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1、(10)申请公布号 CN 103760202 A (43)申请公布日 2014.04.30 CN 103760202 A (21)申请号 201410041822.4 (22)申请日 2014.01.28 G01N 27/26(2006.01) (71)申请人 东北师范大学 地址 130117 吉林省长春市净月经济开发区 净月大街 2555 号东北师范大学环境学 院 (72)发明人 袁星 武冬梅 朱晓琳 李锦莲 (74)专利代理机构 哈尔滨市松花江专利商标事 务所 23109 代理人 侯静 (54) 发明名称 一种用于 DNA 碱基同时检测的电化学传感器 (57) 摘要 一种用于 DNA 碱基。
2、同时检测的电化学传感 器， 它涉及 DNA 的电化学检测。本发明是要解决 现有电化学传感器难以实现对四种 DNA 碱基的同 时灵敏分析和稳定检测， 现有方法存在的易受样 品污染， 仪器复杂昂贵， 操作繁琐问题， 以及电位 窗较窄， 对嘧啶碱基响应电流较低， 稳定性较差问 题。本发明步骤如下 ： 一、 制备氧化石墨烯及溴甲 酚紫溶液 ； 二、 制备石墨烯修饰电极 ； 三、 制备溴 甲酚紫/石墨烯复合修饰电极 ； 四 ： 使用复合修饰 电极检测四种碱基混合液的电化学信号， 分析并 确定其电化学信号所在的峰位 ； 步骤五 ： 对碱基 混合液进行电化学检测， 得到其随浓度变化的差 分脉冲伏安图 ； 建。
3、立四种 DNA 碱基电化学信号变 化规律图。本发明适用于电化学传感器领域。 (51)Int.Cl. 权利要求书 2 页 说明书 12 页 附图 5 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书2页 说明书12页 附图5页 (10)申请公布号 CN 103760202 A CN 103760202 A 1/2 页 2 1. 一种用于 DNA 碱基同时检测的电化学传感器， 其特征在于它是按以下步骤进行 ： 步骤一 ： 将利用 Hummer 方法制备的氧化石墨烯粉末， 于双蒸水中超声分散 10 15min， 得到浓度为 0.2 0.5mg/mL 的氧化石墨烯悬浊液 ； 。
4、将溴甲酚紫于浓度为 0.01M 的 NaNO3溶液中分散， 得到浓度为 1.010-3 2.010-3M 的溴甲酚紫溶液 ； 步骤二 ： 取 5 10L 步骤一得到的氧化石墨烯悬浊液， 滴涂到玻碳电极表面， 置于红 外灯下干燥， 干燥后冷却至室温， 得到氧化石墨烯修饰的玻碳电极 ； 将氧化石墨烯修饰的玻 碳电极置于 pH=5 7 的 PBS 溶液中进行恒电位还原， 还原电位为 -1.0 -1.5V， 还原时间 为 360 720s， 即得石墨烯修饰电极， 室温晾干待用 ； 步骤三 ： 将步骤二中制得的石墨烯修饰电极置于步骤一得到的溴甲酚紫溶液中进行循 环伏安扫描， 其中， 电位为 -1.0 +。
5、1.5V， 扫描速率为 50 100mVs-1， 循环次数为 10 15 圈， 即得溴甲酚紫 / 石墨烯复合修饰电极 ； 步骤四 ： 用步骤三制备的溴甲酚紫 / 石墨烯复合修饰电极检测四种碱基混合溶液的电 化学信号， 确定四种碱基电化学信号所在的峰位 ； 其中， 所述的溴甲酚紫 / 石墨烯复合修饰 电极检测的工作条件如下 ： 温度为2225、 脉冲高度为0.010.1V， 脉冲宽度为0.01 0.1s， 电位增量为 0.005 0.015V ； 所述的四种碱基混合溶液由浓度为 0.20 200.0M 的鸟嘌呤、 浓度为 0.20 220.0M 的腺嘌呤、 浓度为 2.0 700.0M 的胸腺嘧。
6、啶、 浓度为 2.50 650.0M 的胞嘧啶和 pH=7.0 7.4、 浓度为 0.1 0.2M 的 PBS 缓冲液制成 ； 步骤五 ： 对待测的四种碱基混合液采用进行步骤三制备的溴甲酚紫 / 石墨烯复合修 饰电极进行电化学检测， 得到鸟嘌呤、 腺嘌呤、 胸腺嘧啶、 胞嘧啶随浓度变化的差分脉冲伏 安图 ； 然后分别以碱基浓度为横坐标， 以电化学检测的电流信号为纵坐标， 建立四种 DNA 碱 基电化学信号变化规律图 ； 其中， 所述的溴甲酚紫 / 石墨烯复合修饰电极检测的工作条件 如下 ： 温度为 22 25、 脉冲高度为 0.01 0.1V， 脉冲宽度为 0.01 0.1s， 电位增量为 0。
