自动彩色分割和 测量细胞区室的分部定位强度的最小显著性反应的系统和方法 相关的申请
本申请要求在2002年3月13日归档的美国临时专利申请60/363,889的优先权。
【技术领域】
本申请涉及借助高速、高通过量细胞计量术(cytometry)，在放大的图象中，采用亚细胞成分(subcellular components)的分部定位强度(fractionalized localized intensities)的生物物质检测(assay ofbiological material)。
背景技术
历史上，药物发现筛选(drug discovery sceening)一直是使用简单的基于加样孔的读出器(well-based readouts)来处理高生产量的先导化合物(lead compounds)。但是，目前所给定地检测仅能提供的信息是：药物影响某些细胞过程，所述细胞过程引起所测量的反应；药物的靶的确切性质并未指出。以细胞为基础的检测(cell-based assay)是一个模型系统，被设计用来鉴定与所选择的分子靶以特异的方式进行相互作用的化合物。以细胞为基础的检测是强有力的，因为它们接近生理条件，可以产生高度综合的信息。这需要复杂图象分析工具(sophisticated image analysis tools)和流线型数据处理(streamlined datahandling)。在多参数细胞检测(multi-parameter cell assays)中，应答反应(response)是通过多元报道分子(multiplexed reporter molecules)和形态学标准进行测量的，其已受到成象和分析亚细胞细节的劳动密集特性所制约。在筛选过程中，更早地获得更多综合信息的动力需要针对这个瓶颈的有效解决方案。
因为多通路的收敛(converge)和发散(diverge)会提供冗余(备用于细胞调节异常的情况下)和作为协同的反应，所以解剖(dissecting)细胞通路中的步骤是重要的。虽然一种给定药物可引起，如细胞因子(如在孔板中作为单参数反应测量的白介素2(IL-2))的分泌，研究者不知道哪个信号通路(signaling pathway)被利用，或启动了哪些其它的细胞反应(cellular responses)。如果所用的信号通路也引起细胞死亡，候选药物的功效将受到连累，可能在昂贵的和有争议的动物试验中招致失败。需要研究多元细胞反应(multiplexed cellular responses)，以在药物研发中消除此类假阳性导向(false positive lead)。
依赖于其它因素，如细胞周期进程(cell cycle progression)，真实细胞应答反应的复杂性也导致细胞间的异质性(heterogeneity)，即使是在克隆细胞系中也是如此。因此，作用于是DNA合成的一部分的细胞过程的先导物(lead)，仅可在该药物加入时处于S期的细胞中引起应答反应。在临床情况下，持续输注(continuous infusion)可以保证所有的细胞被处理，如此，该先导物是能够被保留下来的候选物。如果测量来自一个孔内的所有细胞的平均应答反应，其可能降到检测阈值之下而导致假阴性：有效的药物就被忽略了。
制药公司不断地需要用于筛选试验的更快分析方法。自动控制已经着手于增加数据获取的需要，但仍然对精确性、特异性和灵敏度存在迫切要求。初步数据显示，检测读出的信息容量越高，在一个应答反应群体中的单个细胞之间的差异性越小。因此，为了达到实验所必须的置信水平而减少所需要的细胞的总数目，会导致通过量(throughput)增加。更精确的分析得到更好的剂量应答反应信息。更高质量的数据导致更好的数据挖掘和对具有显著临床效力的药物的更好鉴别。
在亚细胞分辨率水平，自动化定量分析完整细胞群中的多重荧光报道分子是已知的。通过本申请的转让人Q3DM所拥有的技术进展，精确的荧光量化成为可能，反过来，此复杂图象数据的快速处理又依赖于Q3DM开发的独特的计算过程(computational processes)。随着在自动聚焦、灯稳定性、图象分割和数据管理中的新技术进展(如，US5,548,661；5,790,692；5,790,710；5,856,665；5,932,872；5,995,143以及US专利申请09/703,455和09/766,390)，高通过量显微法仅在最近成为可能。精确高速自动聚焦(accurate，high-speed autofocus)使针对任意大扫描区域的完全自动化的“简易(walk-away)”扫描成为可能。定量分析被通过控制照明强度令人注目地改善了，定量分析依赖于精确自动聚焦(accurate autofocus)。图象分割上的进展使针对暗染色和明染色细胞的检验(detection)变得简单，因而可以用统计学意义的结果检测不均质的细胞群。最后，高信息容量数据的快速流动依赖于有效的图象数据格式和高速缓存。综合起来，这些技术进展能够使以多重细胞为基础的检测中检索高质量的、以图象为基础的实验结果。
发明概述
目前的生物学药物发现明能够拥有的最综合的成套工具，应当是能够整合涉及分子的、细胞结构的和细胞活性的数据采集的技术。将这样一种成套工具应用于生物学程序中，将会把当前的终点细胞检测(end-point cell-assays)从间接读出(如IL2)转变为亚细胞结构的共定位分析，和细胞功能活性的时间经过成象(time-lapse imaging)。定量的细胞成象技术将引领本领域走向理性药物筛选和设计的下一个水平。
伴随着发现管线中此限速步骤的自动化，设计高通过量的、以细胞为基础的检测的可能性出现了，该检测是在全细胞的环境中发生的；也使多重报道分子的能力来到了，从而可以考虑复杂的细胞相互作用。这些检测将具有值得注意的经济优势，因为在得到更多数据上更早，它们提供了排除由于细胞应答反应的不均匀性(heterogeneity)而产生的假阳性和假阴性的可能性。对药物发现的好处在于：先导化合物在进入昂贵且有争议的动物试验之前被更好地予以检定。
本发明所提供的这些改进和优势，是作为细胞区室(cellularcompartments)的分部定位强度(fractional localized intensity)的测量中应用的自动化彩色分割(automating color segmentation)和最小化显著性反应(minimum significant response)的检测系统和方法而实现的。
检测开发可产生意想不到的结果，因此本发明提供对多参数数据标绘图上鉴定的细胞进行可视化检查的能力。相关细胞的选通在显示屏幕上产生了即刻的混合屏面，通过扫描阶段的重新定位，用户可以通过显微镜目镜进行观察确认。
新的检测开发需要该检测系统可适应新颖的报道分子、新的细胞类型和细胞应答反应的视觉特性。为此，本发明的检测系统使用开放的和可扩展的面向对象软件框架，因而可以添加特征，如硬件、测量或数据库功能和细胞分类方案，而不必剥离现有软件的大部分。特别地，适应性对象识别算法(adaptive object recognition algorithms)可被并入本发明的检测系统，包括图象分割(image segmentation)和棋盘形铺嵌(tessellation)，令用户可以交互地定义检测中目标对象的构成(即给定细胞类型的细胞核)。交互地实现的这些算法被并入此检测的扫描参数中，使得自动化图象分割和棋盘形铺嵌能够提供高通过量筛选所需的速度。
由于高性能特征，特别是自动聚焦、灯稳定性、图象分割、图象棋盘形铺嵌和图象测量算法，荧光检测的精确性提高了。在最佳拟合曲线中，在缩减残差中，数据信噪比的所得提高是明显的，这提供了增加的灵敏度。
【附图说明】
图1是按照本发明的自动化显微镜系统的方框图。
图2是显示9×15平方毫米面积内的最佳聚焦表面的标绘图。
图3是示范采用增量扫描获得最佳聚焦的一个过程的图表，此过程可被用于实施本发明。
图4a、4b和4c图解说明自动聚焦电路的动态范围和灵敏度。
图5是自动聚焦测量电路的方框图，此电路可被用于实施本发明。
图6a-6d，图解说明通过非线性修整(感知器标准)2D图象滤光器提高放大图象的对比度。
图7是生物学物质的放大图象，显示细胞核的棋盘形铺嵌。
图8是一个标绘图，显示利用100W汞蒸气弧光灯的光学反馈稳定性获得的结果。
图9是可用于实施本发明的图象表格数据结构的图解。
图10是可用于实施本发明的图象表格高速缓存算法的图解。
图11是一系列的放大细胞图象的三屏面图象，显示在BIPI-制备孔板(wellplate)上的多通道图象获取和处理软件组件的效果。
图12包括四个屏面图象，显示如何将图象分割和棋盘形铺嵌应用于本发明以鉴定和定位细胞核。
图13图解用于在HUVEC细胞中TNFα-诱导的NFκB活化的群体统计。
图14是一族曲线，表现理论的剂量应答反应分辨率，σ＝{.02，.04，.06，.08，.1，.12，.14}(上升的，α＝0.05(I型误差概率)，β＝0.05(II型误差概率))。
图15显示理论的剂量应答反应曲线，μmax＝1.0，μmin＝0.0，和IC50＝8.895×10-5。
图16是一族标绘图，显示孔-孔平均FLIN应答反应的最坏条件反应。
图17是一族标绘图，显示孔-孔平均FLIN应答反应的最佳条件反应。
图18是一族标绘图，显示剂量应答反应回归的蒙特卡罗(MonteCarlo)模拟的结果。
图19a和19b是显示蒙特卡罗(Monte Carlo)置信区间宽度相对样本浓度的曲线。
图20是显示按照本发明的G1亚群的转运应答反应的标绘图。
图21a和21b图解BIPI化合物A对NFκB核转运的抑制。
图22a和22b图解BIPI化合物B对NFκB核转运的抑制。
图23a和23b图解BIPI化合物C对NFκB核转运的抑制。
图24图解，在确定的G1细胞亚群中，BIPI化合物B对NFκB核转运的抑制。
图25是一族曲线，通过标示在每孔最大刺激下获得最小显著反应所需时间而绘制，最小显著应答反应以总NFκB转运的百分率表示。
图26a和26b图解按照本发明用于起始药物筛选的第一个和第二个图形用户界面(GUI)工具。
图27图解按照本发明用于起始药物筛选的第三个GUI工具。
图28是流程图，表现在起始药物筛选中执行的步骤。
图29是流程图，表现按照本发明通过编程的计算机进行药物筛选的方法，还表现引起该方法被执行的软件程序。
图30a-30h是包括节点、边、圆和多边形的几何图形，图解本发明中所用的棋盘形铺嵌的各个方面。
发明详述
细胞区室的分部定位强度(FLIC)
用于细胞转运(cellular translocation)事件的多室模型的开发：许多潜在地重要分子靶不仅在其表达水平被调节，而且受其亚细胞或空间定位调节。在后染色体组时代(post-genomics era)，基因功能的阐明迅速地产生新的数据，并且推翻了老教条。细胞的流行图象不再是在膜袋内四处飘浮的蛋白质、脂质和离子组成的一种悬浮液，而是涉及附着在通过细胞骨架、内质网、高尔基体、离子通道和膜孔而提供的结构骨架或染色质上的蛋白质复合物(protein complexes)。细胞表面受体定向在质膜中，使之可以结合细胞外分子并在细细胞质内启动应答反应。在调控性蛋白水解发生之后，细胞质中的蛋白质复合物可被解离，从而释放特异的DNA结合蛋白。然后，这些蛋白质经过核孔，与染色质组织互相作用，从而调节基因转录。然后，蛋白质通过高尔基体，在此处，它们为了机能性(functionality)而备用。这些过程中的任何一个可被作为改善临床功效和减小副作用的靶，同样地，这些过程中的任何一个对于理解也是重要的。
用于筛选针对该过程的激动剂(agonist)或拮抗剂(antagonist)的典型检测将测量一个已知的DNA结合蛋白从复合物进入到核内的运动。但是，通过使报告分子多重化，相同的检测还可以提供受体内化(internalization)的信息。因此，当下游效应受到调节时，用户可以确信哪个受体在对药物进行反应。广泛地说，存在直观显示蛋白质运动的需要，蛋白质运动可作为靶信号分子激活的应答反应，特别是位于膜外部的受体结合其配体(或药物)并内化(internalizing)，也存在直观显示从细胞质运动到细胞核的转录因子的需要。通过区室特异性标记(染料)已经实现定义离散区室。质膜是用亲脂性羰花青染料标记，细胞质用能够穿过活细胞但在细胞质内裂解而不能扩散出去的染料标记，细胞核是用透过膜的DNA嵌入剂标记。
在核、胞浆和膜区室的鉴定方面，圆形细胞如淋巴细胞展现出一种挑战。分辨稀疏的胞浆区室需要采用高数值孔径物镜来获得高分辨率成象，但这也缩小了视野的深度。有许多亚细胞成分、细胞器或图案也需要高分辨率成象。增强的自动聚焦变成必要的；这必须迅速完成以满足高通过量筛选的需要，并保证荧光强度的精确量化。本发明使用了一个自动聚焦装置，比其他可获得的系统快一个数级，因为它使用了一个专用的电路，直接从视频信号测量图象清晰度。这个自动聚焦装置是强有力的，因为它在一个范围内测量光传递函数(OTF)的改变，该范围避免了细胞图象固有的反差反转。
用于产生初步数据的检测可能包括用于探测分离的蛋白质的第二个报道分子。合意的是，在给定的时间区间内，同一个细胞中可测量到更多的参数。通过使用面向对象软件框架，本发明使用的平台是可扩展的，而且是算法-驱动的，具有最大灵活性。为提供一个假设情况，简单比较两个空间图案(如，核和细胞质荧光)可能不足以确定一个先导化合物在靶上的效能。即使出现阳性反应，如果它伴有细胞形态学或代谢的改变，则效能可能是可疑的，或毒性可能是更重要的限制。添加针对这些细胞特性的报告分子将需要另外的图象分析算法，其将可以分类一组细胞反应(cellular responses)。优选地，本发明通过使用软件插入式结构以便满足这些需要，通过支持将新的、检测特异性处理模块开发进入基础平台和现有检测的图象分析性能中而实现。
