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1、(10)申请公布号 CN 103760144 A (43)申请公布日 2014.04.30 CN 103760144 A (21)申请号 201410022545.2 (22)申请日 2014.01.17 G01N 21/64(2006.01) (71)申请人 深圳职业技术学院 地址 518055 广东省深圳市南山区西丽深圳 职业技术学院 (72)发明人 刘冬 孙海燕 万红霞 李艳 从彦丽 唐旭蔚 (74)专利代理机构 厦门南强之路专利事务所 ( 普通合伙 ) 35200 代理人 马应森 (54) 发明名称 一种基于 Caco-2 细胞模型的抗氧化剂抗氧 化活性定量评价方法 (57) 摘要 一。
2、种基于 Caco-2 细胞模型的抗氧化剂抗 氧化活性定量评价方法， 涉及抗氧化剂。利用 Caco-2 细胞模型， 通过优化细胞的接种浓度和培 养时间， 荧光探针 （2,7- 二氯荧光黄双乙酸盐， 简称 DCFH-DA） 、 自由基引发剂 （2,2 - 偶氮二异丁 基脒， 简称 AAPH） 和抗氧化剂纯品与 Caco-2 细胞 的孵育条件， 建立一种基于 Caco-2 单层细胞模型 的抗氧化剂抗氧化活性细胞学定量评价方法， 具 有生物相关性高、 简单、 快速的优点， 为生物抗氧 化剂的研究提供一个有效的分析评价工具。 (51)Int.Cl. 权利要求书 2 页 说明书 8 页 附图 1 页 (1。
3、9)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书2页 说明书8页 附图1页 (10)申请公布号 CN 103760144 A CN 103760144 A 1/2 页 2 1. 一种基于 Caco-2 细胞模型的抗氧化剂抗氧化活性定量评价方法， 其特征在于包括 以下具体步骤 ： 1） 将 100 200L 的 Caco-2 单细胞悬浮液按 1104 1105个细胞 / 孔的浓度接种 至透明平底黑色 96 微孔细胞培养板中培养 ； 2） 将步骤 1） 的 96 微孔板中生长培养基移出， 用 100 200L1PBS 清洗贴壁细胞 ； 3） 用含有 20 100M DCFH-DA。
4、 的抗氧化剂处理培养基配制 6 个不同浓度的抗氧化剂溶 液 ； 4） 将步骤 3） 得到的抗氧化剂溶液 100 200L 加入步骤 1） 的 96 微孔板中， 记为样品 孔， 孵育， 对照孔和空白孔为只含有20100M DCFH-DA的抗氧化剂处理培养基处理的细胞 孔， 每个样品、 对照和空白各 3 个重复孔 ； 5） 将步骤 4） 的 96 微孔板中溶液移出， 用 100 200L1PBS 清洗贴壁细胞 ； 6） 向步骤 5） 的样品孔和对照孔中加入 100 200L 含有 200 800M AAPH 的氧化剂处 理培养基， 空白孔加入 100 200L 氧化剂处理培养基 ； 7） 用荧光酶。
5、标仪测定步骤 6） 中 96 微孔板中各孔的荧光强度 ； 8） 根据步骤 7） 做出各样品孔和对照孔荧光强度时间曲线， 计算各种抗氧化剂的细胞 学抗氧化活性， 用槲皮素作标准品， 各抗氧化剂样品的细胞学抗氧化活性值用 mol 槲皮素 当量 /100g（或 mol） 样品表示。 2. 如权利要求 1 所述一种基于 Caco-2 细胞模型的抗氧化剂抗氧化活性定量评价方 法， 其特征在于在步骤 1） 中， 所述 Caco-2 单细胞悬浮液悬浮在生长培养基中 ； 所述 Caco-2 单细胞在 10 40 代之间 ； 所述生长培养基的配方可为 ： 高糖 DMEM 中含有 10% 胎牛血清、 10mMHe。