7、.0050.015V ； 所述的待测定的四种碱基混合溶液由浓度为0.20200.0M的鸟嘌呤、 浓度为 0.20 220.0M 的腺嘌呤、 浓度为 2.0 700.0M 的胸腺嘧啶、 浓度为 2.50 650.0M 的胞嘧啶和 pH=7.0 7.4、 浓度为 0.1 0.2M 的 PBS 缓冲液制成。 2. 根据权利要求 1 所述的一种用于 DNA 碱基同时检测的电化学传感器， 其特征在于步 骤一中所述的氧化石墨烯悬浊液浓度为 0.5mg/mL。 3. 根据权利要求 1 所述的一种用于 DNA 碱基同时检测的电化学传感器， 其特征在于步 骤一中所述的溴甲酚紫溶液浓度为 2.010-3M。 4.。
8、 根据权利要求 1 所述的一种用于 DNA 碱基同时检测的电化学传感器， 其特征在于步 骤二中所述的取 5L 步骤一得到的氧化石墨烯悬浊液， 滴涂到玻碳电极表面。 5. 根据权利要求 1 所述的一种用于 DNA 碱基同时检测的电化学传感器， 其特征在于步 骤二中所述的氧化石墨烯的还原电位为 -1.5V。 6. 根据权利要求 1 所述的一种用于 DNA 碱基同时检测的电化学传感器， 其特征在于步 骤二中所述的氧化石墨烯的还原时间为 720s。 7. 根据权利要求 1 所述的一种用于 DNA 碱基同时检测的电化学传感器， 其特征在于步 骤三中所述的聚合溴甲酚紫时所用的扫描速率为 100mVs-1。。
9、 8. 根据权利要求 1 所述的一种用于 DNA 碱基同时检测的电化学传感器， 其特征在于步 骤三中所述的聚合溴甲酚紫圈数为 15 圈。 权 利 要 求 书 CN 103760202 A 2 2/2 页 3 9. 根据权利要求 1 所述的一种用于 DNA 碱基同时检测的电化学传感器， 其特征在于步 骤四中所述的 PBS 缓冲液 pH=7.4。 10. 根据权利要求 1 所述的一种用于 DNA 碱基同时检测的电化学传感器， 其特征在 于步骤五中所述的所述的四种碱基混合溶液由浓度为 0.20 50.0M 的鸟嘌呤、 浓度为 0.20 50.0M 的腺嘌呤、 浓度为 2.0 200.0M 的胸腺嘧啶。
10、、 浓度为 2.50 100.0M 的胞嘧啶和 pH=7.2 7.4、 浓度为 0.1 0.2M 的 PBS 缓冲液制成。 权 利 要 求 书 CN 103760202 A 3 1/12 页 4 一种用于 DNA 碱基同时检测的电化学传感器 技术领域 0001 本发明涉及脱氧核糖核酸 （DNA） 的电化学检测， 尤其是四种 DNA 碱基的电化学检 测。 背景技术 0002 脱氧核糖核酸 （DNA） 是染色体的主要化学成分， 其基本构成是脱氧核糖核苷酸， 脱 氧核糖核苷酸又由磷酸、 D-2 脱氧核糖和碱基构成。其中碱基包括腺嘌呤 （Adenine） 、 鸟嘌 呤 （Guanine） 、 胸腺嘧啶。
11、 （Thymine） 和胞嘧啶 （Cytosine） 。DNA 作为传递遗传信息的载体， 与生命的正常活动如繁殖、 遗传、 细胞分化等紧密相关。同时， DNA 的氧化损伤和变异与生 命的异常活动如肿瘤、 遗传病和代谢病等有密切联系。DNA 的氧化性损伤通常发生在碱基 上， 通过检测体液中碱基的变化可以预测 DNA 的损伤程度， 指示某些疾病的发生， 同时对于 研究 DNA 的代谢过程及其损伤机理具有重要意义。 0003 早期用于 DNA 分析测定的方法有经典的定磷法、 定糖法及流式细胞技术等。近些 年发展起来的分析检测方法有分光光度法、 荧光光谱法、 化学发光法、 共振光散射法和毛细 管电泳法。
12、等。 然而， 以上这些方法容易受到样品混浊、 溶血、 黄疸的干扰， 而且大多数仪器复 杂昂贵， 操作繁琐。将电化学传感器用于对 DNA， 尤其是两种嘌呤碱基的分析是近年来的一 个新的研究方向。然而， 由于嘧啶碱基的氧化电位较高， 电化学响应较弱， 现有的电化学传 感器难以实现对四种 DNA 碱基的同时灵敏分析和稳定检测。 发明内容 0004 本发明的目的是为了解决现有电化学传感器难以实现对四种 DNA 碱基的同时灵 敏分析和稳定检测， 现有方法存在的易受样品混浊、 溶血、 黄疸干扰， 仪器复杂昂贵， 操作繁 琐等问题， 以及现有电化学传感器电位窗较窄， 对嘧啶碱基响应电流较低， 稳定性较差等问。