图1图解了在实施本发明中所采用的高通过量的显微镜系统平台。此平台包括一个高性能的、研究级仪器，作为附加系统构建在商业荧光显微镜周围。平台包括可编程数字(主机)计算机110，优选的是运行Windows操作系统的高档的、现货供应的Pentium工作站。在此系统上，使用基于熟悉的Windows图形接口(motif)的直接点击操作，可进行开展性和验证性检测。此平台的其它成分包括实时监视器115(live monitor 115)，倒置Nikon TE300荧光显微镜117，其带有的附件包括：自动控制的载物台118(robotic stage 118)，CCD(电荷耦合器件)照相机120和发光二极管相衬光源125(LED相衬光源125，LEDphase contrast light source 125)。通过光纤机架132和光纤133，稳定的汞弧光灯装置131提供用于操作显微镜的照明。当载物台118支承有结构139(如微量滴定板或另外的相当的检测装置)时，控制单元137驱动载物台118来响应反应主机110和主机发出的命令，其中，结构139被置于载物台118之上。自动聚焦电路142对CCD照相机120所获得的图象作出反应，给主机110提供处理过的信息。压电聚焦装置148(piezofocusmechanism 148)控制显微镜117的透镜装置的定位(positioning)，以获得最佳聚焦。主机110被拟定程序，以进行下列例行程序：调焦显微镜117，控制稳定的汞弧光灯装置131，通过移动载物台118扫描结构139，摄取并储存由CCD 120产生的从结构139上的生物学物质所得的放大图象的序列，通过分割和棋盘形铺嵌来处理经放大的图象，并进行将在下面更详细描述的转运处理(translocation processing)。
由于载玻片和盖玻片表面的变化以及显微镜的机械聚焦的不稳定性(特别是热膨胀)，自动聚焦对于扫描大的区域是关键性的[MBravo-Zanoguera和JH Price.用于扫描显微镜术的模拟自动聚焦电路设计(Analog autofocus circuit design for scanning microscopy)。于Proceedings，International Society for Optical Engineering(SPIE)，生物性流体的光学诊断和分析细胞学的高级技术(Optical Deagnostics ofBiological Fluids and Advanced Techniques in Analytical Cytology)中，卷2982，468-475页，1997]。上述作用联合起来有效地产生一个不平的表面，其中，细胞必须在此表面上被分析。这种不平表面的例子被绘于图2中，最佳聚焦表面(9×15mm2的面积)的3D标绘图显示自动聚焦的必要性。标绘图表现出扣除了平均平面之后的最佳聚焦表面，显示一个6μm的范围[M Bravo-Zanoguera，B von Massenbach，A Kellner，和JH Price.生物学显微镜术的高性能自动聚焦电路(High performanceautofocus circuit for biological microscopy)。Review of ScientificInstruments，69(11)：3966-3977，1998]。正如根据此图可以理解的，在整个显微镜载玻片上，焦距可以容易地在±10μm的范围内改变。这能够对定位细胞的能力有引人注目的作用。例如，采用Nikon Fluor 0.75NA 20倍的物镜，均值荧光强度在从焦距±10μm处已显示为下降大约35％[JH Price和DA Gough。用于相衬和荧光扫描显微镜术的数字自动聚焦功能的比较(Comparision of digital autofocus functions forphase-contrast and fluorescence scanning microscopy)。Cytometry，16(4)：283-297，August 1994]。
图3是显示增量扫描(incremental scanning)的图表。来自前一视野(field)的最佳聚焦为下一视野提供自动聚焦搜索范围的中心。然后，以60Hz的视频隔行扫描场频率，测量几个测试平面(典型地5-9个)的聚焦程度(清晰度)，压电远程位置调节器(piezoelectric positioner)被移动到最佳聚焦处。载物台移动和自动聚焦总共需要0.3s。
增量扫描通过以下步骤进行：移动载物台到一个视野，停下载物台，进行自动聚焦，获取图象和在下一视野重复。此顺序显示在图3中。如果焦距位于太接近搜索范围一个尽头的位置，可以重新定位该范围的中心，并重复自动聚焦。
在单视野上的自动聚焦已被广泛地研究和综述[Price & Gough]。进一步的工作延伸此技术到大数目的显微镜视野，并进行具有实时图象处理的高速自动聚焦[Price & Gough]。仔细注意放大倍数和采样产生大约100nm的精度(如标准偏差(standard deviation)所测定的)，是在0.25s内实现聚焦的数千个显微镜视野的扫描中获得的。此技术的进一步发展导致设计和实施自动聚焦电路，导致自动聚焦的成本惊人下降，而且聚焦精度改善至平均56nm[Bravo-Zanoguera等]。对通聚焦(through-focus)OTF的理论和实验研究，帮助进一步支持校正滤光片(correct filter)的选择，此校正滤光片分离用于聚焦测量的高频率[MAOliva，M Bravo-Zanoguera，和JH Price。滤出用于显微镜自动聚焦的反差反转(Filtering out contrast reversals for microscopy autofocus)。AppliedOptics，38(4)：638-646，February 1999]。
表1：扫描中的自动聚焦性能 实验条件 结果实验 面积 (mm× mm)视野测试范围缩放 最佳聚焦范 围 Max-min (μm) 组合σ 均值 数字- 模拟 (μm) 数字 (μm) 模拟 (μm) Z (μm) 位 置a 原始 的 非平 面的b
1c，d 2d，e 3d，e 4d，e 5e，g 6h，g 7h，i 3.25 × 1.91 3.48 × 2.05 2.60 × 2.05 3.63 × 2.84 3.87 × 3.04 4.00 × 3.12 3.87 × 3.04 1200 1728 1296 2500 1296 1369 1296 1.465 2.197 2.196 2.196 2.196 2.196 2.196 11 11 11 11 11 11 9 2.0 2.25 1.1 1.1 1.5 1.5 1.5 6.2 7.3 7.9 16.9 10.5 12.8 11.3 2.8 2.4 1.5 4.1 2.1 1.6 2.9 0.146 1.144 0.036 0.075 0.031 0.028 0.051 0.106 0.052 0.027 0.067 0.027 0.023 0.042 0.144 0.088 0.043 0.006 0.074 0.068 0.122
a聚焦时间是(位置+2)/60s，或在9和11测试位置分别为0.18s和0.22s
b通过线性回归和扣除的平面拟合数据(plane fit to data)
c聚焦平面间的线性间隔
d数字跟踪
e聚焦平面17，10，7，6，6，5，6，7，10和17数字单位间的非线性间隔
f连续视野间重叠48％
g模拟跟踪
h通过模拟和数字的平均数进行跟踪
I聚焦平面22，10，7，6，6，7，10和22数字单位间的非线性间隔
图4a、4b和4c图解说明的是自动聚焦电路的动态范围和灵敏度，采用无细胞(左侧)和仅有少量碎片的显微镜视野予以证明。(中间)显示不禁止自动增益(autogain)的标绘图(增益1.0)，(右侧)显示自动增益为100的标绘图。
图解于图5中的自动聚焦电路是在典型的扫描条件下被测试的[MBravo-Zanoguera，B von Massenbach，A Kellner，和JH Price。生物学显微镜技术的高性能自动聚焦电路(high performance autofocus circuit forbiological microscopy)。Review of Scientific Instruments，69(11)：3966-3977，1998。]。扫描实验的目的是确定系统跟踪聚焦的能力，以及测量精度和比较模拟电路和数字系统。七个矩形区域，范围从1200至2500个视野，在光栅模式下被扫描。结果显示于表1中。对于前六个实验，从来自11个不同垂直位置的焦距测量的权重均数计算焦距。在最后一个实验中，此数目减少到9个垂直位置。在每个显微镜视野下，进行20次自动聚焦。每个实验中的所有自动聚焦试验(20个视野)的组合标准偏差(σ)被显示在表1中。对于每一个实验，模拟电路的精度(由σ所测定)高于数字系统的精度。所有7个实验的组合σ为0.056μm(模拟)和0.087μm(数字)。这比视野深度为0.528μm(按照Francon标准[MFrancon，编者。显微镜术中的进展(Progress in Microscopy)。Row和Peterson，Evanston，I11，1961])高几乎一个数级，并接近0.024μm的最小垂直步幅(minimum vertical step)(PIFOC压电物镜远程位置调节器(PIFOC piezoelectric objective positioner)，Polytec PI，Irvine，CA)。
表1还包括两栏显示每个扫描区域的最佳聚焦范围。在一个栏内显示原始数据范围，而相连的栏显示被减去平均平面的范围(非平面的)。原始数据范围是6.2-16.9μm，对于最大视野而言是最大的。非平面范围是1.6-4.1μm，比高数值孔径(NA)物镜的视野深度还要大许多。其它实验(数据未显示)表明，来自平面(flat)的绝对变分随区域而增大，正如所预料的那样。例如，来自较大的10×15mm2的扫描的数据展现一个6μm的范围，进一步更大区域的扫描经验使我们预期在整个载玻片内达到±10μm的焦距范围。此范围甚至是大于主导许多工业显微镜应用的孔板(wellplate)格式(多达数百微米)。
图5的自动聚焦电路提供非常高的灵敏度。但是，在设计过程早期就已很明显的是，模拟灵敏度大大超过用随后的12位A/D转换可获得的灵敏度。因此，添加自动增益电路(autogain circuit)以增大动态范围。图4a、4b和4c显示自动增益的优势，以及，电路在仅含小碎片的显微镜视野上的动态范围和灵敏度。申请人发现，此电路如此灵敏，以至即便在视野中没有细胞存在，它也可以跟踪焦距，只要视野中有一些东西，即使仅有最小的碎片存在。
如果简单强度阈值适于用相对明亮的荧光染料染色的细胞的定量的以细胞基础的检测(quantitative cell-based assay)，这将是便利的。不幸的是，由于细胞大小和荧光染料密度上的变化，荧光染色的细胞总是在染色中表现出广泛的差异。因此，实时图象分割被用于本发明的荧光染色的细胞区室，以使亚细胞区室的鉴别和定位(localization)较少依赖于荧光强度或可变性[JH Price，EA Hunter，和DA Gough。用于荧光染色细胞核图象分割的最小平方设计的空间FIR滤光器的准确度(Accuracy of least squares designed spatial FIR filter for segmentation ofimages of fluorescence stained cell nuclei)。Cytometry，25(4)303-316，1996]。此工作图解于图6a-6d，其中说明通过非线性修整(感知器标准)2D图象滤光器增强最佳地接近人类结构分类能力(human textureclassification capabilities)。在图6a中，显示了三个DAPI染色3T3细胞核的原始图象。图6b图解说明应用常规图象滤光器获得的结果，它不提供足够的对比度增强。图6c中，线性设计的2D滤光器也不提供足够的对比度增强。图6d图解说明使用非线性设计的滤光器获得的结果，可提供惊人的对比度增强，使得用于最终分割步骤的简单强度阈值成为可能。此方法采用非线性最小平方优化的图象滤光器，针对以自动柱状图为基础的阈值，产生显著的对象-背景对比。此对比使最终图象分割更加不依赖于阈值，使暗细胞可在比以前可能的更大的强度范围内以与亮细胞相同的准确度被分割。按照此方法，滤光器设计的误差函数被允许只合计来自预先确定的最小对比度的误差。允许强度扩大到此范围以外，而不需要精确匹配，实质上提高了性能(见图6a-6d)。此方法已在许多年中被广泛地测试。例如，Price，Hunter和Gough测试过10个含组合的1,070个荧光染色细胞核的混合图象。每个图象被手工分割以提供标准值。然后，用感知器标准和非线性最小平方，调整3×3至25×25元2D滤光器，以最理想地近似于人类标准。每个滤光器对于其它9个图象测试，以保证图象不偏离这个监督设计技术(superviseddesign technique)。用此方法获得了非常高的分割准确度，准确度很少依赖或没有依赖于设计图象。此外，准确度(accuracy)的改善在7×7滤光器大小时开始平化，并在超出15×15滤光器大小后没有提高。通用CPU在处理能力上有进步，所以现在有可能采用7×7滤光器实现在线图象处理而无需任何另外的硬件。不需要大滤光器的事实对实时操作是有利的。
此图象分割装置提供了从非聚焦图象流而来的完全自动化的、实时细胞计量术的基础。此方法精度和准确度的优势导致保真度测量的改善，改进系统处理量和分辨率，正如下面所探讨的那样。
采用最小平方设计的对比度增强滤光器的从背景中分割对象，可被用于从一组荧光图象中发现任何一个细胞区室或一组区室。然后，棋盘形铺嵌可被用于把每个细胞区室分配给一个细胞。细胞核的图象分割对于每个细胞产生一个唯一对象。然后，细胞核表征码(nuclearmasks)被供给到棋盘形铺嵌算法中，以便绘出属于每个细胞的区域，并根据这些区域把剩余的区室指定到细胞。因此，棋盘形铺嵌提供了将细胞区室指定到细胞的一种客观方法。
