待测样品，并将其复溶于样品稀释液中；
(2)将所需试剂从冷藏环境中取出，置于室温（20～25℃）平衡30min以上，注意每种液体试剂使用前均须摇匀；
(3)取包被有多菌灵抗原的酶标板，加标准品/样本50μL/孔到对应的微孔中，加入多菌灵酶标二抗工作液，50μL/孔，然后加入多菌灵抗体工作液，50μL/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置室温25℃避光环境中反应30min；
(4)小心揭开盖板膜，将孔内液体甩干，用洗涤工作液260μL/孔，充分洗涤4~5次，每次间隔10s，用吸水纸拍干(拍干后未被清除的气泡可用未使用过的枪头戳破)；
(5)加入底物液A50μL/孔，底物液B50μL/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置25℃避光环境中反应15～20min；
(6)加入终止液50μL/孔，轻轻振荡混匀，设定酶标仪于450nm处或双波长450/630nm检测，测定每孔吸光度值（请在5min内读完数据）；
(7)以的标准品浓度(ppb)的对数为横坐标，标准品百分吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线，对照标准曲线计算样品中多菌灵的含量。
其中，所述待测样品用以下方法进行预处理：
a、取20g样品，经组织捣碎匀浆后置于250mL三角瓶内；
b、加入40mL丙酮，超声波提取30min，加入16g无水硫酸钠，，震荡涡旋1min；
c、室温离心4000r/min以上，10min；
d.、取5ml上清液到离心管中，加入5mL二氯甲烷，在密封的容器里混合，震荡涡旋1min，室温离心4000r/min以上，10min；
e、取1mL上清液，加入1mL稀释后的样品稀释液充分振荡混合30s，混匀待测。
本发明检测多菌灵的酶联免疫试剂盒及其检测方法的测定原理：样品中的多菌灵与酶标板上固定的抗原特异性竞争抗体，加入酶标二抗，与抗体反应，通过酶催化显色剂显色，根据显色的深浅来判断样品中多菌灵的含量。如果样品中的多菌灵含量少，显色深；反之，则显色浅。本发明的试剂盒检测方法操作简便，检测灵敏、准确、快速，适用于大批量样品的快速检测。
具体实施方式
多菌灵蛋白质偶联物的制备：
采用琥珀酸酐法得到带羧基的多菌灵半抗原衍生物，之后取0.05mmol与载体蛋白BSA按10：1的结合比混合在0.05mol/LpH9.6的碳酸盐缓冲液(CBS)中，然后加入0.15mmol碳二亚胺，搅拌置室温反应24h，最后于0.2mol/LpH7.6的PBS缓冲液中透析两天，除去未反应的半抗原，将得到的蛋白质偶联物溶液于-20℃保存备用。
多菌灵抗体的制备：
选用健康成年纯种BALA/C小鼠，取与蛋白质偶联制备的免疫抗原50μg与等量完全弗氏佐剂混合采用腹腔注射进行初次免疫，之后每隔3周用相同剂量免疫抗原加等量不完全弗氏佐剂采用腹腔注射进行二次、三次免疫，每次免疫6天后尾静脉采血测定抗血清效价至一定滴度后，用相同剂量不加佐剂进行末次免疫，3天后取脾制备脾细胞悬浮液与骨髓瘤细胞进行细胞融合，筛选出所需要的杂交瘤细胞系进行克隆化，选择处于对数生长期的杂交瘤细胞进行冻存，用于腹水制备，先腹腔注射0.5ml液体石蜡于BALB/C鼠致敏，2周后腹腔注射1×106个杂交瘤细胞，接种细胞7-10天后可产生腹水，待腹水尽可能多时用注射器抽取腹水，反复收集数次，4000rpm离心15min，收集上清，采用辛酸-硫酸铵法纯化腹水对单克隆抗体进行纯化，冷冻干燥得冻干粉后于-20℃保存备用。
制备包被有多菌灵包被抗原的酶标板：
包被抗原是将多菌灵半抗原与载体蛋白牛血清白蛋白(BSA)偶联得到的，用0.05mol/LpH9.6的碳酸盐(CBS)缓冲液作为包被液，将多菌灵抗原稀释成1:40000比例，100μL/孔，37℃放置2h，取出酶标板甩掉板内液体，用稀释后的浓缩洗涤液300μL/孔，洗板2次，30s/次，然后加入0.5%牛血清白蛋白(BSA)封闭，150μL/孔，37℃放置1.5h，弃去封闭液，拍干后的酶标板放置恒温间(25℃)晾干，抽检合格后将酶标板真空密封后置4℃下保存。