6、pes 缓冲液、 1% 非必需氨基酸、 100U/mL 青霉素和 100g/mL 链霉素 ； 所述培养的条件 可在 37， 5%CO2培养 12 48h。 3.如权利要求1所述一种基于Caco-2细胞模型的抗氧化剂抗氧化活性定量评价方法， 其特征在于在步骤 2） 中， 所述用 100 200L1PBS 清洗贴壁细胞是清洗 1 2 次。 4.如权利要求1所述一种基于Caco-2细胞模型的抗氧化剂抗氧化活性定量评价方法， 其特征在于在步骤3） 中， 所述抗氧化剂处理培养基的配方为含10mM Hepes的DMEM培养基， 所使用的 DCFH-DA 为溶解于甲醇中配制成的 20mM DCFH-DA 贮。
7、液， 分装并贮存于 -20 ； 抗 氧化剂样品使用前需用抗氧化剂处理培养基进一步进行稀释成不同的浓度梯度， 若抗氧化 剂样品需用DMSO或甲醇溶解， 则其终溶液中DMSO或甲醇含量0.5%， 若抗氧化剂样品需用 去离 子水溶解， 则其终溶液中去离子水用量 5%。 5.如权利要求1所述一种基于Caco-2细胞模型的抗氧化剂抗氧化活性定量评价方法， 其特征在于在步骤 4） 中， 所述孵育的条件为 37， 5%CO2孵育 10 60min。 6.如权利要求1所述一种基于Caco-2细胞模型的抗氧化剂抗氧化活性定量评价方法， 其特征在于在步骤 4） 中， 所述样品、 空白和对照在 96 微孔板中的分布。
8、如表 1 所示 ： 表 1 权 利 要 求 书 CN 103760144 A 2 2/2 页 3 其中， Bla空白孔 （blank） ； Contr对照 （control） ； S- 样品 （sample） ； S1样品 1 ； Sii样品 i 的第 i 个浓度 ； B96 孔板周边无细胞孔， 为减少误差， 周边孔不作为实验孔。 7.如权利要求1所述一种基于Caco-2细胞模型的抗氧化剂抗氧化活性定量评价方法， 其特征在于在步骤 5） 中， 所述用 100 200L1PBS 清洗贴壁细胞是清洗 1 2 次。 8.如权利要求1所述一种基于Caco-2细胞模型的抗氧化剂抗氧化活性定量评价方法， 。
9、其特征在于在步骤 6） 中， 所述氧化剂处理培养基的组成为含 10mM Hepes 的 HBSS 缓冲液 ； 所使用的 AAPH 为溶解于水中配制成 200mM AAPH 贮液， 分装并贮存于 -40。 9.如权利要求1所述一种基于Caco-2细胞模型的抗氧化剂抗氧化活性定量评价方法， 其特征在于在步骤 7） 中， 所述用荧光酶标仪测定步骤 6） 中 96 微孔板中各孔的荧光强度持 续测定60120min， 每5min读数1次， 测定条件 ： 37， 激发波长485nm， 发射波长538nm。 10. 如权利要求 1 所述一种基于 Caco-2 细胞模型的抗氧化剂抗氧化活性定量评价方 法， 其。
10、特征在于在步骤 8） 中， 所述细胞学抗氧化活性值的计算方法如下 ： 根据步骤 7） 样品孔和对照孔的各测定时间点荧光值减去空白孔荧光值后， 做出各样品 孔和对照孔荧光强度时间曲线， 积分荧光曲线下面积， 作出 AUC样品浓度曲线， 用 AUC 计算抗氧化剂的 EC50值， EC50是抗氧化剂样品在 Caco-2 细胞内对自由基抑制活性达到 50% 效果时的有效浓度 ； 权 利 要 求 书 CN 103760144 A 3 1/8 页 4 一种基于 Caco-2 细胞模型的抗氧化剂抗氧化活性定量评 价方法 技术领域 0001 本发明涉及抗氧化剂， 尤其是涉及一种基于 Caco-2 细胞模型的抗。
11、氧化剂抗氧化 活性定量评价方法。 背景技术 0002 流行病学和临床实验研究已证明， 人体自由基过剩是引发心血管病、 癌症和衰老 等慢性退行性疾病的重要因素， 而饮食摄入和补充抗氧化剂是预防这些疾病的有效途径。 因此， 对抗氧化剂的抗氧化活性进行评价一直是营养保健食品研究的热门领域。迄今抗氧 化剂活性评价方法主要包括体外化学分析法、 动物实验法和人体试食试验法三大类。体外 化学方法操作简单、 快速、 分析成本低， 但测定结果不能真实反映抗氧化剂在体内的抗氧化 能力， 因为体外化学法是在试管化学分析的基础上建立的， 没有考虑到抗氧化剂在体内的 消化、 吸收和代谢特性。动物实验法或人体试食法可真实。