对象从背景进行图象分割也不分离重叠着的对象。即使在仔细控制的细胞培养中，细胞也可能相互重叠。在许多的细胞计数术应用中，通过切割开重叠对象可以改善测量。棋盘形铺嵌可用于分离重叠对象。一旦细胞核图象已经用对比度增强滤光器分割，核的位置(如，质心)可被输入至棋盘形铺嵌算法中，以切割开其它重叠细胞区室的图象并改善测量保真度(measurement fidelity)。数学形态学技术(mathematicalmorphology techniques)(侵蚀和膨胀)和流域算法(watershed algorithm)也常用于分离重叠对象。例如，细胞膜染色(如，DiI或DiD，MolecularProbes，Eugene OR)或胺全细胞染色(amine whole cell stain)(Alexa 488，Molecular Probes，Eugene OR)可被用于鉴定细胞浆和核区室(通过减去核区室可以确定细胞浆区室)。然后，侵蚀/膨胀或流域可被用于分离重叠细胞。然后，可根据得到的图象分割表征码，将其它细胞区室(如，内质网，ER)或小泡(vesicles)指定到细胞。但是，细胞的非常稀疏区域，是非常暗的，可能不能分割而且不出现在得到的表征码(masks)上。落在消失区域的细胞区室，如ER或小泡，将不被指定到细胞。然后，棋盘形铺嵌可被用于完成此指定。添加一种染色来鉴定细胞浆也可能是不方便或非常困难的。在没有细胞表征码的情况下，棋盘形铺嵌可被用来指定细胞区室到细胞(细胞核表征码)。
在本发明中，一旦采用对比度增强滤光器把细胞核的放大图象分割，分割图象的棋盘形铺嵌被用来精确地定义核的位置(如，质心)，以切割开其它重叠的细胞区室的图象，并改善性能。按照完整的、在线Merriam-Webster词典，棋盘形铺嵌是指“一个由无限的几何平面组成的覆盖层，无间隙或无重叠，是由一种或几种类型的全等平面图形构成”。
实质上，在此说明书中，放大图象的棋盘形铺嵌涉及在细胞的放大图象上形成平面图形的镶嵌图案或网格，其中该镶嵌图案或网格的每个平面图形含有一个在细胞中的对象或区室。这种对象或区室包括，但不限于，核、膜、内质网、高尔基体、线粒体和其它以某种方式组织的具有蛋白质浓度的细胞区域。进一步，通过分割处理这种放大的图象，以从背景和所有其它的细胞成分中区分相同的细胞成分，如核。然后，处理过的分割图象被棋盘形铺嵌，以从接近的和重叠的相邻成分中分开被辨别出的细胞成分中的每一个。例如，参考图7，其中分割的细胞核被平面图形的棋盘形铺嵌网格分离，其中每个平面图形含有一个核。在此图中，例如，在多边形710中包含的分割的核700被分开，并因此可以与包含在多边形730中的相邻的核720相区别。如果已知镶嵌图案中的每个平面图形的位置、形状和大小，那么通过以常规方式仔细研究镶嵌图案，可以很快评价放大图象中的核。图7中的网格是可见的，仅仅是为了支持对棋盘形铺嵌的理解。实际上，从棋盘形铺嵌得到的网格可采用常规图象处理、手工录入和显示装置而直观显现。当然，在通过编程方法处理放大图象中，网格也将作为一个或多个存储的数据结构而存在。这些数据结构通过主机110的编程能够实现棋盘形铺嵌自动化。
图1的平台还包括用于外荧光(epifluorescence)的稳定照明源。在图象细胞计数术系统中，光源稳定性可能是关键的。虽然许多其它仪器(如，分光光度计和流式细胞仪)能够通过监视和校正照明源波动克服此问题，但是图象细胞计数仪是有困难的，因为它难以监视和校正CCD照相机中的250,000或更多的探测器(detectors)。因此，照明源由稳定的100W汞蒸气光源组成，光源使用光纤以排除空间变化的干扰(从电弧偏吹)，并反馈控制以消除残余的暂时不稳定性[S Heynen，DA Gough，和JH Price。光学稳定的汞蒸气短弧光灯作为显微镜的紫外光源(Optically stabilized mercury vapor short arc lamp as uv-light sourcefor microscopy)。在Proceedings，International Society for OpticalEngineering(SPIE)，生物性液体的光学诊断和分析细胞学高级技术(Optical Diagnostics of Biological Fluids and Advanced Techniques inAnalytical Cytology)，卷2982，430-434页，1997]。所提供的照明稳定性显示在图8中。灰色记录线是不稳定灯的，深色记录线显示使用我们系统的反馈稳定结果。两个记录线都是包迹线，显示以10s间隔记录的最小和最大强度值。强度采用Imaging Technology Inc.公司的151系列图象处理器在30Hz处测量。此长期稳定性是不平常的。由于反馈，差异的强度系数下降超过30倍。此强度控制会大大改善直接依赖荧光强度的测量，如在细胞功能检测中。
本发明进一步应用图象目的区域(area-of-interest)(AOI)数据结构和高速缓存算法。扫描细胞计数术的一个方面是，数据的固有视图是玻片样本的连续图象，由数十千显微镜视野和数千兆字节的原始图象数据组成(典型地，大于常规的32-位可寻址空间)。有效访问这些数据中的AOI是前端用户经由图形界面的要求，也是应用程序员和检测开展者的要求。此访问只能通过新的图象数据结构和高速缓冲算法来提供，它们组织扫描样本中的磁盘常驻AOI，并根据需要将它们移进和移出RAM(随机存储器)。已经开发了一个“图象表(image table)”数据结构组织和管理图象数据[EA Hunter，WS Callaway，和JH Price。扫描细胞计数术的软件框架(A software for scanning cytometry)。Proceedings，International Society for Optical Engineering(SPIE)，OpticalTechnology in Analytical Cytology IV，San Jose，CA，卷3924，22-28页，2000年1月。]，以便让最普遍的使用方案有效地访问，使用方案包括连续式(用户可滚动的)、不连续式(任意矩形)和数据库驱动式(查询应答)样本浏览和查询。图9和10图解用于AOI元数据结构的设计和相关的高速缓冲算法。图象表的作用是负责图象目的区域管理，是以设计的格式进行，以促进基于观测孔覆盖几何学的、有效的AOI再调用。有效的高速缓冲算法按需将磁盘常驻的AOI数据移入RAM。这令用户可以在标准的PC工作站上浏览或顺序访问数十千兆字节或更多的图象数据。
在细胞质至核的NFκB转运研究中，用于细胞功能分析的自动化荧光显微镜方法
此节描述研究的结果，用于量化调控蛋白核因子κB(NFκB)在对细胞刺激进行应答反应的亚细胞分布。在刺激时，例如通过促炎细胞因子(proinflammatory cytokines)，NFκB的抑制性亚单位被磷酸化并接着被蛋白酶体(proteasomes)破坏。抑制性亚单位的丧失使修饰蛋白的p65调节亚单位游离，从细胞质转运到核内，在此它可以活化防御基因，应答外部刺激。
对来自显微镜图象的免疫荧光标记NFκB的准确和精确的亚细胞量化，提供了一种直接的方法，用来评价化合物在存在刺激时抑制细胞功能的能力。作为以图象为基础的细胞功能检测原型，此研究考察了细胞质至核的NFκB转运，是在HUVEC细胞中在应答肿瘤坏死因子α(TNFα)时发生的。由于与上面描述的图象获取和分析技术协同工作的特异性免疫荧光标记，任何其它的细胞区室被分离和精确量化，这里所证明的速度和精度优势一般可用到细胞功能检测中。实验还允许对通过实践我们的发明采用图1平台获得的结果和以前公布的采用不同技术获得的结果进行直接比较[G Ding，P Fischer，R Boltz，J Schmidt，J.Colaianne，A Gough，R Rubin，和D Uiller。白介素-1和肿瘤坏死因子-α诱导的NFκB核转运的定性和定量(Characterization and quantitation ofNfκB nuclear translocation induced by interleukin-1 and tumor necrosisfactor-α)。Journal of Biological Chemistry，273(44)：28897-28905，1998]，正如依据保真度和系统处理量所测量的那样。我们以实质上减小的孔-群体标准误差显示了细胞区室测量值的比较，该标准误差是测量技术和内在的生物学不均匀性的函数。我们显示应答反应可变性如何转化成在可靠地检验部分反应所需的细胞数目上的减少，而且它如何影响抑制剂反应的估计值(通过模型反应IC50分布的蒙特-卡罗模拟(MonteCarlo simulation)。根据形态学信息分离细胞图象的能力，可进一步导致改进，可通过聚焦测量在均一应答的亚群上而实现改进。然后通过分析三个BIPI转运抑制剂化合物的应答反应，证实扫描和分析。最后，解释系统通过量，且对典型的实验参数，给定估计的扫描速率。
实验步骤
用于这些研究的细胞是获取自Clonetics Corporation的原代人脐静脉内皮细胞(HUVEC)。细胞在标准条件下维持在培养基中，并用Clonetics所专有的EGM培养基和试剂系统传代。因为它们未被转化，HUVECs通常在九或十代后变老化。在这些研究中，使用的细胞来自较早期传代，并不具有老化相关的形态学改变。
检测前，细胞转移到96孔板中(Packard black ViewPlate)，并孵育过夜以产生接近25％融合的细胞单层。通过每孔接种5000、2500和1000个细胞制备孔板，并孵育过夜，用于确定用于检测的统计学上最适当的细胞密度。测试三个选择出的化合物，是测验在HUVEC中对TNFα刺激的NFκB转运的抑制。该三个化合物和对照被安排在板中，如表2和3所示。测试化合物从DMSO贮存液中直接稀释进培养基，产生含低于0.7％DMSO的60mM化合物溶液。这些溶液在培养基中被连续稀释，以产生低至0.1mM的化合物浓度。从测试板中去除培养基后，每个化合物溶液的100μl等分量被给予三份重复孔中。未刺激的和TNFα刺激的对照孔分别接受120和100μl培养基。在每孔添加20ml TNFα(1200U/ml培养基)进行刺激之前，将细胞在37℃预孵育30分钟。用于本检测的TNFα的终刺激浓度为200U/ml。15分钟孵育后，用3.7％甲醛固定细胞，然后采用得自Cellomics(Pittsburgh，PA)的NFκB试剂盒试剂和方案处理，以染色细胞NFκB。简言之，细胞被通透化，冲洗，与兔抗NFκB第一抗体孵育1小时，冲洗，与第二抗体抗兔IgG抗体-AlexaFluor 488偶联物孵育1小时，再次冲洗。核被第二抗溶液中包括的Hoechst染料染色，或被DAPI染色。使用时，DAPI以100至400ng/ml加入到最终冲洗缓冲液中，并在贮存和检验中保持不变。通过使用共聚焦显微镜系统，通过视觉检查样本孔，评价NFκB从细胞质到核的转运。
排 每孔细胞
A 空白
B 5000
C 5000
D 2500
E 2500
F 1000
G 1000
H 空白
表2：96孔NFκB对照板的模板。B，D，F排未刺激；C，E，G排用200U/mlTNFα刺激15m。排 1-3排 4-6排 7-9排10-12排A BCDEFGH 200 TNFα 0.1μMA 0.3μMA 1μMA 3μMA 10μMA 30μMA 60μMA U/ml 200 TNFα 0.1μMB 0.3μMB 1μMB 3μMB 10μMB 30μMB 60μMB U/ml未刺激的 0.1μMC 0.3μMC 1μMC 3μMC 10μMC 30μMC 60μMC未刺激的 空白空白空白空白空白空白空白
表3：96孔BIPI抑制剂板的模板。A排对照：用200U/ml TNFα刺激15m，(栏1-6)，未刺激的(栏7-12)。B-H排：化合物A、B和C的三份重复孔，在0.1、0.3、1、3、10、30、60μM浓度下。
上面图1中图解的高通过量显微镜平台被用于NFκB检测的自动化荧光图象获取和分析。主要系统组件组成包括：一个标准荧光倒置显微镜(Nikon TE-300)；一个Pentium III工作站；一个控制系统，其安置许多电子元件；和软件，其控制该系统获取和分析所获得的图象。扫描中使用的物镜是Nikon CFI60 20x.5 NA Plan Fluor。空间和暂时稳定荧光光源使用100瓦Osram HBO 103 W/2汞弧光灯作为其光源，并在Nikon外荧光附件上与显微镜相连。具有长距离发射滤光片的标准ChromaDapi/Hoechst滤光器管被用作核通道。具有长距离发射滤光片的标准FITC滤光器管被用作Alexa488-标记的NFκB通道。Cohu 640×480象素10位改良照相机(6612-3000型；9.9μm2象素)被用来进行图象获取。
亚细胞区室的分布或分部定位强度(Fractional Localized Intensities，FLI)的测量
在细胞应答反应过程中，细胞物质动态地分布。尽管可能有几十万至数百万的不同细胞物质，但细胞应答反应可以通过对参与应答反应的物质的子集的特异性标记来测量。在任何时间点，区室鉴定和特异性标记物质的联合可被用来取得该分布的快照。图象分割产生了每个细胞区室的图象表征码(image masks)。例如，最小平方设计的对比度增强滤光器被用在每个细胞区室图象上，以产生分割表征码。然后，采用棋盘形铺嵌，核分割被用作分开重叠区室的向导。这些图象分割技术在许多类型的细胞图象上工作良好。但其它分割技术也可以用来产生每个细胞区室的分割表征码。然后，测量逻辑通过区室表征码所鉴定的每个象素集进行循环，并汇总象素强度I(x；y)。作为举例，假设膜、细胞质和核表征码分别为m、c和n，大小分别为Nc、Nn和Nm。在区室上的分布被定义为每个区室的分部定位强度。细胞质Fc的分部定位强度为
Fc=Σ(x,y)∈cI(x,y)Σ(x,y)∈c,m,nI(x,y)---(1)]]>
此方程式对于核Fn和膜Fm的分部定位强度是相似的，且Fc+Fn+Fm＝1。荧光图象模式的物理学导致使用综合强度来量化细胞分布。在图象平面内，在象素位置(x，y)处的发射强度为
I(x,y)=∫0zI0Qϵudz=I0Qϵu′z---(2)]]>
其中入射(激发)强度I0，量子产量Q，消光系数ε，局部和柱平均荧光基团浓度u和u′，和柱厚度z。当景深超过细胞时，图象模式有效地整合样本在z中，z是光轴的方向。与使用高NA、共聚焦和多光子光学一样，当景深小于细胞时，在z中的清晰整合可更准确地表示强度。假设此整合已经发生，或者是对大景深用光学整合，或者是对小景深采用计算，强度测量在正交维数内整合
