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1、10申请公布号CN104189356A43申请公布日20141210CN104189356A21申请号201410390113722申请日20140808A61K36/8945200601A61P15/0820060171申请人成都中医药大学附属医院地址610000四川省成都市金牛区十二桥路39号72发明人曾倩李涓王毅谈静黄金珠74专利代理机构成都高远知识产权代理事务所普通合伙51222代理人李高峡全学荣54发明名称一种治疗或辅助治疗不孕症的药物组合物及其制备方法和用途57摘要本发明提供了一种治疗或辅助治疗不孕症的药物组合物，它是含有下述重量配比的原料药制备而成的制剂菟丝子75225份、枸杞子。
2、50150份、覆盆子50150份、续断100300份、丝瓜络75225份、山楂75225份、丹参100300份、山药75225份。本发明还提供了该药物组合物的制备方法和用途。本发明药物直肠给药，经直肠粘膜吸收，直达盆腔，有利于助孕。51INTCL权利要求书1页说明书23页附图5页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书23页附图5页10申请公布号CN104189356ACN104189356A1/1页21一种治疗或辅助治疗不孕症的药物组合物，其特征在于它是含有下述重量配比的原料药制备而成的制剂菟丝子75225份、枸杞子50150份、覆盆子50150份、续断10030。
3、0份、丝瓜络75225份、山楂75225份、丹参100300份、山药75225份。2根据权利要求1所述的药物组合物，其特征在于它是由下述重量配比的原料药制备而成的制剂菟丝子75225份、枸杞子50150份、覆盆子50150份、续断100300份、丝瓜络75225份、山楂75225份、丹参100300份、山药75225份。3根据权利要求2所述的药物组合物，其特征在于它是由下述重量配比的原料药制备而成的制剂菟丝子113187份、枸杞子75125份、覆盆子75125份、续断150250份、丝瓜络113187份、山楂113187份、丹参150250份、山药113187份。4根据权利要求3所述的药物组合。
4、物，其特征在于它是由下述重量配比的原料药制备而成的制剂菟丝子150份、枸杞子100份、覆盆子100份、续断200份、丝瓜络150份、山楂150份、丹参200份、山药150份。5根据权利要求4所述的药物组合物，其特征在于所述的菟丝子为炒菟丝子；所述的山楂为生山楂。6根据权利要求15任意一项所述的药物组合物，其特征在于它是由菟丝子、枸杞子、覆盆子、续断、丝瓜络、山楂、丹参、山药的原生药粉或水或有机溶剂提取物为活性成分，加入药学上可接受的辅料或辅助性成分制备而成的制剂。7根据权利要求6所述的药物组合物，其特征在于所述的制剂是灌肠液、栓剂、免煎颗粒。8根据权利要求7所述的药物组合物，其特征在于所述的菟。
5、丝子包括菟丝子为旋花科植物南方菟丝子CUSCUTAAUSTRALISRBR或菟丝子CUSCUTACHINENSISLAM的干燥成熟种子、大菟丝子为旋花科菟丝子属植物金灯藤CUSCUTAJAPONICACHOISY的干燥成熟种子。9一种制备权利要求18任意一项所述的药物组合物的方法，它包括如下步骤A、称取各重量配比的原料药；B、加水煎煮，浓缩，加入药学上可接受的辅料或辅助性成分制备成药学上常用的制剂。10权利要求18任意一项所述的药物组合物在制备治疗或辅助治疗肾虚血瘀型不孕症的外用药物中的用途。11根据权利要求10所述的用途，其特征在于所述的药物是具有补肾填精、活血化瘀助孕之功，能调节子宫内膜容。