13、 题， 而提供的一种用于 DNA 碱基同时检测的电化学传感器。 0005 本发明提供的用于 DNA 碱基同时检测的电化学传感器， 是按以下步骤进行 ： 0006 步骤一 ： 将利用 Hummer 方法制备的氧化石墨烯粉末， 于双蒸水中超声分散 10 15min， 得到浓度为 0.2 0.5mg/mL 的氧化石墨烯悬浊液 ； 将溴甲酚紫于浓度为 0.01M 的 NaNO3溶液中分散， 得到浓度为 1.010-3 2.010-3M 的溴甲酚紫溶液 ； 0007 步骤二 ： 取 5 10L 步骤一得到的氧化石墨烯悬浊液， 滴涂到玻碳电极表面， 置 于红外灯下干燥， 干燥后冷却至室温， 得到氧化石墨烯。
14、修饰的玻碳电极 ； 将氧化石墨烯修饰 的玻碳电极置于 pH=5 7 的 PBS 溶液中进行恒电位还原， 还原电位为 -1.0 -1.5V， 还原 时间为 360 720s， 即得石墨烯修饰电极， 室温晾干待用 ； 0008 步骤三 ： 将步骤二中制得的石墨烯修饰电极置于步骤一得到的溴甲酚紫溶液中进 行循环伏安扫描， 其中， 电位为 -1.0 +1.5V， 扫描速率为 50 100mVs-1， 循环次数为 10 15 圈， 即得溴甲酚紫 / 石墨烯复合修饰电极 ； 0009 步骤四 ： 用步骤三制备的溴甲酚紫 / 石墨烯复合修饰电极检测四种碱基混合溶液 说 明 书 CN 103760202 A 。
15、4 2/12 页 5 的电化学信号， 确定四种碱基电化学信号所在的峰位 ； 其中， 所述的溴甲酚紫 / 石墨烯复 合修饰电极检测的工作条件如下 ： 温度为 22 25、 脉冲高度为 0.01 0.1V， 脉冲宽度 为 0.01 0.1s， 电位增量为 0.005 0.015V ； 所述的四种碱基混合溶液由浓度为 0.20 200.0M 的鸟嘌呤、 浓度为 0.20 220.0M 的腺嘌呤、 浓度为 2.0 700.0M 的胸腺嘧 啶、 浓度为 2.50 650.0M 的胞嘧啶和 pH=7.0 7.4、 浓度为 0.1 0.2M 的 PBS 缓冲液 制成 ； 0010 步骤五 ： 对待测的四种碱。
16、基混合液采用进行步骤三制备的溴甲酚紫 / 石墨烯复合 修饰电极进行电化学检测， 得到鸟嘌呤、 腺嘌呤、 胸腺嘧啶、 胞嘧啶随浓度变化的差分脉冲 伏安图 ； 然后分别以碱基浓度为横坐标， 以电化学检测的电流信号为纵坐标， 建立四种 DNA 碱基电化学信号变化规律图 ； 其中， 所述的溴甲酚紫 / 石墨烯复合修饰电极检测的工作条 件如下 ： 温度为 22 25、 脉冲高度为 0.01 0.1V， 脉冲宽度为 0.01 0.1s， 电位增量 为0.0050.015V ； 所述的四种碱基混合溶液由浓度为0.20200.0M的鸟嘌呤、 浓度为 0.20 220.0M 的腺嘌呤、 浓度为 2.0 700.。
17、0M 的胸腺嘧啶、 浓度为 2.50 650.0M 的胞嘧啶和 pH=7.0 7.4、 浓度为 0.1 0.2M 的 PBS 缓冲液制成。 0011 本发明包含以下有益效果 ： 0012 本发明提出的电化学传感器， 是一种用于四种 DNA 碱基 （腺嘌呤、 鸟嘌呤、 胸腺嘧 啶、 胞嘧啶） 同时检测的简单、 快速、 无标记的新型电化学传感器。 0013 本发明的电化学传感器， 以 DNA 碱基含量为检测指标， 可同时观察到鸟嘌呤 （0.66V 左右） 、 腺嘌呤 （0.92V 左右） 、 胸腺嘧啶 （1.12V 左右） 及胞嘧啶 （1.29V 左右） 四个电 化学信号的变化， 实现对四种 DN。
18、A 碱基的定量检测。该电化学传感器对腺嘌呤、 鸟嘌呤、 胸 腺嘧啶及胞嘧啶的线性检测范围分别为 0.20-220.0M， 0.20-200.0M， 2.0-700.0M， 2.50-650.0M， 最低检出限分别可达 0.05M， 0.06M， 0.3M 及 0.9M。 0014 本发明提出的一种 DNA 碱基同时检测的电化学传感器通过检测电化学信号来指 示 DNA 碱基的变化情况， 是一种简单、 快速、 灵敏、 快速的新型传感器， 而且不需要添加任何 荧光或放射性标记物， 样品不易受污染， 操作非常安全。 附图说明 0015 图 1 为不同修饰电极检测含 50.0M 鸟嘌呤、 50.0M 腺。