Σ(x,y)I(x,y)=I0QϵΣ(x,y)u′(x,y)z(x,y)---(3)]]>
它具有与摩尔荧光基团成比例的单位。Fc变为
Fc=Σ(x,y)∈cu′(x,y)z(x,y)Σ(x,y)∈cu′(x,y)z(x,y)+QnQcΣ(x,y)∈nu′(x,y)z(x,y)+QmQcΣ(x,y)∈mu′(x,y)z(x,y)---(4)]]>
具有摩尔荧光基团单位。如前，此方程式对于核Fn和膜Fm的分部定位强度是相类似的。量子产量潜在地是区室特异的(即，随pH、离子浓度和其它局部物理参数而改变)，并可以作为方案开发的一部分用实验方法建立。注意到，在区室图象片段上的直接整合优于US 5,989,835所用的平均区室强度比或差异，因为面积比引起一个偏倚因子，它混淆了直接判读，除非Nc＝Nn＝Nm，这只能通过放弃细胞质和核信号的大部分人工取得，因为代表性地，Nc，Nn＞Nm。即使当体积固定时，细胞(或亚细胞区室)的面积也是高度的函数。相同数量的细胞物质可分布在不同体积或面积上。该面积上强度的平均因而引起对某些因素的依赖，该因素与标记的物质数量无关。还注意到，方程式(1)和(4)中，Fc是总体整合荧光对所有区室的分数，而不是一个区室对另一个区室的分数。
进一步概括起来，在任意数目η的区室ζ中，区室k具有分部定位强度
Fζk=Σ(x,y)∈ζkI(x,y)Σi=1ηΣ(x,y)∈ζiI(x,y)andΣi=1ηFζi=1---(5a)]]>
相似地，区室的任何亚集可以通过增加而组合，从而产生多区室分部定位强度。例如，区室1和3的分部定位强度是
Fζ1,3=Fζ1+Fζ3---(5b)]]>
等等。
FLIC的结果和误差
对TNFα诱导的NFκB细胞质-核转运进行分部定位强度测量：NFκBp65调节亚单位的免疫荧光着色，使得通过对扫描获得的图象进行视觉观察可容易地描述NFκB的细胞间分布。在未刺激的细胞中，多数荧光位于核外区域，而在用TNFα进行最大刺激后相当大量的与核表征码定位于同一位置(图11)。图11的屏面显示细胞质NFκB p65调节亚单位(未刺激的；左侧图象)转运到细胞核(刺激的；右侧图象)，是在用TNFα刺激HUVEC细胞之后进行。细胞密度为5000个细胞/孔(顶端；B，C排)，2500个细胞/孔(中间；D，E排)和1000个细胞/孔(底部；F，G排)。刺激前，明显多数的Alexa488-标记的p65普遍地存在于细胞浆内，同时与抑制性亚单位结合。用TNFα刺激引起p65磷酸化，并与抑制性亚单位分开，允许转运发生。在最大刺激下，仅有总p65的约20％转运(图象的定性视觉观察倾向于过分强调受刺激细胞的核内较高的荧光基团浓集，并提示较多的转运)。注意背景荧光如何在孔间变化。如前面报告所规定的，在刺激下发生转运的p65部分，相当于未刺激细胞的细胞质中含有的总量的≈20％[Ding等人]。背景荧光的影响通过估计和减去均值背景图象强度而校正，均值背景图象强度被发现在图象到图象间近似于常数，但在孔到孔间可以变化。因此，校正在每孔基础上进行。
p65免疫荧光与核表征码的共同定位可以发生在未刺激的细胞中，是在当图象模式通过与光轴平行的三维样本整合p65结合的荧光基团发射时发生，并因此共同定位容易受核体积之上或之下的损益(contribution above or below the nuclear volume)的影响。同样，刺激细胞图象携带有残留的细胞质p65免疫荧光损益(contributions)，与核表征码(nuclear mask)共同定位。尽管此影响可能很小，但它在分部定位强度测量中引入了一个偏倚。对于不可忽略此影响的应用，通过将未刺激细胞中的核和细胞质的绝对整合强度相关联，建立细胞质驻留的荧光基团对核测量的平均贡献度，作为细胞质强度的函数，将能够开发出校正程序。
图12图解说明图1系统中的图象获取处理阶段。为获得图12的图象，在每孔中的10×10视野范围内，扫描核通道(Hoechst 33342或DAPI)，以用核强度图象填充图象表(上部左侧)。上部右侧屏面显示相关核表征码图象，是通过对非聚焦获取图象的过滤和智能阈值处理产生的。主观地，表征码与Price，Hunter和Gough进行的定量研究一致，尽管有显著的局部图象差异和细胞-到-细胞的核强度发的宽范围，但是表明是准确和精确的核表征码。这种差异能够使简单技术混淆不清，因为所得表征码的准确度和精度将实质上偏离局部化强度测量。采用人工分割修整和测试数据，此过滤技术已显示获得准确度＞93％的象素正确分类和低于大约1％差异系数的精度[Price，Hunter，和Gough]。这是可接受的，或许是限制性性能水平，因为在手工分割的实例中，人与人之间的一致性很可能是可比较的。通过核质心将扫描区域进行棋盘形铺嵌，显示在图12中(下部左侧)。然后，此棋盘形铺嵌结构被用来动态地组合，并将定量的p65通道(Alexa488)与个别的核图象相关联(下部右侧)。通道间可靠的对齐为准确的分部定位强度测量提供了基础。
图12中，Hoechst 33342或DAPI-标记的细胞核的个别地可寻址图象被识别，并从扫描中所产生的图象流中被抽取出来。这些图象可以被保存到磁盘上，是使用保持每个核的相对位置(上部左侧)的图象表数据结构进行(图9)。二元的核表征码图象(上部右侧)显示所达到的核分割处理的准确度，这对于区室局部化测量是关键的。核质心的Voronoi棋盘形铺嵌(下部左侧)将数据结构和扫描区域分割成多边形区，用来关联随后的通道和单个核(下部右侧)，以使来自每个细胞的信号最大化。
200U/ml TNFα刺激HUVEC细胞之后，最大NFκB转运是通过测量完全在扫描区域中(表4)的每个细胞核的分部定位强度(fractionallocalized intensity in the nucleus，FLIN)而被量化(在本研究所用的两室转运模型中，细胞质中的分部定位强度(fractional localized intensity inthe cytoplasm，FLIC)是对等的：FLIC+FLIN＝1)。在不同的细胞密度下，FLIN样本均值、标准偏差(σ)、标准误差(SE)和变差系数(CV)在12个重复孔中进行计算(表4)。表5报告了所有6个密度x刺激处理的孔内样本均值FLIN的孔-孔样本统计，由图13中的常数水平线来说明。图13图解了用于HUVEC细胞中的TNFα诱导的NFκB激活的群体统计学。FLIN反应(μ±2σ)逐孔绘图，未刺激的(较低的FLIN)和最大刺激(增加的FLIN)细胞(200U/ml TNFα)，5000个细胞/孔(顶端；B，C排)、2500个细胞/孔(中间；D，E排)和1000个细胞/孔(底部；F，G排)。水平线给出了均数±2xSE的排上下的均值。
表4：孔-方式和排-合并的FLIN统计。CVs定义为(标准偏差)/均值 孔 n 均值 σ SE CV 1B 2B 3B 4B 5B 6B 7B 8B 9B 10B 11B 12B 964 1132 1309 1263 1089 1297 1251 1153 1283 1127 994 1234 0.147846 0.130526 0.134470 0.132990 0.137363 0.138022 0.138558 0.134308 0.132846 0.132862 0.126178 0.129016 0.048122 0.042521 0.043876 0.043633 0.045115 0.045132 0.050421 0.046321 0.046153 0.044833 0.040244 0.043913 0.001550 0.001264 0.001213 0.001228 0.001367 0.001253 0.001426 0.001364 0.001289 0.001335 0.001276 0.001250 0.325484 0.325768 0.326291 0.328090 0.328437 0.326990 0.363893 0.344884 0.347419 0.337442 0.318942 0.340366 B排 14096 0.1345 0.0454 0.0004 0.3374 1C 2C 3C 4C 5C 6C 7C 8C 9C 10C 11C 12C 1123 1226 1443 1265 1410 1149 1367 1330 1260 1311 1108 1044 0.290729 0.286024 0.318096 0.346417 0.342634 0.338905 0.309078 0.305640 0.314321 0.322215 0.328182 0.336819 0.075713 0.076772 0.085135 0.077291 0.081898 0.081211 0.082221 0.081423 0.080458 0.080099 0.083463 0.082491 0.002259 0.002193 0.002241 0.002173 0.002181 0.002396 0.002224 0.002233 0.002267 0.002212 0.002507 0.002553 0.260423 0.268410 0.267640 0.223114 0.239025 0.239627 0.266019 0.266401 0.255975 0.248589 0.254319 0.244912 C排 15036 0.3199 0.0829 0.0007 0.2592 1D 2D 3D 4D 5D 192 228 273 330 356 0.165380 0.169188 0.177909 0.167759 0.219419 0.055521 0.066621 0.062334 0.063749 0.086005 0.004007 0.004412 0.003773 0.003509 0.004558 0.335721 0.393770 0.350374 0.380006 0.391968
6D 7D 8D 9D 10D 11D 12D 367 349 319 311 382 364 277 0.211853 0.184329 0.183501 0.219387 0.150226 0.158436 0.149743 0.082027 0.069234 0.068811 0.092681 0.052488 0.058115 0.051306 0.004282 0.003706 0.003853 0.005255 0.002686 0.003089 0.003003 0.387188 0.375601 0.374990 0.422455 0.349390 0.366802 0.342629 D排 3738 0.1809 0.0735 0.0006 0.4062 1E 2E 3E 4E 5E 6E 7E 8E 9E 10E 11E 12E 488 533 591 582 615 589 594 542 622 644 534 396 0.350998 0.352654 0.350479 0.371006 0.368168 0.361919 0.361462 0.369526 0.359408 0.352375 0.367225 0.374030 0.088568 0.076766 0.074646 0.077932 0.077079 0.080731 0.077352 0.081884 0.089347 0.079729 0.082335 0.091069 0.004009 0.003325 0.003071 0.003287 0.003108 0.003326 0.003174 0.003517 0.003473 0.003142 0.003563 0.004576 0.252331 0.217679 0.212983 0.210056 0.209359 0.223064 0.213998 0.221593 0.248594 0.226263 0.224207 0.243482 E排 6750 0.3613 0.0816 0.0010 0.2259 1F 2F 3F 4F 5F 6F 7F 8F 9F 10F 11F 12F 199 109 204 182 177 174 200 172 163 171 176 160 0.171691 0.154424 0.147685 0.149932 0.153247 0.155897 0.151608 0.183963 0.146976 0.146951 0.156161 0.158985 0.052991 0.075078 0.056180 0.049610 0.058143 0.051656 0.056382 0.068814 0.056036 0.049964 0.051188 0.049600 0.003756 0.007191 0.003933 0.003677 0.004370 0.003916 0.003987 0.005247 0.004389 0.003821 0.003858 0.003921 0.308639 0.486179 0.380404 0.330882 0.379411 0.331348 0.371893 0.374063 0.381262 0.340006 0.329902 0.311977 F排 2087 0.1564 0.0570 0.0012 0.3642
1G 2G 3G 4G 5G 6G 7G 8G 9G 10G 11G 12G 279 332 306 296 310 339 329 290 281 292 317 235 0.336876 0.406467 0.340068 0.348505 0.359116 0.346658 0.354841 0.349761 0.362283 0.344575 0.341355 0.347623 0.086114 0.077388 0.078636 0.068383 0.070316 0.077604 0.075766 0.074941 0.075045 0.077994 0.076450 0.069314 0.005155 0.004247 0.004495 0.003975 0.003994 0.004215 0.004177 0.004401 0.004477 0.004564 0.004294 0.004522 0.255624 0.190391 0.231235 0.196218 0.195803 0.223862 0.213521 0.214263 0.207145 0.226347 0.223961 0.199394 G排 3606 0.3537 0.0779 0.0013 0.2203