6、受性、调节子宫血液循环、调控雌孕激素及其促进受体对胚泡着床的作用之药物。权利要求书CN104189356A1/23页3一种治疗或辅助治疗不孕症的药物组合物及其制备方法和用途技术领域0001本发明涉及一种治疗或辅助治疗不孕症的药物组合物。背景技术0002不孕症是指以育龄期女子婚后或末次妊娠后，夫妇同居1年以上，男方生殖功能正常，未避孕而未孕。月经不调、多囊卵巢综合征、盆腔炎性疾病及子宫内膜异位症等是不孕的常见疾病。临床证型有肾虚、痰湿、肝郁、血瘀等，其中肾虚血瘀为常见证型，二者互为因果。肾为先天之本，主生殖，肾藏精，精能化血，内寓元阴元阳，经水出诸肾，禀赋素弱，肾气不充；或房劳多产，久病大病，损。
7、伤肾气；或年逾五七冲任耗损，艰于成孕。若肾气不足，精不化血，冲任虚衰，不能成孕；又肾阳亏虚，命门火衰，子宫寒冷，冲任虚寒，胞宫失煦，致不孕；正如圣济总录云“所以无子，冲任不足，肾气虚寒故也。”陈士铎云“胞胎之脉，所以受物者，暖则生物而冷则杀物”。若肾阴亏虚，天癸乏源，精血匮乏，冲任血少，血海空虚，胞宫失养，或阴虚内热，热扰冲任，不能摄精成孕。亦如女科经纶嗣育门引丹溪语云“妇人久无子者，冲任脉中伏热也，其原必起于真阴不足，真阴不足则阳胜而内热，内热则荣血枯。”且肾气虚推动无力，经脉运行迟滞或阴虚血热，热灼血瘀，均致瘀滞，肾虚血瘀冲任无以相资终致不孕。发明内容0003本发明的技术方案是提供了一种治。
8、疗或辅助治疗不孕症的药物组合物。本发明的另一技术方案是提供了该药物组合物的制备方法和用途。0004本发明提供了一种治疗或辅助治疗不孕症的药物组合物，它是含有下述重量配比的原料药制备而成的制剂0005菟丝子75225份、枸杞子50150份、覆盆子50150份、续断100300份、丝瓜络75225份、山楂75225份、丹参100300份、山药75225份。0006进一步优选地，它是由下述重量配比的原料药制备而成的制剂0007菟丝子75225份、枸杞子50150份、覆盆子50150份、续断100300份、丝瓜络75225份、山楂75225份、丹参100300份、山药75225份。0008进一步优选地。
9、，它是由下述重量配比的原料药制备而成的制剂0009菟丝子113187份、枸杞子75125份、覆盆子75125份、续断150250份、丝瓜络113187份、山楂113187份、丹参150250份、山药113187份。0010更进一步优选地，它是由下述重量配比的原料药制备而成的制剂0011菟丝子150份、枸杞子100份、覆盆子100份、续断200份、丝瓜络150份、山楂150份、丹参200份、山药150份。0012其中，所述的菟丝子为炒菟丝子；所述的山楂为生山楂。0013本发明药物组合物是由菟丝子、枸杞子、覆盆子、续断、丝瓜络、山楂、丹参、山药的说明书CN104189356A2/23页4原生药粉或。
10、水或有机溶剂提取物为活性成分，加入药学上可接受的辅料或辅助性成分制备而成的制剂。0014其中，所述的制剂是灌肠液、栓剂、免煎颗粒。0015本发明还提供了一种制备所述的药物组合物的方法，它包括如下步骤0016A、称取各重量配比的原料药；0017B、加水煎煮，浓缩，加入药学上可接受的辅料或辅助性成分制备成药学上常用的制剂。0018其中，所述的制剂是灌肠液、栓剂、免煎颗粒。0019本发明还提供了所述的药物组合物在制备治疗或辅助治疗肾虚血瘀型不孕症的外用药物中的用途。0020其中，所述的药物是具有补肾填精、活血化瘀助孕之功，能调节子宫内膜容受性、调节子宫血液循环、调控雌孕激素及其促进受体对胚泡着床的作。