19、嘌呤、 200.0M 胸腺嘧啶和 200.0M 胞嘧啶的 pH=7.4 的 PBS 溶液的差分脉冲伏安图， 其中， a 为玻碳电极电极伏安曲 线， b 为溴甲酚紫 / 玻碳电极伏安曲线， c 为石墨烯 / 玻碳电极伏安曲线， d 为溴甲酚紫 / 石 墨烯 / 玻碳电极伏安曲线 ； 0016 图 2 为鸟嘌呤随浓度变化的差分脉冲伏安图 ； 0017 图 3 为鸟嘌呤的浓度 - 电化学信号变化规律图 ； 0018 图 4 为腺嘌呤随浓度变化的差分脉冲伏安图 ； 0019 图 5 为腺嘌呤的浓度 - 电化学信号变化规律图 ； 0020 图 6 为胸腺嘧啶随浓度变化的差分脉冲伏安图 ； 0021 图 。
20、7 为胸腺嘧啶的浓度 - 电化学信号变化规律图 ； 0022 图 8 为胞嘧啶随浓度变化的差分脉冲伏安图 ； 0023 图 9 为胞嘧啶的浓度 - 电化学信号变化规律图 ； 说 明 书 CN 103760202 A 5 3/12 页 6 0024 图 10 为鸟嘌呤、 腺嘌呤、 胸腺嘧啶、 胞嘧啶同时随浓度变化的差分脉冲伏安图。 具体实施方式 0025 具体实施方式一 ： 本实施方式的一种用于 DNA 碱基同时检测的电化学传感器， 其 特征在于它是按以下步骤进行 ： 0026 步骤一 ： 将利用 Hummer 方法制备的氧化石墨烯粉末， 于双蒸水中超声分散 10 15min， 得到浓度为 0.。
21、2 0.5mg/mL 的氧化石墨烯悬浊液 ； 将溴甲酚紫于浓度为 0.01M 的 NaNO3溶液中分散， 得到浓度为 1.010-3 2.010-3M 的溴甲酚紫溶液 ； 0027 步骤二 ： 取 5 10L 步骤一得到的氧化石墨烯悬浊液， 滴涂到玻碳电极表面， 置 于红外灯下干燥， 干燥后冷却至室温， 得到氧化石墨烯修饰的玻碳电极 ； 将氧化石墨烯修饰 的玻碳电极置于 pH=5 7 的 PBS 溶液中进行恒电位还原， 还原电位为 -1.0 -1.5V， 还原 时间为 360 720s， 即得石墨烯修饰电极， 室温晾干待用 ； 0028 步骤三 ： 将步骤二中制得的石墨烯修饰电极置于步骤一得到。
22、的溴甲酚紫溶液中进 行循环伏安扫描， 其中， 电位为 -1.0 +1.5V， 扫描速率为 50 100mVs-1， 循环次数为 10 15 圈， 即得溴甲酚紫 / 石墨烯复合修饰电极 ； 0029 步骤四 ： 用步骤三制备的溴甲酚紫 / 石墨烯复合修饰电极检测四种碱基混合溶液 的电化学信号， 确定四种碱基电化学信号所在的峰位 ； 其中， 所述的溴甲酚紫 / 石墨烯复 合修饰电极检测的工作条件如下 ： 温度为 22 25、 脉冲高度为 0.01 0.1V， 脉冲宽度 为 0.01 0.1s， 电位增量为 0.005 0.015V ； 所述的四种碱基混合溶液由浓度为 0.20 200.0M 的鸟嘌。
23、呤、 浓度为 0.20 220.0M 的腺嘌呤、 浓度为 2.0 700.0M 的胸腺嘧 啶、 浓度为 2.50 650.0M 的胞嘧啶和 pH=7.0 7.4、 浓度为 0.1 0.2M 的 PBS 缓冲液 制成 ； 0030 步骤五 ： 对待测的四种碱基混合液采用进行步骤三制备的溴甲酚紫 / 石墨烯复合 修饰电极进行电化学检测， 得到鸟嘌呤、 腺嘌呤、 胸腺嘧啶、 胞嘧啶随浓度变化的差分脉冲 伏安图 ； 然后分别以碱基浓度为横坐标， 以电化学检测的电流信号为纵坐标， 建立四种 DNA 碱基电化学信号变化规律图 ； 其中， 所述的溴甲酚紫 / 石墨烯复合修饰电极检测的工作条 件如下 ： 温度。
24、为 22 25、 脉冲高度为 0.01 0.1V， 脉冲宽度为 0.01 0.1s， 电位增量 为0.0050.015V ； 所述的四种碱基混合溶液由浓度为0.20200.0M的鸟嘌呤、 浓度为 0.20 220.0M 的腺嘌呤、 浓度为 2.0 700.0M 的胸腺嘧啶、 浓度为 2.50 650.0M 的胞嘧啶和 pH=7.0 7.4、 浓度为 0.1 0.2M 的 PBS 缓冲液制成。 0031 本实施方式提出的电化学传感器， 以 DNA 碱基含量为检测指标， 可同时观察到鸟 嘌呤 （0.66V左右） 、 腺嘌呤 （0.92V左右） 、 胸腺嘧啶 （1.12V左右） 及胞嘧啶 （1.29。