我们测量到18.18％-19.68％(平均18.80％)的标记NFκB转运的发生率，该值是我们通过平均12排重复孔的FLIN样本每排均值计算出来的，并在每个细胞密度差分刺激的和未刺激的平均值。细胞对TNFα刺激的应答反应的不均一性是清楚显现的，通过所获得的图象的视觉观察而显现，并在图13中的±2σ置信区间宽度(每孔均值周围的较大距离)中进行归纳。在应答反应中，刺激的和未刺激的孔群体有显著的重叠。但是，同FLIN标准误差相比，平均18.80％的应答反应是很大的，在表4中的FLIN标准误差是在孔内计算的，并用图表显示在图13中(每孔均值周围的较小距离)。例如，E排的平均SE，3.46×10-3，给出了0.0139 FLIN增量的4SE经验反应分辨率，或在18.80％的信号动态范围内大约7.4％的增量。
通过分析从孔-到-孔的孔平均FLIN测量值的差幅，我们可以评定该实验的孔-到-孔变异性和可重复性。通过平均每排12个重复孔样本均值计算的排合计FLEN样本均值，具有1.6×10-3-7.20×10-3(2.34％-13.93％的CV)的标准误差(表5)。此孔-到-孔样本均值变异性通过图13中水平合计均值和±2SE线直观显示。个别孔反应偏离此区域，说明了在个别孔环境中的方案干扰效应。尽管存在统计学上的显著差异，但是，在此实验中，实际或科学显著性以对所测量转运的影响而言，典型地是很小的，提示了在最优化和对照方案中限制所需的重复孔数目的可能性。作为定量的实例，表4中D排平衡的孔间CV可将变异性从13.93％减少至4.76％。注意到，D排具有最高的CV，孔数目平衡到6个均值孔(使用如下假设，即具有最大人为制备误差的那些孔是在分布的尾部)。旨在减轻孔间变异性影响的孔板重复设计必须在特定检测开发过程中确定下来。
表5：孔平均FLIN值的孔-到-孔统计(n＝12)。每排中，是FLIN孔样本均值的均值、标准偏差、标准误差和变差系数。
排 平均值 σ SE CVBCDEFG 0.1346 0.3199 0.1798 0.3616 0.1564 0.3532 0.0055 0.0198 0.0250 0.0085 0.0110 0.0184 0.0016 0.0057 0.0072 0.0024 0.0032 0.0053 0.0412 0.0618 0.1393 0.0234 0.0704 0.0521
达到最小显著性反应(Minimum Significant Response)所需细胞/孔的自动确定
剂量反应分辨率的理论：为了在理论上支持经验剂量反应分辨率和正确地将数据与采用不同技术产生的结果进行基线比较，需要客观定义如下内容：反应分辨率的含义及其对测量保真度的依赖性，样本大小和误差控制。通过非线性回归评估抑制性反应，是从分布在一个范围内的抑制剂浓度上的实验孔平均测量值的集合中进行的。曲线估计值中变异性的来源包括，应答反应中的高群体变异性(不均一性)，孔-到-孔之间的变异性，抑制剂浓度的不适当采样。这些因素是自然因素依赖的；测量的精度限制了应答反应中的可测量差异。实验设计涉及共同优化孔的数据点重复值和个别孔的测量质量(每孔细胞数量的函数)。
系统分辨率的直接测量指标是统计学上能够可靠地测量到的最小显著性反应。对于选择的抑制性反应模型所预示的特殊的最小显著性反应，系统性能的等价测量指标是需要在每个抑制浓度下能可靠地估计反应模型参数的细胞测量的数目。对于反应细胞的两个群体，我们想要测定平均FLIN的最小差异，它可作为系统分辨率的测量指标很可靠地被检测到。为此，我们定义一个双样本假设试验
H0：μ1-μ2＝0 (6)
Ha：μ1-μ2＞0 (7)
当μ1和μ2为真实的(非观察的)平均FLIN反应值，Ho和Ha为零和可选择假设。这是具有判定规则z＞za，的上尾部检验(upper-tailed test)，其中z＝(x1-x2)/(σ√2/n)是对样本均数x1和x2进行统计的单元方差标准化检验，za是α-水平检验拒绝的阈值，
α=Pr(z>zα|H0)=1-∫-∞zα12πex22dx=1-Φ(zα)---(8)]]>
I型误差概率(α)是两种相同的受抑制样本，通过自然变异性，在测量中显示最小显著性反应差异的可能性。I型误差的概率可通过预先将其值固定予以控制，如α＝0.05，如检测要求所确定的那样。同样，II型误差概率(β)是具有最小反应差异的两个样本在测量中不显示显著性差异的可能性，同样地，它可由检测要求所确定和固定。为了叙述这些检测参数和导出精度的测量方法，我们将数学化地表示概率β，假设一个绝对最小显著性反应(minimum significant response，MSR)Δμ
Pr(z＜zα|μ1-μ2＝Δμ)＝β(Δμ) (9)
Pr(x1-x2-Δμσ2/n<zα-Δμσ2/n|μ1-μ2=Δμ)=β(Δμ,σ,n)---(10)]]>
Φ(zα-Δμσ2/n)=β(Δμ,σ,n)---(11)]]>
这将β表示为Δμ，σ(FLIN群体标准偏差)和n(样本大小)的函数。假设两个群体具有相同的σ是合理的，因为在此限制中，最小可检测的差异接近相同的群体(在σ1≠σ2的情况下很容易导出公式，然而，当检测极有区别的反应时，我们需要对样本大小要求给出一个估计值)。通过指定β，我们可对a进行检验，如a＝β＝0.05，我们控制II型误差概率并固定zβ
Φ(zβ)＝β (12)
zβ=zα-Δμσ2/n---(13)]]>
Δμ=(zα-zβ)σ2/n---(14)]]>
MSR被表示为检测或实验的动态范围的一个分数
MSR=Δμμmax-μmin=(zα-zβ)σ2/nμmax-μmin---(15)]]>
对于指定MSR和检测参数，最小对应样本大小为
n=2((zα-zβ)σΔμMSR)2---(16)]]>
为了得以理解这种精确测量，设a＝β＝0.05，然后MSR是相对于检测动态范围的最小显著剂量反应，这样
1.当在群体均数反应中没有真实差异时，有95％的机会，z≤za或x1-x2≤zaσ√2/n＝Δμ/2(在样本均数之间没有测量到有显著性差异)，和
2.当μ1-μ2＝Δμ＞0，x1-x2＞Δμ/2(在样本均数之间测量到显著性差异)时，有95％的机会。
因此，MSR的规定和协议参数可使人对最小需要样本大小作出目标保证，以控制剂量反应点测定值的变异性，以致它们不可能重叠(根据我们对α，β的规定)。在图14中，绘制了一族n(MSR)曲线。在E排中平均群体σ＝8.1453×10-2，对于n≈742，可允许7.4％MSR。
在此图解中，I型和II型误差概率的控制与大多数传统的假设检验具有不同的含义，因为它可用作实验精度的测量指标。在抑制剂检测中，I型误差表明产生的重复测量值应答反应在实验设定的控制区间之外。II型误差表明测量到所产生的非重复测量值(不同的抑制剂浓度)应答反应在同一控制区间之内。抑制性反应模型的非线性回归并不能区分这些误差的不同含义；唯一的是它们都可产生数据点的散点和复杂的参数估计。因此，对于包括抑制性反应的实验，建议限制α＝β。
图14是一个曲线族，显示理论上的剂量反应分辨率，σ＝{.02，.04，.06，.08，.1，.12，.14}(上升的(ascending，α＝0.05(I型误差概率)，β＝0.05(II型误差概率))。在这个图表中，所需的细胞数目(y轴)根据被解析的总NFκB转运的分数(x轴)进行标绘。根据本发明得到的测量值的范围在σ＝0.06和σ＝0.08之间(在从底部起的第三和第四根曲线之间)，如表4所示。这些关系可很容易地直观显示改善或下降测量保真度的作用和在细胞数目要求上的分辨率。
样本大小要求：Ding等人[G Ding，P Fischer，R Boltz，J Schmidt，JColaianne，A Gough，R Rubin，和D Oilier。白介素-1和肿瘤坏死因子-α诱导的NFκB核转运的定性和定量(Characterization and quantitation ofNFκB nuclear translocation induced by interleukin-1 and tumor necrosisfactor-α)。Journal of Biological Chemistry，273(44)：28897-28905，1998]报道了用于在成象平台上实施的相似NFκB核转运实验所需要的样本大小要求。为了证明在此报道的技术的优异的细胞测量保真度，表6比较了Ding等人所发表的结果和以表4中的原始测量数据为基础所得的类似计算值以及前面的小节中所述的求导。表6提供了测量指定水平的刺激反应所需要的细胞测量的数目的比较估计值(大约19％FLIN变化，从2％至100％的总转运幅度)作为在95％和99％I型置信区间下的NFκB荧光基团转运的函数(α＝0.05，0.01；β＝0.20)。实验的参数在此被重复以对细胞测量保真度提供直接比较。加入其他的应答反应水平2％-10％和其他的列(α＝β＝0.001)，以进一步证明根据我们发明的结果。在总群体中，采用在Ding等人报道的技术中测量100％的反应(19％转运事件)所需要的细胞的相同数量，在使用我们的发明原理下，可以允许测量大约25％的反应。合理的剂量反应曲线的估计需要20％或更好的分辨率，为了达到在α＝0.05，β＝0.20下的分辨率，采用我们的发明原理需要大约12x更少的测量。
％最大应 Ding 等 本 发 明 Ding 等 本 发 明 本 发 明答反应 (0.05，0.20) (0.05，0.20) (0.01，0.20) (0.01，0.20) (0.001，0.001)2％5％10％20％30％35％45％55％65％70％80％90％100％ 未给出 未给出 未给出 ＞500 388 220 141 99 73 57 45 37 31 3970 640 162 42 ＜30 ＜30 ＜30 ＜30 ＜30 ＜30 ＜30 ＜30 ＜30 未给出 未给出 未给出 ＞500 ＞500 331 213 149 111 86 68 56 47 6445 1039 263 68 31 ＜30 ＜30 ＜30 ＜30 ＜30 ＜30 ＜30 ＜30 24528 3952 1000 256 117 87 54 37 ＜30 ＜30 ＜30 ＜30 ＜30
表6：在控制的误差概率下(I型，II型)，比较本发明所获得的达到总(最大刺激)NFκB转运(19％FL1N变化)的测度百分比(measure percent)所需要的细胞最小数目和Ding等人的报道中所给出的数目。应答反应列给出了测量(18.8％)的整体动态范围的应答反应百分比。对于n≥30，我们的计算假设孔样本均值测量值是高斯分布，通过中心极限定理证明正确。对于n＜30，“学生”t分布(student′s t distribution)是合适的。但为了简单起见，通常测定最少30个细胞。我们的计算假设Δμ＝0.1818，σ线性内插值范围在0.0650(未刺激的)和0.0800(刺激的)之间。
蒙特卡罗(Monte Carlo)反应曲线评估：为了量化测量精度对估计的抑制剂反应参数的直接作用，采用图15中显示的模型反应进行蒙特卡罗模拟，该模型反应显示的理论剂量反应曲线，具有IC50＝8.895×10-5，μmax，μmin和σ由要模拟的测量过程进行指定。对于图15，μmax＝1.0，和μmin＝0.0。带有圆圈的点表示在模拟中使用的11个抑制剂浓度。这11个点是根据抑制剂浓度范围进行对数选择，加入具有偏差σ/√n的高斯随机噪声，产生500个模拟试验结果。图16和17举例说明了模拟数据集，每个都采用高斯-牛顿方程被非线性回归为图15中的模型[见，例如，WH Press，SA Teukolsky，WT Vetterling，和BP Flanncry.NumericalRecipes in C，Second Edition.Cambridge University Press，New York，NY，1992.]。
图16中的屏面比较性地说明了最差情形的模拟剂量反应试验，是对于孔对孔均值FLIN反应，通过经验曲线IC50分布方式所达到的。上面的三个屏面(panels)显示了具有真值(true value)的估计的IC50散布区(scatterplots)。中间的三个屏面是IC50频数柱状图(与表7中5和95百分点值进行比较)。下面的屏面说明了来自总共500个模拟反应的20个估计剂量反应曲线的样本。最左边的三个屏面显示了在本发明的最坏情形中的90％IC50的置信区间，对于整个群体，σ＝0.093。但我们的最差情形是优于最右边的三个屏面(Ding等人)的大约3.62x(更窄)。我们的G1亚群的结果(中间；最坏情形σ＝0.066)利用了这个亚群的同质性(homogeneity)，达到了90％IC50置信区间，具有5.07x的提高。这种模拟的实验参数在表7中给出。
在图17中，最好情形模拟剂量反应试验说明了孔对孔均值FLIN反应的经验曲线IC50分布。显示的是具有真值的估计的IC50散布区(最上面的三个屏面)，IC50频数柱状图(中间的三个屏面；与表7中的5和95百分点值进行比较)，和来自总数500个模拟反应中的20个估计剂量反应曲线的样本(在下面的三个屏面中)。左侧90％IC50的置信区间(发明产生的模拟结果；最好情形的整个群体，σ＝0.040)优于右侧(根据Ding等人所产生的模拟结果)大约8.81x(更窄)。本发明的G1亚群的结果(中间；最好情形，σ＝0.021)利用了这个亚群的同质性，给出了90％IC50置信区间，具有16.3x的优势。这种模拟的实验参数给出在表7中。