11、用之药物。0021本发明药物原料组方中菟丝子为旋花科植物南方菟丝子CUSCUTAAUSTRALISRBR或菟丝子CUSCUTACHINENSISLAM的干燥成熟种子或大菟丝子旋花科菟丝子属植物金灯藤CUSCUTAJAPONICACHOISY的干燥成熟种子，性温、味甘，归脾、肾、肝经。有补肾益精，养肝明目，止泻安胎的功效。既能补肾阳，又能益阴精，不燥不滞，平补中而有收涩之性。张锡纯谓“愚于千百味药中及一善治流产之药，乃菟丝子是也”。枸杞子为茄科植物宁夏枸杞LYCIUMBARBARUML的干燥成熟果实，性甘、平，入肝、肾经。能滋补肝肾、养血补精，阴中有阳，微助阳而无动性。傅青主女科种子篇载“妇人有。
12、饮食少思，胸膈满闷，终日倦怠思睡，一经房事，呻吟不已。人以为脾胃之气虚也，谁知是肾气不足乎。治法需以补肾气为主，兼补脾胃之品方用大熟地一两枸杞子二钱三月而肾气大旺”。本草纲目载“滋肾润肺。”又云“甘平而润，性滋而补，不能退热，止能补肾润肺，生精益气，此乃平补之药，所谓精不足者补之以味也。”覆盆子为蔷薇科植物华东覆盆子RUBUSCHINGIIHU的干燥果实，性微温、味酸甘，归肝、肾、膀胱经。性禀中和，功能温肾而不燥、固精而不凝，甘温助阳，味酸固涩，有固精缩尿，益肝肾明目之效，本草正义称其“为滋养真阴之药”。本草经疏曰“覆盆子，其主益气者，言益精气也。肾藏精、肾纳气，精气充足，则身自轻，发不白也”。
13、。三味一味补阳药，两味补阴药，阴阳双补，且滋阴之量大于壮阳，起到微微之火以壮肾阳之功效。几位药合用，共奏阴阳双补，阴中求阳，补而不滞，益肾固精之用。山药为薯蓣科植物薯蓣DIOSCOREAOPPOSITATHUNB的干燥根茎，性甘，平，归脾、肺、肾经。具有益气养阴、固精止带，平补脾、肺、肾三脏的功效,以补脾为主。衷中参西录载“山药液浓益肾，强志育神，性平可以常服多服。”本经云“薯蓣，味甘温。主伤中，补虚羸，除寒热邪气，补中益气力，久服耳目聪明，轻身不饥。”续断为川续断科植物川续断DIPSACUSASPERWALLEXHENRY的干燥根，味苦，性微温。具有补肝肾，强筋骨，续折伤，止崩漏之功。滇南本。
14、草中记载“补肝，强筋骨，定经络，止经中筋骨酸痛，安胎，治妇人白带，生新血，破瘀血，落死胎，止咳嗽咳血，治赤白便浊。”妇人大全良方求嗣门“紫石英一两川续断一两上为末，炼蜜为丸如梧桐子大。久服能生发，令人有子”。丹参为唇形科植物丹参SALVIAMILTIORRHIZABGE的干燥根和根茎，性微寒味苦，归心、肝经。具有活血调经、祛瘀止痛、凉血消痈、除烦安神之功用，被誉为妇科要药，对血热而有瘀滞者最为适合，能祛瘀生新，有“一味丹参饮，功同四物汤”之说。本草便说明书CN104189356A3/23页5读中云“丹参，功同四物，能祛瘀以生新，善疗风而散结，性平和而走血味干苦以调经，不过专通营分。丹参虽有参名。
15、，但补血之力不足，活血之力有余，为调理血分之首要。”用于治疗多种瘀血为患的病证，擅调妇女经脉不匀。山楂为蔷薇科植物山里红CRATAEGUSPINNATIDABGEVARMAJORNEBR或山楂CRATAEGUSPINNATIDABGE的干燥成熟果实。本草纲目“酸甘，微温，入脾、胃、肝经。”具有行气散瘀，化浊降脂，消食健脾之功，选取生山楂意在其行气活血散瘀消脂之效，以化瘀血、行滞气。丝瓜络葫芦科植物丝瓜LUFFACYLINDRICALROEM的干燥成熟果实的维管束，味甘，性凉，归肺、肝、胃经。体轻通利，具有通经活络，清热解毒，活血之功。本草纲目“能通人脉络脏腑，而祛风解毒，消肿化痰，祛痛杀虫，治。