25、V左右） 四个 电化学信号的变化， 实现对四种 DNA 碱基的定量检测。该电化学传感器对腺嘌呤、 鸟嘌呤、 胸腺嘧啶及胞嘧啶的线性检测范围分别为 0.20-220.0M， 0.20-200.0M， 2.0-700.0M， 2.50-650.0M， 最低检出限分别可达 0.05M， 0.06M， 0.3M 及 0.9M。 0032 本实施方式提出的一种 DNA 碱基同时检测的电化学传感器通过检测电化学信号 来指示 DNA 碱基的变化情况， 是一种简单、 快速、 灵敏、 快速的新型传感器， 而且不需要添加 任何荧光或放射性标记物， 样品不易受污染， 操作非常安全。 0033 具体实施方式二 ： 本。
26、实施方式与具体实施方式一不同的是 ： 步骤一中所述的于双 说 明 书 CN 103760202 A 6 4/12 页 7 蒸水中超声分散为 12 15min。其它与具体实施方式一相同。 0034 具体实施方式三 ： 本实施方式与具体实施方式一或二不同的是 ： 步骤一中所述的 于双蒸水中超声分散为 15min。其它与具体实施方式一或二相同。 0035 具体实施方式四 ： 本实施方式与具体实施方式一至三之一不同的是 ： 步骤一中所 述的氧化石墨烯悬浊液浓度为 0.3 0.5mg/mL。其它与具体实施方式一至三之一相同。 0036 具体实施方式五 ： 本实施方式与具体实施方式一至四之一不同的是 ： 。
27、步骤一中所 述的氧化石墨烯悬浊液浓度为 0.5mg/mL。其它与具体实施方式一至四之一相同。 0037 具体实施方式六 ： 本实施方式与具体实施方式一至五之一不同的是 ： 步骤一中所 述的溴甲酚紫溶液浓度为 1.510-3 2.010-3M。其它与具体实施方式一至五之一相同。 0038 具体实施方式七 ： 本实施方式与具体实施方式一至六之一不同的是 ： 步骤一中所 述的溴甲酚紫溶液浓度为 2.010-3M。其它与具体实施方式一至六之一相同。 0039 具体实施方式八 ： 本实施方式与具体实施方式一至七之一不同的是 ： 步骤二中所 述的取 5 8L 步骤一得到的氧化石墨烯悬浊液， 滴涂到玻碳电极。
28、表面。其它与具体实施 方式一至七之一相同。 0040 具体实施方式九 ： 本实施方式与具体实施方式一至八之一不同的是 ： 步骤二中所 述的取 5L 步骤一得到的氧化石墨烯悬浊液， 滴涂到玻碳电极表面。其它与具体实施方式 一至八之一相同。 0041 具体实施方式十 ： 本实施方式与具体实施方式一至九之一不同的是 ： 步骤二中所 述的的 PBS 的 pH=5 6。其它与具体实施方式一至九之一相同。 0042 具体实施方式十一 ： 本实施方式与具体实施方式一至十之一不同的是 ： 步骤二中 所述的的 PBS 的 pH=5。其它与具体实施方式一至十之一相同。 0043 具体实施方式十二 ： 本实施方式与。
29、具体实施方式一至十一之一不同的是 ： 步骤二 中所述的还原电位为 -1.3 -1.5V。其它与具体实施方式一至十一之一相同。 0044 具体实施方式十三 ： 本实施方式与具体实施方式一至十二之一不同的是 ： 步骤二 中所述的还原电位为 -1.5V。其它与具体实施方式一至十二之一相同。 0045 具体实施方式十四 ： 本实施方式与具体实施方式一至十三之一不同的是 ： 步骤二 中所述的还原时间为 400 720s。其它与具体实施方式一至十三之一相同。 0046 具体实施方式十五 ： 本实施方式与具体实施方式一至十四之一不同的是 ： 步骤二 中所述的还原时间为 500 720s。其它与具体实施方式一。
30、至十四之一相同。 0047 具体实施方式十六 ： 本实施方式与具体实施方式一至十五之一不同的是 ： 步骤二 中所述的还原时间为 600 720s。其它与具体实施方式一至十五之一相同。 0048 具体实施方式十七 ： 本实施方式与具体实施方式一至十六之一不同的是 ： 步骤二 中所述的还原时间为 720s。其它与具体实施方式一至十六之一相同。 0049 具体实施方式十八 ： 本实施方式与具体实施方式一至十七之一不同的是 ： 步骤三 中所述的聚合溴甲酚紫扫描速率为 60 100mVs-1。其它与具体实施方式一至十七之一相 同。 0050 具体实施方式十九 ： 本实施方式与具体实施方式一至十七之一不同。