反应点估计值的标准误差为0.0093(最坏情形表4中的标准偏差)，0.004(最好条件表4中的标准偏差)和8.354(从Ding等人报道的有统计学显著性的细胞数目计算而来，在表6中重复)；两种标准误差假设n＝100。表7报道了对于所有三种结果的90％蒙特卡罗置信区间宽度，5.8585×10-5，2.4063×10-5和2.1202×10-4，显示在本发明中获得的IC50估计值具有3.62x(最坏情形)和8.81x(最好情形)的更强置信度。在图18和19中显示的进一步模拟证明了IC50估计精度对实验浓度采样的敏感度。
例如，在图18中，剂量反应回归的蒙特卡罗模拟揭示，当实验浓度的范围变小时，IC50估计值对于细胞测量精度逐渐更为敏感。左侧列中的屏面显示了在实验中使用的S形模型，范围从11个浓度(顶端；圆圈)至3个浓度(底部；圆圈)。对本发明(中间列；σ＝0.0665，Δμ＝.18)和Ding等人(右侧列；σ＝83.545，Δμ＝56)的500次操作中的20次，进行图表表示的标绘。
进一步参考图19a和19b，显示了Ding等人(圆圈；σ＝83.545，Δμ＝56)和本发明的IC50蒙特卡罗置信区间宽度(加号；σ＝0.0665，Δμ＝.18)与样本浓度(3，5，7，9，11)的数目的对比。图19b是图19a的放大图象。明显地，由于采样和相关浓度范围的覆盖面的变小，测量精度变得更加重要。图表中的急弯对应于回归中断，显示由本发明的测量精度所维持的稳健回归结果。
标准偏差范围CV IC50 5％ IC50 95％ΔIC500.0930.0400.0660.02183.545[.15，.33][.15，.33][.15，.33][.15，.33][0，55]51％22.2％35.1％11.7％152％ 6.2930×10-5 7.8407×10-5 7.0982×10-5 8.2296×10-5 3.3819×10-5 1.2151×10-4 1.0247×10-4 1.1109×10-4 9.5332×10-5 2.4584×10-45.8585×10-52.4063×10-54.1808×10-51.3036×10-52.1202×10-4
表7：在n＝100的细胞测量中，500次操作的蒙特卡罗模拟剂量反应参数和估计结果，显示了不同测量精度下ΔIC50 90％蒙特卡罗置信区间的变异性。孔到孔的均值FLIN反应标准误差：0.0093(发明；最坏情形的整个细胞群体)，0.0040(发明；最好情形的整个细胞群体)，0.0066(发明；最坏情形G1亚群)，0.0021(发明；最好情形G1亚群)，和8.3545(Ding等人)。
同质亚群分析
为了说明本发明具有有条件地对特殊形态的亚群的相关数量进行估计的能力，已开发了一个经验性确定分类方案，用来从S，M，G2细胞和荧光假象中分离G1细胞。从在Hoechst 33342或DAPI核通道中所采用的那组标准细胞测量规范(表8)中，开发了一种六规则分类程序(表9)。在2500个细胞/孔(排D，E)下对G1亚群重复进行转运实验数据的分析，并在表10中(原始的孔数据)、表11(孔均值的统计)和图20中记录，其中在图20中G1亚群的转运反应被绘成图。排的总和(所有孔平均亚群FLIN反应的平均值)是0.1418(未刺激的)和0.3317(刺激的)。
在减少的±2σ群体区间中，可很清晰地见到细胞反应的改善均一性(将图13中间与图20进行比较)。在均一性上，表9所定义的亚群的反应为整个细胞群体的两倍左右，而平均反应几乎是相同的。孔对孔的变异性与整体群体分析似乎是一致的。
表12记录了NFκB转运实验的样本大小要求，假定测定限制于G1亚群。在20％反应分辨率时，整体群体要求(假定在剂量反应回归中使用最小5个样本)，由42个细胞改善为＜30细胞(减少29％)，α＝0.05，β＝0.20；68改善为＜30(减少56％)，α＝0.01，β＝0.20；以及256至47(减少82％)，α＝0.001，β＝0.001。亚群分析的细胞数量要求较Ding等人报道的数据减少94％(对于20％反应情形，α＝0.05和0.01)。
蒙特卡罗模拟也可采用G1亚群统计来重复。试验参数和数字的IC50 90％置信区间宽度在表7中给出，显示在相同细胞数目n＝100的整体群体分析中区间宽度减少了28.6％-45.8％。比较于基于Ding等人的模拟(如上所述)，显示在最坏情形中有5.07倍的改善，直观参见图16(比较中间列和右侧列)，在最好情形中有16.3倍的改善，直观参见图17。
这些结果表明反应的改善可利用减少所需的扫描区域和保持特定的分辨率(为系统的处理量而优化)而进行，或固定扫描区域，从而固定通过量，但是放弃智能方式下的细胞测量以便选择均匀反应群体，并改善反应分辨率。仅当限定亚群的细胞的份额超过由反应分辨率方程所确定的阈值时，这些优势才可获得。例如，扫描区域可从测量整个群体nF所需的最小数量中被减去，只要
ns<nFfornsnF=σs2σF2<f---(17)]]>
其中f是包括同质亚群的细胞的分数。当此方程为真时，扫描区域可被减去依赖于细胞密度和f的扫描场的一些数量。因此，亚群分析可直接影响系统的通过量，只要存在足够的均匀性和足够大的亚群。同样地，最小显著性反应可以被改善，只要
MSRS-MSRF>0orσS-σFf>0---(18)]]>
这些规则可通过检验图14中的曲线而进行验证。
表8：标准的细胞测量
测量 定义
1 系列号 i
2 核结合盒中心的x坐标 Xb
3 核结合盒中心的y坐标 Yb
4 核结合盒的x尺寸 ΔXb
5 核结合盒的y尺寸 ΔYb
6 核区域 an＝#核象素数
7 根核区域
8 整合核强度In=ΣnI(x,y)]]>
9 平均核强度 In＝In/an
10 最小核强度 P0＝min[In(x，y)]
11 核强度的第5百分点 P5＝5％[In(x，y)]
12 核强度的第25百分点 P25＝25％[In(x，y)]
13 核强度的第50百分点 P50＝50％[In(x，y)]
14 核强度的第75百分点 P75＝75％[In(x，y)]
15 核强度的第95百分点 P95＝95％[In(x，y)]
16 最大核强度 P100＝max[In(x，y)]
17 核强度的四分位数间距 IQn＝P75-P25
18 核强度的变化量
19 核强度的标准偏差 σn
20 核强度的第三中心矩mn,3=(an-I)-1Σn(I(x,y)-I‾n)3]]>
21 核强度的第三中心矩的第
3根
22 核强度的第四中心矩mn,4=(an-I)-1Σn(I(x,y)-I‾n)1]]>
23 核强度的第四中心矩的第
4根
24 核周长 In＝#核象素数(8-连接的)
25 核摆动 W＝In/an
26 标准化核摆动w‾=In/an]]>
27 J通道整合强度 Ij＝∑Ij(x，y)
28 j通道整合核强度In,j=ΣnIj(x,y)]]>
29 j通道整合细胞质强度Ic,j=ΣcIj(x,y)]]>
30 j通道FLIN In，j/(Ic，j+In，j)
表9：根据表8中定义的细胞测定，对G1亚群的六规则规定
规则 效应(细胞特性被排除)
1
核区域是不典型的静息细胞核
31.85
很少或没有NFκB荧光团或很大，明亮的荧光伪
2 105≤Ij≤4×105
象
3 Mn，3＜0 分裂，具有异常的核形或处于死亡中
4 .11≤w≤.2 两个或多个聚集的核或不规则形态的核
5 10≤IQn≤60 不规则的核结构
6 w＜4.8 不规则形状的核
表10：G1亚群的孔方式和排集中(Well-wise and row-pooled)FLINT统计，如表8和表9中分类程序所定义。CV定义为(标准偏差)/均数。这些结果显示，在细胞反应变异性方面有显著性降低，指示了在每孔中的总细胞群体中存在更为均一的反应亚群。参看图20，可见这些数据的直观图示。
孔 n 均值 标准偏差 标准误差 CV D1 D2 D3 D4 D5 D6 D7 D8 D9 D10 D11 D12 53 79 85 128 70 75 88 102 72 114 106 107 0.139494 0.135942 0.142980 0.137386 0.154410 0.153748 0.142782 0.145129 0.153787 0.127378 0.136946 0.131305 0.026964 0.021481 0.029554 0.027846 0.027970 0.027003 0.025264 0.029421 0.025640 0.023832 0.026416 0.025726 0.003704 0.002417 0.003206 0.002461 0.003343 0.003118 0.002693 0.002913 0.003022 0.002232 0.002566 0.002487 0.193301 0.158018 0.206699 0.202687 0.181141 0.175630 0.176942 0.202720 0.166723 0.187094 0.192890 0.195925 D排 1029 0.1406 0.0277 0.0008 0.1969 E1 E2 E3 E4 E5 E6 E7 E8 E9 E10 E11 E12 204 236 257 230 269 255 241 227 290 278 204 162 0.328162 0.330019 0.329866 0.350588 0.349991 0.324779 0.337747 0.327979 0.322116 0.325874 0.331738 0.320942 0.064145 0.058368 0.056664 0.066655 0.060755 0.055980 0.058013 0.060758 0.061913 0.058762 0.064243 0.047253 0.004491 0.003799 0.003535 0.004395 0.003704 0.003506 0.003737 0.004033 0.003636 0.003524 0.004498 0.003713 0.195469 0.176861 0.171778 0.190124 0.173590 0.172363 0.171766 0.185250 0.192207 0.180322 0.193656 0.147232 E排 2853 0.3318 0.0606 0.0011 0.1821
排 均值 标准偏差 标准误差 CV D E 0.1418 0.3317 0.0088 0.0097 0.0026 0.0028 0.0624 0.0295
Table 11：孔亚群平均FLIN(n＝12)的孔-孔统计，如图8和9中的分类程序所规定。FLIN孔标本的均数，标准偏差，标准误差和变异系数在每排中示出。尽管由于在亚群平均数中的参与细胞数量的减少导致标准误差增加，但孔-孔的变异性与表5中所记录的整体群体数据是一致的。参见图20，可见这些数据的直观图示。
％最大反应 Ding 等 人 本发明 Ding等人 本发明 本发明 (0.05，0.20) (0.05，0.20) (0.01，0.20) (0.01，0.20) (0.001，0.001)2％5％10％20％30％35％45％55％65％70％80％90％100％未给出未给出未给出＞500388220141997357453731 624 103 ＜30 ＜30 ＜30 ＜30 ＜30 ＜30. ＜30 ＜30 ＜30 ＜30 ＜30 未给出 未给出 未给出 ＞500 ＞500 331 213 149 111 86 68 56 47 1013 168 44 ＜30 ＜30 ＜30 ＜30 ＜30 ＜30 ＜30 ＜30 ＜30 ＜30 3855 637 168 47 ＜30 ＜30 ＜30 ＜30 ＜30 ＜30 ＜30 ＜30 ＜30
表12：在最大刺激时，解析总NFκB转运百分比所需要的G1亚群细胞的最小数量，在此和[6]中被报道，其误差概率是受控制的(I型，II型)。我们的计算假设Δμ＝0.1818和σ线性内插值范围在0.0267(未刺激的)和0.0542(刺激的)。其他的假设见表6的说明。
图21a和21b举例说明了BIPI化合物A对NFκB核转运的抑制作用。在这些图中，对10×10倍视野扫描区域(图21a)和100个细胞群体(图21b)中所发现的整个细胞群，将核中分段定位强度(FLIN)对抑制剂浓度对比进行标绘。细胞制备如上所述。图21a举例说明了总细胞群分析，以HUVEC细胞中NFκB核转运抑制进行分析，其中Ki(Cmpd_A)＝6.95E-05，Rmax＝3.86E-01，和Rmin＝0.212。图21b举例说明了100个细胞的群体分析，以在HUVEC细胞中NFκB核转运抑制进行分析，其中Ki(Cmpd_A)＝8.09E-05，Rmax＝4.2IE-01，和Rmin＝0.212。
图22a和22b举例说明了BIPI化合物B对NFκB核转运的抑制作用。在这些图中，对10×10倍视野扫描区域(图22a)和100个细胞群体(图22b)中发现的整个细胞群，将核中分段定位强度(FLIN)对抑制剂浓度进行标绘。细胞的制备如上所述。图22a举例说明了总细胞群分析，以HUVEC细胞中NFκB核转运抑制进行分析，其中Ki(Cmpd_B＝5.08E-05，Rmax＝3.77E-01，和Rmin＝0.212。图22b举例说明了100个细胞的群体分析，以HUVEC细胞中NFκB核转运抑制进行分析，其中Ki(Cmpd_B)＝6.65E-05，Rmax＝4.12E-01，和Rmin＝0.212。图23a和23b举例说明了BIPI化合物C对NFκB核转运的抑制作用。对10×10倍视野扫描区域(图23a)和100个细胞群体(图23b)中发现的整个细胞群，核中分段定位强度(FLIN)与抑制剂浓度对比进行标绘作图。细胞的制备如上所述。图23a举例说明了总细胞群分析，以HUVEC细胞中NFκB核转运抑制进行分析，其中Ki(Cmpd_C＝1.01E-06，Rmax＝3.99E-01，和Rmin＝0.212E-01。图23b举例说明了100个细胞的群体分析，以HUVEC细胞中NFκB核转运的抑制进行分析，其中Ki(Cmpd_C)＝1.36E-06，Rmax＝4.20E-01，和Rmin＝0.212.