12、反映抗氧化剂在体内的实际抗氧 化能力， 但是这些方法评价时间长， 耗药量大， 评价成本高， 不适用于抗氧化剂筛选研究的 初始阶段。 因此， 建立一种简单、 快速和高生物相关性的抗氧化活性体外定量评价方法是抗 氧化研究领域亟待突破的关键科学问题。 0003 2007年康奈尔大学Wolfe and Liu （Wolfe,K.L.;Liu,R.H.Cellular antioxidant activity(CAA)assay for assessing antioxidants,foods,and dietary supplements. J.Agric.Food Chem.2007,55(22),。
13、8896-8907） 建立了一种基于人肝癌细胞 HepG2 模型的 细胞学抗氧化活性 （CAA） 定量分析方法， 用来检测抗氧化剂的抗氧化活性。该方法的问题 在于所选用细胞模型不能反映抗氧化剂在肠道的吸收特性， 且迄今未见该方法的生物相关 性研究报道。 因此， 测定结果是否能预测抗氧化剂在体内的实际功效仍然存在很大的疑问。 2008 年加拿大 NIS 实验室 Jensen（Jensen,G.S.Cell-based antioxidant protection assay.U.S.Provisional patent application.60/985,166） 建立了基于人血液红细胞模 型。
14、的抗氧化活性评价方法， 由于每次测定前都要收集和制备人血红细胞， 操作过程复杂， 限制了其实用价值。2009 年魁北克大学 Girard-Lalancette 等 （Karl Girard-Lalancett e;AndrPichette;Jean Legault.Sensitive cell-based assay using DCFH oxidation for the determination of pro-and antioxidant properties of compounds and mixtures:Analysis of fruit and vegetable juice。
15、s.Food Chem.2009,115,720726） 建 立了基于小鼠成纤维母细胞瘤 （L929） 细胞模型的抗氧化分析方法， 将测定点设置在自由基 作用于细胞 90 分钟这一时间点， 因而方法重复性差， 误差较大。 0004 大量研究证明， 来源于人结肠腺癌 Caco-2 细胞株， 其细胞形态学、 标志酶、 体外培 养条件下形成的微绒毛结构以及紧密连接和渗透特征等均与小肠上皮细胞类似， 利用该细 胞的单层模型进行药物体外吸收特性研究与药物口服在小肠中的吸收过程有良好的相关 性， 因此 Caco-2 细胞模型被认为是一种预测药物吸收的有效体外工具。目前已被广泛用于 药物和营养物质体外吸收、。
16、 代谢特性研究。目前国内外还未见有关利用该细胞模型建立一 说 明 书 CN 103760144 A 4 2/8 页 5 种抗氧化活性体外定量分析方法的研究报道。 发明内容 0005 本发明的目的在于提供一种基于 Caco-2 细胞模型的抗氧化剂抗氧化活性定量评 价方法。 0006 本发明包括以下具体步骤 ： 0007 1） 将 100 200L 的 Caco-2 单细胞悬浮液按 1104 1105个细胞 / 孔的浓度 接种至透明平底黑色 96 微孔细胞培养板中培养 ； 0008 2） 将步骤 1） 的 96 微孔板中生长培养基移出， 用 100 200L1PBS 清洗贴壁细 胞 ； 0009 。