31、的是 ： 步骤三 中所述的聚合溴甲酚紫扫描速率为 70 100mVs-1。其它与具体实施方式一至十七之一相 同。 说 明 书 CN 103760202 A 7 5/12 页 8 0051 具体实施方式二十 ： 本实施方式与具体实施方式一至十九之一不同的是 ： 步骤三 中所述的聚合溴甲酚紫扫描速率为 80 100mVs-1。其它与具体实施方式一至十九之一相 同。 0052 具体实施方式二十一 ： 本实施方式与具体实施方式一至二十之一不同的是 ： 步骤 三中所述的聚合溴甲酚紫扫描速率为 90 100mVs-1。其它与具体实施方式一至二十之一 相同。 0053 具体实施方式二十二 ： 本实施方式与具。
32、体实施方式一至二十一之一不同的是 ： 步 骤三中所述的聚合溴甲酚紫扫描速率为 100mVs-1。其它与具体实施方式一至二十一之一相 同。 0054 具体实施方式二十三 ： 本实施方式与具体实施方式一至二十二之一不同的是 ： 步 骤三中所述的聚合溴甲酚紫循环次数为 12 15 圈。其它与具体实施方式一至二十二之一 相同。 0055 具体实施方式二十四 ： 本实施方式与具体实施方式一至二十三之一不同的是 ： 步 骤三中所述的聚合溴甲酚紫循环次数为 15 圈。其它与具体实施方式一至二十三之一相同。 0056 具体实施方式二十五 ： 本实施方式与具体实施方式一至二十四之一不同的是 ： 步 骤四中所述的。
33、溴甲酚紫 / 石墨烯复合修饰电极工作条件如下 ： 温度为 25、 脉冲高度为 0.05V， 脉冲宽度为 0.05s， 电位增量为 0.01V。其它与具体实施方式一至二十四之一相同。 0057 具体实施方式二十六 ： 本实施方式与具体实施方式一至二十五之一不同的是 ： 步 骤四中所述的用作碱基溶剂的PBS缓冲液pH=7.17.4。 其它与具体实施方式一至二十五 之一相同。 0058 具体实施方式二十七 ： 本实施方式与具体实施方式一至二十六之一不同的是 ： 步 骤四中所述的用作碱基溶剂的PBS缓冲液pH=7.27.4。 其它与具体实施方式一至二十六 之一相同。 0059 具体实施方式二十八 ： 。
34、本实施方式与具体实施方式一至二十七之一不同的是 ： 步 骤四中所述的用作碱基溶剂的 PBS缓冲液pH=7.37.4。 其它与具体实施方式一至二十七 之一相同。 0060 具体实施方式二十九 ： 本实施方式与具体实施方式一至二十八之一不同的是 ： 步 骤四中所述的用作碱基溶剂的PBS缓冲液pH=7.4。 其它与具体实施方式一至二十八之一相 同。 0061 具体实施方式三十 ： 本实施方式与具体实施方式一至二十九之一不同的是 ： 步 骤四中所述的四种碱基混合溶液由浓度为 0.20 100.0M 的鸟嘌呤、 浓度为 0.20 100.0M 的腺嘌呤、 浓度为 2.0 500.0M 的胸腺嘧啶、 浓度。
35、为 2.50 400.0M 的胞嘧 啶和 pH=7.0 7.4、 浓度为 0.1 0.2M 的 PBS 缓冲液混合制成。其它与具体实施方式一至 二十九之一相同。 0062 具体实施方式三十一 ： 本实施方式与具体实施方式一至三十之一不同的是 ： 步骤 四中所述的四种碱基混合溶液由浓度为0.2050.0M的鸟嘌呤、 浓度为0.2050.0M 的腺嘌呤、 浓度为 2.0 300.0M 的胸腺嘧啶、 浓度为 2.50 200.0M 的胞嘧啶和 pH=7.0 7.4、 浓度为 0.1 0.2M 的 PBS 缓冲液混合制成。其它与具体实施方式一至三十 之一相同。 说 明 书 CN 103760202 A。
36、 8 6/12 页 9 0063 具体实施方式三十二 ： 本实施方式与具体实施方式一至三十一之一不同的是 ： 步骤四中所述的四种碱基混合溶液由浓度为 0.20 20.0M 的鸟嘌呤、 浓度为 0.20 20.0M的腺嘌呤、 浓度为2.0100.0M的胸腺嘧啶、 浓度为2.50100.0M的胞嘧啶 和 pH=7.0 7.4、 浓度为 0.1 0.2M 的 PBS 缓冲液混合制成。其它与具体实施方式一至 三十一之一相同。 0064 具体实施方式三十三 ： 本实施方式与具体实施方式一至三十二之一不同的是 ： 步骤四中所述的四种碱基混合溶液由浓度为 0.20 5.0M 的鸟嘌呤、 浓度为 0.20 5。