16、诸血病。”0022全方紧紧围绕“肾虚血瘀”基本病机，共奏补肾行气、活血通络助孕之功。补肾填精，阴阳双补，阴中求阳，补而不滞；行气活血消瘀，活血而不伤血，令邪有出路，标本兼顾。上药合用，直肠给药，经直肠粘膜吸收，直达盆腔，有利于助孕。附图说明0023图1各组子宫内膜间质ER比较200其中，图11正常组大鼠子宫内膜组织ER表达200；图12模型组大鼠子宫内膜组织ER表达200；0024图13高剂量组大鼠子宫内膜组织ER表达200；图14低剂量组大鼠子宫内膜组ER表达200；图15五子组大鼠子宫内膜组织ER表达2000025图2各组子宫内膜间质PR比较200其中，图21正常组大鼠子宫内膜组织PR表达。
17、200；图22模型组大鼠子宫内膜组织PR表达200；0026图23高剂量组大鼠子宫内膜组织PR表达200；图24低剂量组大鼠子宫内膜组织PR表达200；图25五子组大鼠子宫内膜组织PR表达2000027图3各组大鼠子宫内膜HE染色比较200其中，图31空白组子宫内膜HE染色X200；图32模型组子宫内膜HE染色X200；图33高剂量组子宫内膜HE染色X200；图34低剂量组子宫内膜HE染色X200；图35五子组子宫内膜HE染色X2000028图4各组大鼠子宫内膜间质MMP9含量表达图200其中，图41空白组大鼠子宫内膜MMP9表达MMP9染色200；图42模型组大鼠子宫内膜MMP9表达MMP9。
18、染色200；图43高剂量组大鼠子宫内膜MMP9表达MMP9染色200；图44中剂量组大鼠子宫内膜MMP9表达MMP9染色200；图45五子组大鼠子宫内膜MMP9表达MMP9染色2000029图5各组大鼠子宫内膜间质TIMP1含量表达图其中，图51正常组大鼠子宫内膜组织TIMP1的表达TIMP1染色200；图52模型组大鼠子宫内膜组织TIMP1的表达TIMP1染色200；图53高剂量组大鼠子宫内膜组织TIMP1的表达TIMP1染色200；图54中剂量组大鼠子宫内膜组织TIMP1的表达TIMP1染色200；图55五子组大鼠子宫内膜组织TIMP1的表达TIMP1染色200具体实施方式0030实施例1。
19、本发明药物的制备0031组方炒大菟丝子15G、枸杞子10G、覆盆子10G、山药15G、续断20G、丹参20G、生山说明书CN104189356A4/23页6楂15G、丝瓜络15G。0032制备方法以上八位，加10倍量水煎煮三次，每次1小时，合并煎液，滤过，滤液浓缩至相对浓度为1101204050的清膏，加乙醇使含醇量达60，静置1224小时，取上清液，回收乙醇至无醇味，加山梨酸3G，加纯化水至1000ML，混匀，分装，即得。0033实施例2本发明药物的制备0034组方炒大菟丝子150G、枸杞子100G、覆盆子100G、山药150G、续断200G、丹参200G、生山楂150G、丝瓜络150G；0。
20、035制备方法以上八位原料药，分别加10倍水煎煮三次，每次1小时，合并煎液，滤过，滤液浓缩至相对浓度为1101204050的清膏，加入淀粉制颗粒，分别制得颗粒剂；或直接购买市售免煎颗粒，临用前按组方中的各原料用量配比混合免煎颗粒，加开水溶解后制备成灌肠液。0036实施例3本发明药物的制备0037取菟丝子113G、枸杞75G、覆盆子75G、续断150G、丝瓜络113G、山楂113G、丹参150G、山药113G,打粉后水煎煮提取浓缩至浸膏，加入栓剂用辅料制备成栓剂。0038实施例4本发明药物的制备0039取菟丝子187G、枸杞125G、覆盆子125G、续断250G、丝瓜络187G、山楂187G、丹。
21、参250G、山药187G,打粉，制备成坐浴剂。0040实施例5本发明药物制备0041取菟丝子75G、枸杞50G、覆盆子50G、续断100G、丝瓜络75G、山楂75G、丹参100G、山药75G，按实施例1的方法制备成灌肠剂。0042实施例6本发明药物的制备0043取菟丝子225G、枸杞150G、覆盆子150G、续断300G、丝瓜络225G、山楂225G、丹参300G、山药225G，按实施例1方法制备成灌肠剂。0044以下通过安全性评价和主要药效学试验以及临床试验证明本发明的有益效果。0045试验例1本发明药物的安全性试验0046以最大浓度、最大给药容积给予小鼠灌肠，2小时1次，8次/天，观察本发。