17、3） 用含有 20 100M DCFH-DA 的抗氧化剂处理培养基配制 6 个不同浓度的抗氧化 剂溶液 ； 0010 4） 将步骤 3） 得到的抗氧化剂溶液 100 200L 加入步骤 1） 的 96 微孔板中， 记为 样品孔， 孵育， 对照孔和空白孔为只含有20100M DCFH-DA的抗氧化剂处理培养基处理的 细胞孔， 每个样品、 对照和空白各 3 个重复孔 ； 0011 5） 将步骤 4） 的 96 微孔板中溶液移出， 用 100 200L1PBS 清洗贴壁细胞 ； 0012 6） 向步骤 5） 的样品孔和对照孔中加入 100 200L 含有 200 800M AAPH 的氧化 剂处理培。
18、养基， 空白孔加入 100 200L 氧化剂处理培养基 ； 0013 7） 用荧光酶标仪测定步骤 6） 中 96 微孔板中各孔的荧光强度 ； 0014 8） 根据步骤 7） 做出各样品孔和对照孔荧光强度时间曲线， 计算各种抗氧化剂的 细胞学抗氧化活性， 用槲皮素作标准品， 各抗氧化剂样品的细胞学抗氧化活性值用 mol 槲 皮素当量 /100g（或 mol） 样品表示。 0015 在步骤 1） 中， 所述 Caco-2 单细胞悬浮液悬浮在生长培养基中 ； 所述 Caco-2 单细 胞在 10 40 代之间 ； 所述生长培养基的配方可为 ： 高糖 DMEM 中含有 10% 胎牛血清 （FBS） 、。
19、 10mM Hepes 缓冲液、 1% 非必需氨基酸、 100U/mL 青霉素和 100g/mL 链霉素 ； 所述培养的条件 可在 37， 5%CO2培养 12 48h。 0016 在步骤 2） 中， 所述用 100 200L1PBS 清洗贴壁细胞可清洗 1 2 次。 0017 在步骤3） 中， 所述抗氧化剂处理培养基的配方可为含10mM Hepes的DMEM培养基， 所使用的DCFH-DA为溶解于甲醇中配制成的20mM DCFH-DA贮液， 分装并贮存于-20； 抗氧 化剂样品使用前需用抗氧化剂处理培养基进一步进行稀释成不同的浓度梯度， 若抗氧化剂 样品需用DMSO或甲醇等有机溶剂溶解， 则。
20、其终溶液中DMSO或甲醇等有机溶剂含量0.5%， 若抗氧化剂样品需用去离子水溶解， 则其终溶液中去离子水用量 5%。 0018 在步骤 4） 中， 所述孵育的条件可为 37， 5%CO2孵育 10 60min ； 0019 所述样品、 空白和对照在 96 微孔板中的分布可如表 1 所示 ： 0020 表 1 说 明 书 CN 103760144 A 5 3/8 页 6 0021 0022 其中， Bla空白孔 （blank） ； Contr对照 （control） ； S- 样品 （sample） ； S1样品 1 ； Sii样品 i 的第 i 个浓度 ； B96 孔板周边无细胞孔 （为减少误。
21、差， 周边孔不作为实验 孔） 。 0023 在步骤 5） 中， 所述用 100 200L1PBS 清洗贴壁细胞可清洗 1 2 次。 0024 在步骤 6） 中， 所述氧化剂处理培养基的组成可为含 10mM Hepes 的 HBSS 缓冲液 ； 所使用的 AAPH 为溶解于水中配制成 200mM AAPH 贮液， 分装并贮存于 -40。 0025 在步骤 7） 中， 所述用荧光酶标仪测定步骤 6） 中 96 微孔板中各孔的荧光强度可持 续测定 60 120min， 每 5min 读数 1 次， 测定条件 ： 37， 激发波长 485nm， 发射波长 538nm。 0026 在步骤 8） 中， 所。
22、述细胞学抗氧化活性值的计算方法如下 ： 0027 根据步骤 7） 样品孔和对照孔的各测定时间点荧光值减去空白孔荧光值后， 做出各 样品孔和对照孔荧光强度时间曲线， 积分荧光曲线下面积 （AUC） ， 作出 AUC样品浓度曲 线， 用 AUC 计算抗氧化剂的 EC50值 （EC50是抗氧化剂样品在 Caco-2 细胞内对自由基抑制活 性达到 50% 效果时的有效浓度） ； 0028 0029 本发明利用 Caco-2 细胞模型， 通过优化细胞的接种浓度和培养时间， 荧光探针 （2,7- 二氯荧光黄双乙酸盐， 简称 DCFH-DA） 、 自由基引发剂 （2,2 - 偶氮二异丁基脒， 简称 AAPH。