37、.0M 的腺嘌呤、 浓度为 2.0 50.0M 的胸腺嘧啶、 浓度为 2.50 50.0M 的胞嘧啶和 pH=7.07.4、 浓度为0.10.2M的PBS缓冲液混合制成。 其它与具体实施方式一至三十二 之一相同。 0065 具体实施方式三十四 ： 本实施方式与具体实施方式一至三十三之一不同的是 ： 步骤四中所述的四种碱基混合溶液由浓度为 0.20 2.0M 的鸟嘌呤、 浓度为 0.20 2.0M 的腺嘌呤、 浓度为 2.0 10.0M 的胸腺嘧啶、 浓度为 2.50 10.0M 的胞嘧啶和 pH=7.07.4、 浓度为0.10.2M的PBS缓冲液混合制成。 其它与具体实施方式一至三十三 之一相。
38、同。 0066 具体实施方式三十五 ： 本实施方式与具体实施方式一至三十四之一不同的是 ： 步 骤四中所述的四种碱基混合溶液由浓度为0.201.0M的鸟嘌呤、 浓度为0.201.0M 的腺嘌呤、 浓度为 2.0 5.0M 的胸腺嘧啶、 浓度为 2.50 5.0M 的胞嘧啶和 pH=7.0 7.4、 浓度为 0.1 0.2M 的 PBS 缓冲液混合制成。其它与具体实施方式一至三十四之一相 同。 0067 具体实施方式三十六 ： 本实施方式与具体实施方式一至三十五之一不同的是 ： 步 骤四中所述的四种碱基混合溶液由浓度为0.200.8M的鸟嘌呤、 浓度为0.200.8M 的腺嘌呤、 浓度为 2.0。
39、 3.0M 的胸腺嘧啶、 浓度为 2.50 3.0M 的胞嘧啶和 pH=7.0 7.4、 浓度为 0.1 0.2M 的 PBS 缓冲液混合制成。其它与具体实施方式一至三十五之一相 同。 0068 具体实施方式三十七 ： 本实施方式与具体实施方式一至三十六之一不同的是 ： 步 骤四中所述的四种碱基混合溶液由浓度为0.200.5M的鸟嘌呤、 浓度为0.200.5M 的腺嘌呤、 浓度为 2.0 2.5M 的胸腺嘧啶、 浓度为 2.50 2.8M 的胞嘧啶和 pH=7.0 7.4、 浓度为 0.1 0.2M 的 PBS 缓冲液混合制成。其它与具体实施方式一至三十六之一相 同。 0069 具体实施方式三。
40、十八 ： 本实施方式与具体实施方式一至三十七之一不同的是 ： 步骤五中所述的四种碱基混合溶液由浓度为 0.06 100.0M 的鸟嘌呤、 浓度为 0.05 100.0M的腺嘌呤、 浓度为0.3500.0M的胸腺嘧啶、 浓度为0.9400.0M的胞嘧啶 和 pH=7.0 7.4、 浓度为 0.1 0.2M 的 PBS 缓冲液混合制成。其它与具体实施方式一至 三十七之一相同。 0070 具体实施方式三十九 ： 本实施方式与具体实施方式一至三十八之一不同的是 ： 步骤五中所述的四种碱基混合溶液由浓度为 0.06 50.0M 的鸟嘌呤、 浓度为 0.05 50.0M 的腺嘌呤、 浓度为 0.3 200。
41、.0M 的胸腺嘧啶、 浓度为 0.9 200.0M 的胞嘧啶 和 pH=7.0 7.4、 浓度为 0.1 0.2M 的 PBS 缓冲液混合制成。其它与具体实施方式一至 说 明 书 CN 103760202 A 9 7/12 页 10 三十八之一相同。 0071 具体实施方式四十 ： 本实施方式与具体实施方式一至三十九之一不同的是 ： 步 骤五中所述的四种碱基混合溶液由浓度为 0.06 20.0M 的鸟嘌呤、 浓度为 0.05 20.0M 的腺嘌呤、 浓度为 0.3 100.0M 的胸腺嘧啶、 浓度为 0.9 100.0M 的胞嘧啶 和 pH=7.0 7.4、 浓度为 0.1 0.2M 的 PB。
42、S 缓冲液混合制成。其它与具体实施方式一至 三十九之一相同。 0072 具体实施方式四十一 ： 本实施方式与具体实施方式一至四十之一不同的是 ： 步骤 五中所述的四种碱基混合溶液由浓度为0.0610.0M的鸟嘌呤、 浓度为0.0510.0M 的腺嘌呤、 浓度为0.350.0M的胸腺嘧啶、 浓度为0.950.0M的胞嘧啶和pH=7.0 7.4、 浓度为 0.1 0.2M 的 PBS 缓冲液混合制成。其它与具体实施方式一至四十之一相同。 0073 具体实施方式四十二 ： 本实施方式与具体实施方式一至四十一之一不同的是 ： 步 骤五中所述的四种碱基混合溶液由浓度为0.065.0M的鸟嘌呤、 浓度为0。