22、明药物灌肠液对小鼠的急性毒性作用。0047结果显示灌肠给药后即刻以及给药后14天观察，与对照组比较，给药组小鼠行为活动正常，精神状况良好，饮食、二便正常，眼、鼻及口腔洁净，无异常分泌物，无任何异常反应，无一只动物死亡，两组小鼠体重增长差异无统计学意义PO05。实验结束时，脱颈处死小鼠，解剖、肉眼观察主要内脏器，未见异常。本发明药物，小鼠1日内灌肠给药的最大给药剂量为7738G/KG，相当于临床成人日用剂量的106倍，未见明显毒性反应，无一只动物死亡。说明在此剂量下灌肠给予本发明药物，对小鼠是安全的。0048试验例2本发明药物灌肠液对肾虚血瘀模型大鼠的影响试验00491本发明药物灌肠液对肾虚血瘀。
23、模型大鼠血液流变学、VEGF的影响；00502本发明药物灌肠液对肾虚血瘀模型大鼠雌孕激素、雌孕受体表达的影响；00513本发明药物灌肠液对肾虚血瘀模型大鼠子宫指数、卵巢指数的影响；00524本发明药物灌肠液对肾虚血瘀模型大鼠子宫内膜组织形态学、子宫内膜组织中MMP9、TIMP1、MMP9/TIMP1表达的影响。说明书CN104189356A5/23页70053【实验材料】00541实验动物0055普通级雌性SD大鼠60只，体重190240G，雄性SD大鼠16只，体重250280G，由成都中医药大学实验动物中心提供合格证号SCXK川200811，在成都中医药大学中医脏腑病证实验室动物房中饲养，许。
24、可证号SYXK川2012179。于实验前1周购进，雌雄分笼饲养，每笼饲养5只大鼠，饲养室内保持12H光照，12H避光循环饲养，控制室内温度221，相对湿度约为40，予标准饲料和饮用水。参照动物实验方法学，对雌性大鼠进行阴道涂片判定其动情周期。筛选动情周期正常的大鼠，阴道涂片显示为动情前期的雌鼠进入实验阶段。0056阴道涂片及染色方法巴氏染色法将无菌小棉签用生理盐水湿润后旋转插入大鼠阴道，在阴道内轻轻转动几圈后取出，沿同一方向在玻片上滚动涂片。涂片自然干燥后用95乙醇固定23分钟，水洗23分钟，干燥后置于核染液染缸中染色2分钟左右，水洗3060秒；再移入浆染液染缸中染色2分钟左右；最后移入增色液。
25、染缸中染色约10秒，取出玻片用滤纸吸干后于正置显微镜下观察，观察方法如表10057表1大鼠动情周期阴道涂片变化特点005800592实验药物0060本发明药物灌肠液煎剂大菟丝子、枸杞子、覆盆子、丹参等八味药组成，由实施例1的制备，由成都中医药大学附属医院制剂室提供，批号20130327。处方工艺上药加10倍量水煎煮1小时后滤过，煎煮3次，合并滤液，浓缩至1400ML，相当于314G生药/ML，加入02山梨酸，混匀，于分装间装入灭菌容器即得，实验时用蒸馏水配制成相应浓度，成人按50KG计算每日用量为073G生药/KG。0061羟基脲片05G/片，北京嘉林药业股份有限公司，批号130203，国药准。
26、字H20013389。0062高分子右旋糖苷50万分子量，上海金穗生物科技有限公司，批号JS11715。0063五子衍宗丸每10丸重2G，太极集团四川绵阳制药有限公司，批号1306011。00643实验试剂00651超快速无毒改良巴氏染液22，500ML，南京建成科技有限公司，批号20130812；00662MMP9兔抗鼠一抗，BA2202，01ML，武汉博士德生物工程有限公司，批号说明书CN104189356A6/23页82844710；00673TIMP1兔抗鼠一抗，BA3723，01ML，武汉博士德生物工程有限公司，批号9G101；00684二抗及相应试剂盒，北京中杉金桥生物技术有限公司。