多菌灵标准品配制浓度分别为0mg/kg、0.05mg/kg、0.15mg/kg、0.45mg/kg、1.35mg/kg、4.05mg/kg。
多菌灵抗体工作液的制备：采用多菌灵人工抗原免疫小鼠得到单克隆抗体，用抗体稀释液稀释成1：60000比例制备。
多菌灵酶标二抗工作液由酶标二抗加稀释液稀释成1：2000比例，底物液A为含有0.5mmol/L的过氧化氢脲的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲溶液，底物液B为四甲基联苯二胺的乙醇溶液，终止液为2mol/L的硫酸，浓缩稀释液是10倍浓缩稀释液，为0.1mol/L的PBS，pH值范围7.0-7.5之间，浓缩洗涤液是10倍浓缩洗涤液，为含0.5%吐温-20，0.01mol/L的PBST，pH值范围7.0-7.5之间。
基于上述制备的试剂，本发明用于检测多菌灵的酶联免疫试剂盒包括如下材料：
(1)96孔酶标板×1块；
(2)标准液×6瓶：(1mL/瓶)0mg/kg、0.05mg/kg、0.15mg/kg、0.45mg/kg、1.35mg/kg、4.05mg/kg；
(3)抗体工作液7mL；
(4)酶标二抗工作液7mL；
(5)底物液A7mL；
(6)底物液B7mL；
(7)终止液7mL；
(8)10×浓缩稀释液40mL；
(9)10×浓缩洗涤液40mL；
本发明的试剂盒用于检测鸡肉样本中多菌灵残留量时，通过以下步骤实施：样品预处理、用本发明试剂盒进行检测、分析结果。
(1)样品预处理
a、取20g样品，经组织捣碎匀浆后置于250mL三角瓶内；
b、加入40mL丙酮，超声波提取30min，加入16g无水硫酸钠，，震荡涡旋1min；
c、室温离心4000r/min以上，10min；
d.、取5ml上清液到离心管中，加入5mL二氯甲烷，在密封的容器里混合，震荡涡旋1min，室温离心4000r/min以上，10min；
e、取1mL上清液，加入1mL稀释后的样品稀释液充分振荡混合30s，混匀待测。
(2)用本发明试剂盒检测待测样品中多菌灵残留量
取包被有多菌灵抗原的酶标板，加标准品/样本50μL/孔到对应的微孔中；加入酶标二抗工作液，50μL/孔，然后加入多菌灵抗体工作液，50μL/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置室温25℃避光环境中反应30min；小心揭开盖板膜，将孔内液体甩干，用洗涤工作液300μL/孔，充分洗涤4次，浸泡15-30s，用吸水纸拍干；加入底物液A50μL/孔，底物液B50μL/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置25℃避光环境中反应15min；加入终止液50μL/孔，轻轻振荡混匀，设定酶标仪于450nm处或双波长450/630nm检测，测定每孔吸光度值（请在5min内读完数据）；对比待测样品与标准品的吸光度值大小，定量分析待测样品中多菌灵残留量。
(3)分析结果
百分吸光度值的计算，标准品或样本的百分吸光度值等于标准品或样本的吸光度值的平均值(双孔)除以第一个标准(0标准)的吸光度值，再乘以100%，即
百分吸光度值(%)＝B/B0×100%
其中B—标准溶液或样本溶液的平均吸光度值，B0—0ppb标准溶液的平均吸光度值。
以多菌灵的标准品浓度(ppb)的对数为横坐标，标准品百分吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线，求出直线方程。将样本的百分吸光度值代入标准曲线中，从标准曲线上读出样本所对应的浓度，乘以其对应的稀释倍数即为样本中多菌灵的实际浓度。