43、.055.0M 的腺嘌呤、 浓度为0.310.0M的胸腺嘧啶、 浓度为0.910.0M的胞嘧啶和pH=7.0 7.4、 浓度为 0.1 0.2M 的 PBS 缓冲液混合制成。其它与具体实施方式一至四十一之一相 同。 0074 具体实施方式四十三 ： 本实施方式与具体实施方式一至四十二之一不同的是 ： 步 骤五中所述的四种碱基混合溶液由浓度为0.061.0M的鸟嘌呤、 浓度为0.051.0M 的腺嘌呤、 浓度为 0.3 5.0M 的胸腺嘧啶、 浓度为 0.9 5.0M 的胞嘧啶和 pH=7.0 7.4、 浓度为 0.1 0.2M 的 PBS 缓冲液混合制成。其它与具体实施方式一至四十二之一相 同。
44、。 0075 具体实施方式四十四 ： 本实施方式与具体实施方式一至四十三之一不同的是 ： 步 骤五中所述的四种碱基混合溶液由浓度为0.060.5M的鸟嘌呤、 浓度为0.050.5M 的腺嘌呤、 浓度为 0.3 2.0M 的胸腺嘧啶、 浓度为 0.9 2.0M 的胞嘧啶和 pH=7.0 7.4、 浓度为 0.1 0.2M 的 PBS 缓冲液混合制成。其它与具体实施方式一至四十三之一相 同。 0076 具体实施方式四十五 ： 本实施方式与具体实施方式一至四十四之一不同的是 ： 步 骤五中所述的四种碱基混合溶液由浓度为0.060.1M的鸟嘌呤、 浓度为0.050.1M 的腺嘌呤、 浓度为 0.3 1。
45、.0M 的胸腺嘧啶、 浓度为 0.9 1.0M 的胞嘧啶和 pH=7.0 7.4、 浓度为 0.1 0.2M 的 PBS 缓冲液混合制成。其它与具体实施方式一至四十四之一相 同。 0077 通过以下实施例验证本发明的有益效果 ： 0078 实施例 1 0079 本实施例的一种用于 DNA 碱基同时检测的电化学传感器， 按以下步骤进行 ： 0080 步骤一 ： 将利用 Hummer 方法得到的氧化石墨烯粉末， 于双蒸水中超声分散 15min， 得 0.5mg/mL 的氧化石墨烯水悬浊液 ； 将溴甲酚紫于 0.01MNaNO3溶液中分散， 得到 1.010-3 2.010-3M 的溴甲酚紫混合溶液。
46、 ； 0081 其中， 所用溴甲酚紫属于分析纯 ； 0082 步骤二 ： 用微量移液器吸取 5L 氧化石墨烯悬浊液， 滴涂到氧化石墨烯表面， 置 于红外灯下干燥， 干燥后冷却至室温， 得到氧化石墨烯修饰的玻碳电极 ； 将氧化石墨烯修饰 说 明 书 CN 103760202 A 10 8/12 页 11 的玻碳电极置于 pH=5 的 PBS 溶液中进行恒电位还原， 还原电位为 -1.5V， 还原时间为 720s， 即得石墨烯修饰电极， 室温晾干 ； 0083 其中， 红外灯照射时间根据玻碳电极表面石墨烯薄膜完全干燥确定 ； 0084 步骤三 ： 将步骤二中制得的石墨烯修饰电极置于溴甲酚紫溶液中进。
47、行循环伏安扫 描， 电位 -1.0 1.5V， 扫描速率 100mVs-1， 循环次数 15 圈， 即得溴甲酚紫 / 石墨烯复合修 饰电极 ； 0085 步骤四 ： 用步骤三制备的溴甲酚紫 / 石墨烯复合修饰电极检测四种碱基混合溶液 的电化学信号， 确定四种碱基电化学信号所在的峰位 ； 其中， 溴甲酚紫 / 石墨烯复合修饰电 极工作条件为温度 25、 脉冲高度 0.05V， 脉冲宽度 0.05s， 电位增量 0.01V ； 所述的四种碱 基混合溶液由浓度为 0.20 200.0M 的鸟嘌呤、 浓度为 0.20 220.0M 的腺嘌呤、 浓度 为2.0700.0M的胸腺嘧啶、 浓度为2.50650.0M的胞嘧啶和pH=7.4、 浓度为0.1 0.2M 的 PBS 缓冲液混合后制成 ； 0086 其中， 鸟嘌呤、 腺嘌呤、 胸腺嘧啶、 胞嘧啶购自百灵威科技有限公司 ； 0087 步骤五 ： 对待测定的四种碱基混合液采用骤三制备的溴甲酚紫 / 石墨烯复合修饰 电极进行电化学检测， 得到鸟嘌呤、 腺嘌呤、 胸腺嘧啶、 胞嘧啶随浓度变化的差分脉冲伏安 图 ； 然后分别以碱基浓度为横坐标， 以电化学检测。