27、；00695VEGF博士德生物公司提供，批号BA0407。00706雌二醇E2试剂盒天津九鼎医学生物工程有限公司，批号RG6131200717孕酮P试剂盒天津九鼎医学生物工程有限公司，批号RG5131200728雌激素受体ER试剂盒BEACOMBIO公司，批号613651800739孕激素受体PR试剂盒博士德生物公司，批号YB407C17B007410超快速无毒改良巴氏染液22南京建成科技有限公司,批号20130812007511其它95乙醇、蒸馏水、生理盐水等。00764仪器和设备0077全自动血液流变仪，型号SA9000，北京赛科西德科技发展有限公司；0078普通光学显微镜，OLYMPUS。
28、206007463；0079BSA224SCW电子分析天平，SARLORIUS公司；0080GC1200免疫计数仪，科大创新股份有限公司中佳分公司；0081离心机，北京医用离心机厂LDZ408；0082BX43正置显微镜，OLYMPUS公司，BSA224SCW；0083电子分析天平，SARLORIUS公司；0084其他的实验器材眼科剪、眼科镊、弯钳、大烧杯、灌胃针、无菌棉签、注射器等。0085【实验方法】00861肾虚血瘀型大鼠模型的建立0087参照林继红，杨海英等以及实验动物学建立肾虚血瘀型大鼠模型。空白组大鼠每日给予5ML/KG蒸馏水灌胃，其余每组采用羟基脲450MG/KG给大鼠灌胃，每日。
29、一次，连续8天，除空白组和五子组外，各组大鼠于实验末次给药后1H尾静脉快速注射10高分子右旋糖苷5ML/KG，造成肾虚血瘀模型。00882动物分组及给药0089将筛选合格的雌鼠按体重随机分为空白组、模型组、本发明药物高剂量组相当于临床剂量的20倍、本发明药物低剂量组相当于临床剂量的10倍、五子衍宗丸组，每组10只，造模同时开始灌肠给药。造模结束第2天开始按雌雄比例21进行合笼，按照动物实验方法学指导，第2天早晨观察底盘有阴栓脱落，或阴道涂片查见精子者为合笼成功，记为妊娠第1天。每组合笼成功的雌鼠与未合笼成功的雌鼠分笼饲养，未成功的雌鼠继续合笼，若2个动情周期结束时仍未合笼成功，则为合笼失败。灌。
30、肠时抓取大鼠，采用灌胃针经大鼠肛门插入23CM，缓慢推注药液，为保证给药量，每天分2次给药。具体给药方法如下0090表2造模及造模后给药方法0091说明书CN104189356A7/23页900923检测指标及方法0093大鼠造模用药前后体重的变化009431肾虚血瘀模型大鼠血液流变学及雌孕激素含量的检测0095末次给药后1小时，除空白组与五子组外，各组均于尾静脉快速推注10的高分子右旋糖苷5ML/KG，观察大鼠的行为活动，30分钟后股动脉取血，迅速注入含有肝素的抗凝管及普通采血管中，抗凝管中血液摇匀后用于检测血液流变学指标，由成都中医药大学附属医院检验科测定。普通采血管中血液静置分离血清用于。
31、检测雌、孕激素含量，由成都中医药大学附属医院核医学科测定。009632肾虚血瘀模型大鼠子宫、卵巢脏器指数的测定0097脱颈处死大鼠后，迅速取出子宫、卵巢以电子分析天平称重后放入FAA液中固定，并计算其脏器指数。0098脏器指数脏器质量G/动物质量G100009933肾虚血瘀模型大鼠子宫内膜组织形态学的检查0100每组大鼠脱颈处死后快速取出子宫，称重后放入FAA液中固定48小时，随机取出6只大鼠的子宫，修剪组织块，纱布包裹，流水冲洗24小时，经梯度酒精脱水，即50、80、85、90、95、95、100、100，二甲苯透明，浸蜡，常规石蜡包埋。用组织切片机切片片厚4UM，将切片常规脱蜡至水，苏木素。