图24举例说明了BIPI化合物B在G1细胞亚群中对NFκB核转运的抑制作用，其中，G1细胞亚群由表8和表9中定义，是对10×10倍视野扫描区域中发现的整个细胞群，将核中分段定位强度(FLIN)与抑制剂浓度对比进行标绘作图。细胞的制备如上所述。在此图中，G1细胞群分析与HUVEC细胞中NFκB核转运的抑制作用一起显示，其中Ki(Cmpd_B)＝3.70E-05，Rmax＝3.82E-01，和Rmin＝0.212。
化合物Rmax(FLIN)(SE)Rmin(FLIN)(SE)ICso(FLIN)(SE)AA(n＝100)0.386(8.17×10-3)0.421(6.70×10-3)0.212*0.212*6.95×10-5(2.2×10-5)8.09×10-5(1.8×10-5)
BB(n＝100)B(G1)CC(n＝100)0.377(3.63×10-3)0.412(5.85×10-3)0.382(3.28×10-3)0.399(6.90×10-3)0.424(8.96×10-3) 0.212* 0.212* 0.212* 0.212(3.78×10-3) 0.212* 5.08×10-5(6.8×10-6) 6.65×10-5(1.3×10-5) 3.70×10-5(4.1×10-6) 1.02×10-6(1.6×10-7) 1.15×10-6(2.2×10-7)
表13：抑制剂反应参数估计值和标准误差，由非线性回归分析给出。拐折处单位斜率(Unity-slope-at-inflection)S形模型被拟合到7个浓度下的三份重复孔上，以便确定BIPI抑制剂化合物A，B和C的应答反应特性。每个化合物均使用每个孔中在10×10倍视野扫描区域中发现的细胞测量的整个群体来进行评估，也可限制每孔中测量细胞数目为100。Rmin不能单独在化合物A，B中被建立(参见图21a/21b和23a/23b)，这样对于这些化合物，Rmin被固定为0.212(所有化合物具有固定的Rmin，用星号标记)，正如由化合物C的全群体分析所确定的那样。G1亚群应答反应也用于化合物B的测量。细胞的制备如上所述。
抑制剂化合物的分析：在另一个孔板中，细胞用不同浓度的三种抑制剂化合物(A，B和C)处理，然后被分析，以评估NFκB转运的抑制。在这些实验中，测定和比较了在10×10扫描区域中所发现细胞的全部数目和由100个固定细胞所组成的组。所有这些化合物很明显都有反应(图21a-23b)，具有几乎相同的未抑制转运(Rmax)，范围在0.3772-0.4239。化合物A和B不能在最大抑制剂浓度时达到平稳，反应估计值也不能收敛(convergence)，具有一个浮动Rmin参数。化合物C达到最大抑制，Rmin＝0.212(全细胞群)和0.220(100个细胞的细胞群)；随后固定Rmin，以在化合物A和B上达到应答反应收敛。表13总结了由非线性优化计算得到的所有估计应答反应参数(假设在反应模型中有拐折处单位斜率)。对于化合物C，IC50在1.02×10-6-1.15×10-6中进行变化；对于化合物A和B，较大，通过系数来表示，大约范围为32-80倍。
时序分量完成下列事项的所需时间 估计值tplate，M×N扫描M×N板 见方程
twell，Q×RtfieldTI.ktMWtMFtRWtFtTtEtStC扫描孔内的Q×R视野区域对单一视野进行成象合并第k个图象通道在邻近的孔之间移动，对扫描进行设置在邻近的视野之间移动在一个孔内，视野从行末返回聚焦在单一的视野中从照相机中转移图象数据重新配置发射/激发滤光器开放/关闭快门调整照相机参数 见方程 见方程 ≥0.0167s 1.00s 0.30s 0.50s 0.40s 0.11s 0.20s 0.03s 0.10s
表14：扫描速率时序模型分量，包括定义定和估计缺省值。 t1.2 tfield twell，3×3 tplate，8×12 0.0167s 0.5000s 0.9834s 1.4667s 11.65s 16.0s 20.22m 27.18m
表15：系统时序实例，显示依赖于检测和细胞制备方案的典型系统通过量，假定有两个通道扫描，3×3孔扫描区域，96孔板和估计的分量时间列于表14中。亮荧光强度(t1，2＝0.0167s)需要0.9834s/孔和20.22m/板，而暗荧光强度(t1，2＝0.5000s)，可能是由于荧光基团与不太浓的靶结合，需要16.0s/孔和27.18m/板。都假定第二通道为亮核荧光基团，如同初级通道(tI，1＝0.0167s)一样。假设具有足够的联机图象处理能力可以应用，这样通过量受扫描硬件限制。
扫描速率估计值：扫描速率的一个简单模型被分解为板、孔和视野分量
tplate，M×N＝MNtwell，Q×R+(MN-1)tMW (19)
twell，Q×R＝QRtfield+Q(R-1)tMF+(Q-1)tRW (20)
tfield=tS+tF+Σk=1ntI,k+ntT+(n-1)(tE+tC)---(21)]]>
定义和估计值见表14。在这个模型中的假设，包括：(1)孔板(wellplates)以Z字形方式被扫描，(2)孔(wells)被以光栅模式扫描，需要在行之间有一个返回操作(return)，使视野校正(field alignment)最大化，(3)联机处理完全发生在后台，这样系统受扫描硬件限制。
表15中给出了时序实例估计值，在亮和暗(需要整合)第二通道的两种情形下(两个实例都假定了亮初级核通道)，扫描2-通道，具有3×3孔扫描区域的96孔板，对于亮检测，得到11.65s/孔，20.22m/板；对于暗检测，得到16.0s/孔，27.18m/板。这些实例不是针对特殊的应用的，可能需要或多或少的时间，这依赖于参数，但目的是建议扫描速率的范围，该范围对于为图1平台所开发的检测是很典型的。
当将图1平台的扫描速率与其他的成象平台比较时，tF和Q×R是支配因素。由于如上所述的自动聚焦技术的速度，我们发现可达到tF＝0.4s。选择孔扫描区域Q×R，以便使样本大小的成象大到足以适应一些最小显著性反应。由于所需的最小显著性反应(MSR)固定了n值，我们可确定两套系统或检测所需视野采集次数的比例，作为时间效率(TE)加以比较
TE(MSR)=nA(MSR)dBtfield,AnB(MSR)dAtfield,B---(22)]]>
其中A，B是可比较的系统，d是细胞视野密度(细胞/视野)。TE可说明系统所需细胞数量之间的差异，但为了简单，忽略了涉及阶段运动的次数。
比料来自表6的系统的NFκB转运(B是图1的平台)，在α＝0.05，β＝0.20，dB/dA＝0.25，MSR＝20％，使tfield，A/tfield，B在2-6之间变化，得到TE范围是5.95-17.85。尽管该效率比较与在此报道和Ding等人所报道的NFκB转运检测严格相关，但该范围说明相对于Ding等人所描述平台的主要优势是由自动聚焦和图象分割速率所提供的，在图象测量保真度上，这将在其他检测中显示出来(对每一个，都不得不计算特别的TE值)。例如，如果针对图1的平台优化该方法，使第二个通道更明亮，那么在此所述的TE范围的高限将变成可能的，因而可以更好地利用自动聚焦速度。也可通过另外假定的具体细胞/视野密度，将NFκB检测之间的扫描速率比较计算成绝对时间标度。图25显示了，在典型实验条件下，图1平台和Ding等人所使用平台的时间(秒)对MSR(总转运动态范围的百分比)的曲线。
图25是一族曲线，是通过将达到每孔最小显著性反应所需的时间标绘而产生的((MSR)是在最大刺激时总NFκB转运的百分比)。在这些曲线中(最低至最高)，σ＝0.040，图1平台的最好情形；σ＝0.093，图1平台的最坏情形；σ＝0.277＝2.98×0.093，Ding等人的平台，2.98＝测量CV的比例(见表7)。假设：α＝β＝0.05，tfield，Dingetal＝3s，tfield.figure 1 platform＝1.4667s，dDingetal＝40个细胞/视野(10×物镜放大率)，dfigure 1 platform＝10个细胞/视野(20×物镜放大率)。
在药物筛选中达到最小显著性反应的一种自动化工具：如上所述的误差测量可用来预测对于指定的化合物筛选达到所需的最小显著性反应所需的细胞数量。图形用户界面工具可引导用户通过测量对照和测试孔的步骤来确定误差。这种预测工具可允许用户操纵扫描一个板所需的时间，该时间作为细胞群和/或亚群的最小显著性反应的函数。借助这种自动化，该用法可很容易地确定是否使用一个亚群或整个群体，以及达到指定的显著性需要多少时间。然后通过扫描每个孔自动进行扫描，直至所需细胞数量被测量。
现在参考图26a，26b，27，28，和29，以便理解根据本发明的用于执行自动的药物筛选的一种方法。这些图包括图形用户界面(GUI)的屏幕，该界面设计为用户提供选择和设置参数的能力，以采用本发明的原理和函数进行自动药物筛选；它们也包括代表根据本发明的药物筛选的启动和执行的流程图。举例说明的方法展示了功能性，是存在于在图1中说明的高通量平台中，是通过用一系列软件指令对主机110进行编程而实现的。也可以说，这些图举例说明了由一台编程计算机可执行的一种方法。GUI屏幕代表在监视器115上产生的可见输出；它们也代表了识别功能性，可为用户识别药物筛选的参数，可以使用户将这些参数的值输入进主机110中。这些屏幕也被称为“GUI工具”。
现在就这些图而言，图26a，26b和28显示了在执行自动药物筛选之前所进行的用户执行步骤，以便将可控制筛选的参数初始化。用户首先选择可运行许多天或许多周的任何一种检测。NFκB是这种检测的一个实例。然后，通过图26a中显示的GUI工具，将I型和II型误差(方程8-16)输入进主机110中。然后，进行对照实验，以测量FLIC的变异性和幅度。当这些值在手边时，就可通过在图26b中显示的GUI工具输入进主机110中。变异性是FLIC的标准偏差(SD)或变异系数(CV)，幅度百分比的计算是按照100×(最大值-最小值)/(仪器测量范围)进行。最大值和最小值通过细胞针对对照(通常没有化合物，和具有最大刺激化合物)的反应来确定。
然后，通过图1所示的高通量平台进行自动药物筛选。参看图27和29，以便理解如何进行该筛选。首先，采用GUI工具，诸如在图27中显示的，输入筛选参数。如果限制药物筛选的时间是最基本关心的问题，用户可采用GUI工具的时间/板字段来输入每板的期望时间(一般是以分钟的形式)，那么估计的MSR和细胞/孔被自动计算并显示。如果得到的MSR被认为是不合适的，那么用户可根据需要选择缩短或延长时间/板，以便达到所期望的MSR。MSR也依赖于每个图象中的细胞数量，也可由用户使用GUI工具的细胞/图象字段来输入。随着进行药物筛选，实际MSR是所获得的每个图象中的细胞数量的函数。如果达到某种MSR被认为是更为重要的，那么用户可采用GUI工具的MSR字段输入期望MSR，并采用细胞/图象字段来输入细胞的平均数目。然后，自动地计算细胞/孔的值和估计的时间/板，并在GUI工具的相应区域中显示。在这个情形中，实际时间依赖于在细胞/图象字段中的值，图1的高通量平台将获得图象，直至达到期望的MSR。用户也可在细胞/孔字段中输入该值，细胞/图象的平均数目，MSR和时间/板将被自动计算并在相应区域中显示。
图29是流程图，显示图1的高通过量平台在自动扫描中执行的步骤。药物筛选由扫描单个微量滴定板(带有96，384或任何数目的孔)组成，或对于多板扫描，扫描由板机器人传送的一堆微量滴定板。在将一个板置于显微镜载物台上之后(或由机器人装载板)，由用户在步骤2900中启动扫描。然后，平台将板移动至第一个孔上(步骤2910)，进行自动聚焦(步骤2920)，在步骤2930中获得彩色图象(每种颜色代表一种不同的荧光染料，一种不同的荧光染料染色一种不同的细胞分子和/或细胞区室)，在步骤2940中进行图象分割(找到细胞区室的表征码)，在步骤2940中也采用棋盘形铺嵌分开重叠细胞的区室，并在步骤2950中进行测量。在步骤2960中，然后进行测试，以确定是否有足够的细胞已经被测量达到所需的MSR，或者是否已经获得达到所需时间/板的图象数量。如果没有，在步骤2970中，平台移动至同一孔内的视图(图象)的下一个区域，并重复采集和分析步骤。当已经分析了足够的图象时，在步骤2910中，平台将板移动至下一个孔，并重复相同的步骤。当实验中分析完最后一个孔时(步骤2980)，板完成，或者下一块板被自动装载(步骤2990)，或扫描完成。当实验中的所有检测板被分析完，药物筛选就结束了。
棋盘形铺嵌的系统设计考虑事项
O(n log n)Voronoi棋盘形铺嵌算法：参考图30a-30h，本节描述了用于为平面上的随机点集合(a collection of random points in the plane)创建Voronoi棋盘形铺嵌的算法。这些点来自于图象分析程序，该程序可计算来自扫描细胞计数器(scanning cytometer)的各种物体(objects)的位置。这些物体可以细胞核或其他图象。唯一重要的事实是这些物体可由一组由X和Y坐标指定的节点(nodes)来代表。对于细胞，细胞核和其他物体，受让人的美国专利5,548,661和5,790,692描述了图象分割技术，可用来在图象中定位这些物体。一旦这些或其他图象分割技术已经被用来创建象素的表征码(mask)，表征码描述每个物体的目标象素(object pixels)的位置，则可计算代表物体用于棋盘形铺嵌的质心或其他单象素节点。