23、） 和抗氧化剂纯品与Caco-2细胞的孵育条件， 建立一种基于Caco-2单层细胞模型的抗 氧化剂抗氧化活性细胞学定量评价方法， 具有生物相关性高、 简单、 快速的优点， 为生物抗 氧化剂的研究提供一个有效的分析评价工具。 0030 与现有技术比较， 本发明具有以下优点和技术效果 ： 0031 由于本发明选用的细胞模型是人结肠腺癌 Caco-2 细胞株， 其结构和许多功能均 与小肠上皮细胞类似， 由于具有抗氧化活性的食品都是经过口服途径进入人体， 小肠上皮 细胞的屏障和吸收特性是影响抗氧化剂发挥功效的首要因素， 因此选择 Caco-2 细胞株建 立抗氧化活性分析方法可反映出在作用于体内药物靶点。
24、前抗氧化剂的肠道吸收特性， 具有 独特的优点。本发明利用 Caco-2 细胞模型建立的简单、 高效的生物抗氧化剂细胞学抗氧化 活性分析方法， 并研究新方法的生物相关性， 目的在于为生物抗氧化剂的研究提供一个有 效的分析评价工具。 说 明 书 CN 103760144 A 6 4/8 页 7 附图说明 0032 图 1 本发明的技术原理和技术路线。 具体实施方式 0033 实施例 1 抗氧化剂纯品细胞学抗氧化活性测定 0034 1） 将 100L 的 Caco-2 单细胞悬浮液按 5104个细胞 / 孔的浓度接种至透明平底 黑色96微孔板中， 37， 5%CO2培养24h ； 其中人体结肠腺癌细。
25、胞Caco-2购自美国American Type Culture Collection(ATCC)， 作为评价抗氧化剂抗氧化活性的细胞株 ； 0035 2） 将步骤 1） 的 96 微孔板中生长培养基移出， 用 150L1PBS 清洗贴壁细胞 1 次 ； 0036 3）用含有 60M DCFH-DA 的抗氧化剂处理培养基分别配制不同浓度的槲皮素、 (-)- 表没食子儿茶素没食子酸酯、 白藜芦醇、 高良姜素、 山萘酚、 毛地黄黄酮、 根皮素、 槲皮 素 -3-G、 二氢槲皮素、 L- 抗坏血酸、 芦丁、 咖啡酸、 没食子酸、 L- 谷胱甘肽、 (+)- 儿茶素、 (-)- 表儿茶素、 阿魏酸和根。
26、皮苷等 18 种抗氧化剂纯品溶液 ； 0037 4） 将步骤 3） 的 100L 各溶液加入各 96 孔板细胞孔中 （记为样品孔） ， 将 100L 只含 DCFH-DA的抗氧化剂处理培养基分别加入到对照孔和空白孔中， 每种浓度3个重复， 在37 培养箱中与细胞共孵育 20min ； 0038 5） 将步骤 4） 的 96 微孔板中溶液移出， 用 150L1PBS 清洗贴壁细胞 1 次 ； 0039 6） 向样品孔和对照孔中加入100L含有500M AAPH的氧化剂处理培养基， 空白孔加 入 100L 氧化剂处理培养基 ； 0040 7） 立即用Spectra Max M2多功能酶标仪测定步骤。
27、6） 的96微孔板中各孔的荧光强 度， 持续测定 90min， 每 5min 读数 1 次。测定条件 ： 37， 激发波长 485nm， 发射波长 538nm ； 0041 8） 18 种抗氧化剂的细胞学抗氧化活性值见表 2。 0042 表 218 种抗氧化剂纯品细胞学抗氧化活性值 说 明 书 CN 103760144 A 7 5/8 页 8 0043 0044 注 ： NQ测不出细胞学抗氧化活性值。 0045 实施例 2 水果细胞学抗氧化活性测定 0046 与实施例 1 步骤相似， 测定了蓝莓和苹果的细胞学抗氧化活性分别为 6.80.4molQE/100g 鲜果和 1.80.1mol QE/。
28、100g 鲜果。 0047 实施例 3 基于 Caco-2 单层细胞模型的抗氧化剂抗氧化活性定量评价方法的生物 相关性分析 0048 1） SPF 级雄性 SD 大鼠， 体重 200 250g （约 8 9 周龄） ， 温度 22 25， 相对湿 度 65% 75%， 适应喂养一周， 按体重随机分为样品组和对照组， 每组 6 只， 实验前禁食 12h， 自由饮水 ； 0049 2） 样品组用 0.2mmol/kgbw（bw 是体重 body weight 缩写） 的抗氧化剂纯 品 （溶解于玉米油中） 一次性灌胃 SD 大鼠， 灌胃体积为 1mL/100g。对照组用溶剂玉米油灌 胃 ； 0050。