32、染色L5MIN，自来水洗1MIN，05盐酸酒精25ML盐酸70酒精500M1分化20秒，自来水洗LMIN，稀氨水1返蓝数秒、自来水洗或蒸馏水洗1MIN，伊红染色15MIN，自来水洗，逐级酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。0101在MIAS2000图形分析系统四川大学图像图形研究所下观察大鼠子宫内膜的组织形态学变化并进行显微摄影。参照相关文献，根据对各组大鼠子宫内膜腺体发育、间质形态及螺旋动脉的观测，对大鼠子宫内膜成熟度进行评分，总分在5分以下者为发育不同步，67分者为发育延迟，89分者为发育成熟，评判标准见下表0102表3子宫内膜成熟度分级标准0103说明书CN104189356A8/23页。
33、10010434肾虚血瘀模型大鼠子宫内膜组织MMP9、TIMP1、MMP9/TIMP1、VEGF、雌孕激素及其受体表达的检测。脱颈处死各组大鼠后快速取出子宫，称重后放入FAA液中固定48小时，随机取出6只大鼠的子宫，经常规脱水、透明、浸蜡、包埋、切片片厚4UM01051石蜡切片脱蜡至水。010623H2O2室温孵育510分钟，以消除内源性过氧化物酶的活性。01073蒸馏水冲洗，PBS浸泡5分钟。01084510的正常山羊血清PBS稀释封闭，室温孵育10分钟。倾去血清，勿洗，滴加适当比例稀释的一抗或一抗工作液，37孵育12小时或4过夜。01095PBS冲洗，5分钟3次。01106滴加适当比例稀释。
34、的生物素标记二抗1BSAPBS稀释，37孵育1030分钟；或滴加第二代生物素标记二抗工作液，37或室温孵育1030分钟。01117PBS冲洗，冲洗3次，每次5分钟。01128滴加适当比例稀释的辣根酬酶标记链霉卵白素PBST稀释，37孵育1030分钟；或第二代辣根酶标记链霉卵白素工作液，37孵育1030分钟。01139PBS冲洗，冲洗3次，每次5分钟。011410显色剂显色DAB或AEC。011511自来水充分冲洗，苏木精复染，封片。0116经观察MMP9、TIMP1、ER、PR、VEGF阳性染色呈棕黄色颗粒状或细丝状。采用MIAS2000图形分析系统，在2010的高倍镜视野下，选5个视野观察，。
35、测量含有棕黄色颗粒物质的面积总和、积分光密度总和及平均黑度均值，以此表示其含量的表达情况。0117附MIAS2000图形分析系统检测指标的意义01181面积0119截面的面积是形态定量分析中常用的参数。截面的面积等于落在截面内的像素点计数乘以每个测试像素点所代表的测试面积AD2K2PC。01202积分光密度0121表述被测个体截面或投影轮廓或体积内光密度的积分值，亦即吸光物质的总含量。分为面积积分光密度和体积积分光密度，前者是被测个体截面或投影轮各像廓内各像素光密度的积分值，表述细胞截面或投影轮廓内某阳性物质的总含量，后者表示被测物完整个体体积为单位的某阳性物质总含量。01223黑度0123是。
36、指物质各部分颜色的深浅度。平均黑度是指被溅物质发布不均时，各种不同黑说明书CN104189356A109/23页11度的物质像素点的平均值，表示被测物质颜色的深浅度即被测物质的含量，即被分析的图像各部分染色颜色的平均深浅度。平均黑度越大，染色越深，被染物质的量越多。0124【统计学方法】0125MIAS2000图像分析结果均采用SPSSL90统计软件处理，以均数标准差表示，组间的差异比较采用单因素方差分析ONEWAYANOVA，方差齐时PO05用LSD法，方差不齐时P005。结果见表5。0135表5本发明药物对各组大鼠红细胞压积的影响0136说明书CN104189356A1110/23页120。