一个有用的目标是对一个放大的、已分割图象进行棋盘形铺嵌，这样以便每个节点位于其自身的多边形之内。多边形的内部更靠近其节点而不是任何其他的节点。这种棋盘形铺嵌称为沃罗诺伊(Voronoi)棋盘形铺嵌，它可以被直接产生，或从其对偶图(dual graph)，该平面的德洛内三角剖分(Delaunay triangulation)中产生，在其中，节点形成三角形的顶点。参考图30a，显示在平面3001中的一组节点3000。在应用于我们的发明中的棋盘形铺嵌算法中，该平面的四个角3002被作为附属节点加入，得到的一组节点是三角剖分的，显示在图30b中。
许多不同的三角剖分是可能的。在图30c中显示的三角剖分具有“德洛内特性(Delaunay property)”，也就是围绕着每个三角形的圆在其内部不含有节点。在图30c中，这种围绕该中央三角形的圆3008(称为一个“周盘(circumdisk)”)不含有其他节点。每个三角形都有其自身的周盘，没有任何节点位于周盘内部。
注意在图30c中，每个节点是几个三角形的顶点，它们可以是顺时针或逆时针的顺序。通过连接这些三角形的周盘的中心(例如，通过线3010)，人们可以得到一个如图30d中所示的“沃罗诺伊棋盘形铺嵌”。一个沃罗诺伊棋盘形铺嵌是该德洛内三角剖分的对偶。多边形的边是三角形的边的中垂线。该区现在已被划分成围绕每个节点的多边形。每个多边形含有与其节点而不是其他节点更靠近的所有点。要注意的是四个角节点也具有为其分配的多边形。
我们的算法是一种有效的算法，对位于该平面中的节点的任意集合，可以建立德洛内三角剖分(Delaunay triagulation)和沃罗诺伊棋盘形铺嵌(Voronoi tessellation)。根据我们的算法，如果n是节点的数目，那么我们的算法在存储要求上是与n成线性比例的，在时间要求上是与n log n成比例的。这接近于最佳条件。采用我们的算法，我们已经发现，在低于5秒钟之内(in under 5 seconds)，100000个节点可以被进行三角剖分(triangulated)和多边形化(polygonized)，存储要求在35MB(兆字节)的级。100万个节点可在大约75秒之内完成，需要379MB用于存储。所使用的机器是以800MHz运行的Wintel box。
假设计算一组节点的德洛内三角剖分。对此，所需要数据的最小一组如下：
1)节点坐标：每个节点有X和Y坐标，以浮点数(floating pointnumber)储存。进行该事项的最便利方法是为每个节点分配一个整数指标，从0开始，直至n-1，其中n是节点的数目。然后，X和Y坐标被储存在两个大型双精度数组(larger double-precision arrays)中。
2)三角形节点：三个节点的指标构成每个三角形。储存这种数据的最简易方法是为每个三角形分配一个整数指标，从0开始至N-1，其中N是三角形的数目。N大约为2n。然后，人们以三个整数阵列(integer arrays)存储每个三角形的节点，以围绕该三角形的逆时针顺序进行。
储存每个三角形的周盘的中心坐标和半径也是方便的(尽管不是严格需要的)。这些将被存储在由三角标指标所指引的双精度数组中。假设给出某个三角形的三个节点中的每一个的坐标，计算该周盘的中心坐标就是一个简单的线性代数问题。然后由该中心至节点中的任何一个的欧几里得距离(Euclidean distance)给出半径。
接下来，我们要描述一种算法，用于在一遍扫描中有效地发现图中所有多边形的坐标。该算法叙述如下：
1)创建三角形指标的目录的阵列，每个节点对应一个目录。这样，目录的阵列将由节点指标进行指引。
2)对于每个三角形，获得它的三个节点指标。对这些节点的每一个，存在一个目录。将三角形指标加入至这三个目录中的每一个上。
3)为了构造任何节点的沃罗诺伊多边形(Voronoi polygen)，获得三角形的节点的目录。通过计算每个三角形的周盘中心和该节点形成的角度，逆时针顺序排列目录，然后以递增顺序进行排序。周盘中心，以这种方式安排，形成了该节点的沃罗诺伊多边形的顶点。
所有上述这些可容易地采用标准模板库(Standard Template Library，STL)部件予以实施。坐标和三角形的节点可储存在双精度型和整型向量中(in vectors of doubles and integers)。目录的阵列可以被实施为整数向量的一个向量。为了最小化存储量，向量应该被提前采用向量组的反向()方法进行大小调整。例如，坐标阵列应该含有n个保留的项目。三角形的节点阵列应该含有N个保留的项目。目录的阵列应该含有n个保留的目录，每个目录含有8个保留的项目。一个节点含有超过8个的三角形是很少见的；在少数情况下，一个节点含有8个以上，STL向量将自动地重新调整它自己的大小。这种算法及时地与节点的数目成线性比例，它比三角剖分算法执行地要快得多。
我们现在来描述一种用于将包含在某个矩形中的一组节点进行三角剖分的迭代法(iterative method)。在每个阶段，假定一个针对k个节点的有效德洛内三角剖分，然后加入下一个节点，边被重新排列，以便得到一个针对K+1节点的德洛内三角剖分(Delaunaytriangulation)。
初始地，构造所含三角形的四个角节点的德洛内三角剖分。这在图30e中显示。关于一个矩形的四个角的德洛内三角剖分，该相同圆周围绕这两个三角形，它的中心是在对角线的中点。现在可以认为成功地三角剖分了一个由k个节点构成的集合，并且我们希望加入下一个节点。假设新的节点位于已存在三角剖分的内部。由于该描述是起始于一个边界框(bounding box)，因此这是一种可靠假设。
修饰该网格的算法是在图30f中图解说明的：
1)找到其周盘含有该新节点的所有三角形的置位。这些三角形将不得不被删除，由于一个有效的德洛内三角剖分从来不含有一个其周盘含有节点的三角形。
2)这些三角形的合并形成一个含有该新节点的多边形。删除所有包含在这个多边形的内部的三角形的边。
3)创建新边，这些新边将该新节点连接到这个多边形的顶点的每个之上。
节点3050是被插入的新节点。它包含在四个以前存在的三角形的周盘中，含有总共6个节点3051。对连接节点3051的6个外部边不予处理。由虚线所表示的三条内部边被删除。建立6条新边(黑的实线)，每个连接新节点3050到外部节点的一个之上。经过构造，新三角形的每一个的周盘与该新节点交叉，并且该新节点不是在任何其他的周盘的内部。因此，该新的三角剖分仍是德洛内型的。该运算已经增加总节点计数一个，增加总三角形计数两个，增加总边数计数三个。这种计算对加入三角剖分的每个节点都是有效的。因此，最终网格将具有大约2n个三角形和3n条边，其中n是节点的数目。要注意的是初始网格具有4个节点，2个三角形，和5个边。因此，准确的结果是网格将含有2n-6个三角形和3n-7条边。
至此，我们仅在上面大体地描述了该算法。一个完整的描述需要对数据结构和执行这些步骤所需步骤的详细说明。最简单的工序是使用没有新数据的结构。然后，步骤(1)可通过对所有三角形的蛮力搜索(brute-force search)而实施。其周盘含有新节点的每个三角形被加入至一个目录中。在实践上，该目录是很小的；它几乎经常含有小于10个的项目。然后，迅速地进行步骤(2)和(3)。但是，在步骤(1)中的蛮力搜索需要对每个三角形进行运算，这大约是节点数目的两倍。由于蛮力搜索方法需要搜索每个节点，对网格进行三角剖分的时间需要n2级的运算，这是相当不利的。
迄今描述的算法已知为沃森算法(Watson′s algorithm)，自20世纪70年代就已存在。在下一节中，我们描述了对这种算法的改进，这充分地加速了该三角剖分过程，用于大型网格(large meshes)。
当含有欲被插入的新节点的所有周盘被查找时，存在于上面所述的三角剖分方案中的瓶颈就会发生。如果甚至查找到了一个其周盘中含有新节点的三角形，那么该搜索就被限制在最临近的相邻节点处(nearest neighbors)，这本来将充分地增加效率。所以，该问题可以归纳为查找其周盘含有该新节点的第一个三角形。
我们优选的解决方案是使用所谓的“扫描线(sweepline)”法。一种用于计算沃罗诺伊棋盘形铺嵌的扫描线算法，是由S.Fortune在1987年发表的。我们的算法使用了类似用于计算德洛内三角剖分的某些概念。这种想法在于以X坐标的递增顺序分类节点。通过在Y坐标上分类本有可能结(ties)。由于我们假设所有(x，y)对是独特的，这就为要被插入的节点规定了一个独特的次序关系。然后，采用上述的算法，我们以这种顺序插入节点，但是现在使用智能搜索而不是蛮力搜索。人们可以想象一条垂线，从左侧扫描至右侧。任何时候，该垂线位于最近刚插入的X坐标处。在该线左侧的所有节点都已经被插入；而在右侧的所有节点都没有被插入。
蛮力扫描线算法在三角形的目录中向后搜索。这个目录将在该目录的尾部含有最近插入的三角形。如果算法在目录的尾部开始，它将搜索最右边的三角形，并将可能迅速地找到一个三角形，它的周盘中含有要被插入的下一个节点。这个简单的解决方案效果很好，将三角剖分时间降低至n log n级。但有一个更快速的搜索算法，它也是相当简单的，所以我们将在这里描述它。
更快的搜索算法依赖于这样的事实，即节点是被插入到一个矩形内部的，它是要被首先三角剖分的。这样，网格的右侧由大量的长的、小三角形组成，这些三角形在右侧含有两个角节点中的一个，或者是东北节点或者是东南节点。我们的扫描线算法在图30g中举例说明。在这个图中，四个角节点规定了该区域的最大范围，并首先被三角剖分。在该矩形内部的节点3062已经被从左向右插入。有阴影的区域3065代表了已经被插入的大量(可能有百万个)节点。垂直扫描线3070标明了分界线。在其左侧，所有节点都已经被插入进网格中。在其右侧，没有节点被插入。红的节点在目录中是下一个节点。由于它位于扫描线的右侧，它必须位于长的小三角形中的一个之中，三角形含有东北节点3060n或东南节点3060s(或它可以位于同时含有东北节点和东南节点的大“中心三角形”中)。大概有sqrt(n)个长的小三角连接到角节点。我们把这些分为两个目录，“东北目录(northeast list)”和“东南目录(southeast list)”，并通过它们下边缘的斜率来分类它们。然后，要被插入的节点将或者位于中心三角形之中，或者采用对分搜索(binary search)，它能迅速定位于这些目录的之一中。执行这一搜索的时间是log(sqrt(n))级。应该清楚的是，三角剖分所有节点的时间是nlog(sqrt(n))级。技术上，这仍然是n log n级，但应该清楚的是：运算计数是相当小的。
我们已经实现了这种算法，它的性能自始至终是n log n级，直到50万个节点，(其可以在不到30秒中进行三角剖分)。我们看到对于一百万个节点需要更多一点的时间，但原因是不清楚的。我们预计具有尽可能迅速的制作100000个节点的网格的需要。目前的实施可以在不到5秒钟内创建该网格。我们预期：通过调整代码，这一点可以被减少10至20％。
我们现在描述了：一旦采用上述给出的算法发现了第一个三角形，如何完成其周盘含有要被插入节点的三角形的目录。针对这一点的解决方案需要簿记(bookkeeping)。这种想法是所有这些三角形都是邻接的。这样，一旦发现了第一个，人们仅需要以一定顺序搜索所有最临近的相邻节点(neighbors)，直至排除所有的可能性。这可以以递归操作来实现。
首先，我们创建含有所有三角形的指标的STL置位，其中三角形的周盘含有新节点。我们用发现的第一个三角形对它进行初始化，然后调用一种检测该三角形的方法，并递归式检查它的三个相邻节点。如果一个三角形已经在该置位中，或者它的周盘不含有节点，则递归停止。我们在实验中发现这些集合趋向变小，使用STL向量实际上更快捷，以便避免插入进集合的代价。该效应是速度提高大约12％。
接下来，每个三角形的邻近三角形必须被发现。完成这一点的最简单方法是对该三角形的每条边在其右侧保持一个映射，如图30h中所显示。在这个图中，阴影三角形3080的三个节点，N1，N2，和N3确定了这些边，以逆时针方向围绕在三角形周围。已排序对(N1，N2)在其右侧被映射到三角形3082的指标上。同样地，已排序对(N2，N1)被映射到阴影三角形3080上。
完成该映射的最简单方法是规定一个STL映射，它使一对整数(节点指标)求助于第三个整数(三角形的右侧指标)。但是，对于大型网格，存储要求是相当巨大的。而且，这是相对很慢的。人们应该记有许多条边。对于该网格中的每个节点，有大约6条定向边。
进行该映射的一个更容易的方法是制作这些映射的STL向量。通过节点指引这个向量。这个想法是：在网格中的每个节点指向几个其它节点(平均而言，6个其它节点)。这样，在向量中的每个项目将是一个整数到一个整数的映射，将节点指标映射成三角形指标。这较整数对到整数的映射更为充分有效。
但是，甚至更好的结果是可以获得的。整数与整数的映射仍是低效率的，因为主操作(main operations)是插入和删除项目。用整数对的向量替换它们是更快和更加空间有效的。在整数对中的第一个项目是节点指标；在整数对中的第二个项目是三角形指标。这样，我们的数据结构是整数对向量的一个向量。必须使用RESERVE法(MicrosoftVisual C++中的一个函数)来为向量分配一个合理量的空间。否则，STL将为每个向量分配几个kB，存储要求将是奇异的。
在共同使用STL时，这是一个普遍的主题。小集合(或小映射)不象小向量(或小向量对)那样有效。集合和映射更便于程序设计员进行工作，但是当你在处理少数项目(items)时，它们只是无法匹配向量的效率。通常，这没什么关系。但是，当有人试图优化内部循环(innerloop)时，用向量替换集合是有意义的，只要给向量保留一个小量空间即可。如果需要，那么STL向量将自动生长，但是最好使其作为罕见事件。在我们的实例中，节点一般平均有6个相邻节点，有8个相邻节点是不常见的，超过8个相邻节点是罕见的。