29、 3） 分别在灌胃前和灌胃后 1、 2、 4、 6、 8、 10h 经尾尖采血， 置于肝素抗凝的试管中， 离心 3500r/min， 10min， 分离血浆 ； 说 明 书 CN 103760144 A 8 6/8 页 9 0051 4） 用氧化自由基吸收能力法 （Oxygen Radical Absorbance Capacity， ORAC） 测定 各抗氧化剂纯品血浆的 ORAC 值 ； 0052 抗氧化剂纯品血浆的 ORAC 值用 （平均值 SD） mol TE/mol/kg b w 表示， 计算公 式如下 ： 0053 ORAC 值 =(AUC样品-AUC+AAPH)/(AUCTrol。
30、ox-AUC+AAPH)( 摩尔浓度 Trolox/ 摩尔浓度样 品)100 0054 ORACi=(ORACsi-ORACs0-ORACbi) 0055 其中 ORACi为第 i 个采血时间的 ORAC 值， ORACsi为样品组第 i 个采血时间的 ORAC 值， ORACs0为样品组灌胃前采血的 ORAC 值， ORACbi为对照组第 i 个采血时间的 ORAC 值。 0056 5） 以最大 ORACi值作为各样品血浆的 ORAC 值 （见表 3） ， 与 CAA 值进行相关性分析。 0057 在步骤 2） 中的样品选用了实施例 1 所测定的槲皮素、 高良姜素、 山萘酚、 毛地黄黄 酮、。
31、 (-)- 表没食子儿茶素没食子酸酯、 根皮素、 槲皮素 -3-G、 白藜芦醇、 二氢槲皮素、 L- 抗坏 血酸、 芦丁、 咖啡酸、 没食子酸、 L- 谷胱甘肽、 (+)- 儿茶素、 (-)- 表儿茶素、 阿魏酸、 根皮苷共 18 种抗氧化剂纯品。 0058 对表 2 各抗氧化剂的细胞学抗氧化活性值和表 3 的 ORAC 值之间进行相关性统计 分析， 得出 R2=0.444 （p0.01） ， 说明基于 Caco-2 细胞模型的抗氧化活性分析方法有较高的 生物相关性。 0059 表 318 种抗氧化剂纯品的血浆 ORAC 值 说 明 书 CN 103760144 A 9 7/8 页 10 00。
32、60 0061 图 1 的说明如下 ： Caco-2 单细胞按一定数量接种于黑色 96 微孔板 （透明平底） ， 培 养 12 48 小时后， 移出生长培养基， 向各孔细胞中加入抗氧化剂处理培养基 （DMEM+ 荧光 探针 DCFH-DA 待测抗氧化剂） ， 培养箱孵育 10 60min。孵育期间抗氧化剂和 DCFH-DA 进 入细胞内， DCFH-DA（无极性， 能自由进出细胞） 进入细胞后被胞内酯酶水解为 DCFH（极性， 不能从胞内出来， 因而被 “包埋” 在胞内） ， 10 60min 后移出抗氧化剂处理培养基， PBS 洗 净细胞外残留物后， 加入氧化剂处理培养基 （HBSS+ 自由。
33、基产生剂 AAPH） ， AAPH 进入细胞产 生连续稳定的 ROO自由基， ROO氧化 DCFH， 生成荧光物质 DCF， 测定各孔的荧光强度， 荧 光强度与细胞内氧化剂浓度成正比。由于抗氧化剂能有效淬灭 ROO， 因而添加了抗氧化 剂的细胞孔荧光强度低于未加添加剂的孔 （空白孔） ， 且抗氧化剂浓度越高或抗氧化能力越 强， 荧光强度越低， 因此， 通过测定荧光强度能定量反映出抗氧化剂被细胞吸收的特性和抗 氧化剂的活性。 0062 表 4 说 明 书 CN 103760144 A 10 8/8 页 11 0063 0064 说明书中的缩写说明见表 4。 说 明 书 CN 103760144 A 11 1/1 页 12 图 1 说 明 书 附 图 CN 103760144 A 12 。