37、137注与空白组比较，P005。结果见表7。0145表7本发明药物灌肠液对各组大鼠全血低切、高切相对指数的影响01460147注与空白组比较，P005，结果见表19。0221表19本发明药物对大鼠子宫脏器指数的影响022202230224注与空白组相比，P005，本发明药物灌肠液高、低剂量组间差异无统计学意义P005。02602各组大鼠子宫内膜间质MMP9/TIMP1含量的表达0261表27本发明药物灌肠液对模型大鼠子宫内膜间质MMP9/TIMP1表达的影响S,N602620263注与空白组相比，P005。0265【结论】02661安全性评价实验表明小鼠1日内的最大给药剂量为7738G/KG，。
38、相当于临床成人日用剂量的106倍，无一只动物死亡，说明在此剂量下灌肠，对小鼠是安全的。02672本发明药物灌肠液能促进模型大鼠子宫的生长，并改善其子宫内膜组织形态学，使内膜生长与胚胎发育同步，有利于胚胎着床。02683本发明药物灌肠液可明显的改善血液流变学的各项指标，提高VEGF在子宫内膜组织中的表达，增加子宫螺旋动脉的数量，从而促进子宫螺旋动脉血管的生成，使子宫组织的血流供应得以改善。血液充盈，脉络通畅，有助于子宫内膜的发育成熟及胚胎的适时着说明书CN104189356A2423/23页25床。02694本发明药物灌肠液可以促进大鼠卵巢和子宫的发育，促进卵泡的成熟和黄体生成，增强卵巢的内分泌。
39、机能，调控雌二醇、孕酮水平，从而使得子宫内膜向利于胚泡的着床的方向发展。02705本发明药物灌肠液本身可能对ER、PR在子宫内膜的表达有调节作用，以此为胚泡着床提供适宜的内膜环境。02716本发明药物灌肠液可提高模型大鼠子宫内膜上皮及间质中MMP9，TIMP1的表达，并能调控MMP9/TIMP1的动态平衡，进而促进子宫内膜细胞外基质的适度降解，维持妊娠的正常进行，这可能是本发明药物灌肠液改善子宫内膜容受性的重要机制之一。0272试验例3本发明药物有效性及安全性的临床研究0273课题组针对四川大学华西第二医院四川大学华西妇产儿童医院生殖中心行IVFET长方案失败后肾虚肝郁血瘀型的95例患者进行分。
40、层，随机分为对照组、二联治疗组及三联治疗组，其中对照组31例，二联治疗组31例，三联治疗组33例。0274对照组采用西医常规降调节、促排卵及黄体支持；二联治疗组在对照组基础上，联合中药及耳穴贴压；三联治疗组在对照组基础上联合中药、耳穴贴压及中药灌肠补方免煎颗粒开水溶解后温度374050100ML保留灌肠。0275治疗过程中，对照组自然妊娠0例，二联治疗组自然妊娠3例自然妊娠率为1000，三联治疗组自然妊娠10例自然妊娠率为3333，与对照组相比，中医药多途径介入治疗后，自然妊娠率明显增加。之后随访母子平安。0276三联治疗组自然妊娠率3333明显高于二联治疗组1000，分析两组自然妊娠患者的助。
41、孕因素，均以输卵管因素居首二联治疗组自然妊娠者输卵管因素达100，三联治疗组自然妊娠者输卵管因素达70。由于直肠与子宫、附件相邻，其静脉相互吻合，本发明药物保留灌肠后通过肠道粘膜吸收，直接渗透至病变部位，能较长时间维持药物浓度，有效地发挥补肾活血，行气通络助孕效应，使胞脉得以通畅，精卵得以结合而受孕，故三联治疗组自然妊娠率较二联治疗组高，说明自然妊娠的疗效关键在于本发明药物的灌肠功效。说明书CN104189356A251/5页26图1说明书附图CN104189356A262/5页27图2说明书附图CN104189356A273/5页28图3说明书附图CN104189356A284/5页29图4说明书附图CN104189356A295/5页30图5说明书附图CN104189356A30。