用于HIV疫苗接种的免疫原.pdf

本发明涉及基于重叠肽(OLP)及由其衍生的肽的新免疫原，其可用于预防和治疗AIDS及其相关的机会性疾病。本发明还涉及表达这些免疫原的分离的核酸、载体和宿主细胞以及包含所述免疫原的疫苗。

1.  一种免疫原性多肽，其具有包含序列SEQ ID NO 1至16或所述SEQ ID NO：1至16之变体的氨基酸序列，其中每一个所述变体均具有至少8个氨基酸的长度，前提条件是所述氨基酸序列不包含除了根据SEQ ID NO 1至16或其变体中任一者的氨基酸序列之外的来源于HIV基因组的8个或更多个氨基酸长度的任何序列片段。

2.  根据权利要求1所述的免疫原性多肽，其中至少两个序列通过氨基酸接头连接，其中所述接头导致在相邻序列之间的连接区中形成AAA序列区。

3.  根据权利要求1或2中任一项所述的免疫原性多肽，其具有包含SEQ ID NO：49的氨基酸序列。

4.  免疫原性多肽，其具有包含选自SEQ ID NO 1至16或其变体的至少一个序列的氨基酸序列，其中所述变体具有至少8个氨基酸的长度，前提条件是：
i)所述氨基酸序列不包含除了根据SEQ ID NO 1至16或其变体中的任一者的氨基酸序列之外的来源于HIV基因组的8个或更多个氨基酸长度的任何序列片段，并且
ii)当所述免疫原仅包含一个选自SEQ ID NO 1至16的序列时，则该序列不选自SEQ ID NO：3、5、6和16。

5.  根据权利要求4所述的免疫原，其中如果所述免疫原包含至少两个选自SEQ ID NO 1至16或其变体的序列，则所述序列通过氨基酸接头连接，其中所述接头导致在相邻序列之间的连接区中形成AAA序列区。

6.  根据权利要求1至5中任一项所述的免疫原，其中所述氨基酸序列包含至少一个抗逆转录病毒抗性突变位点，并且优选地，其中所述抗逆转录病毒抗性突变位点位于SEQ ID NO 9至11任一者中。

7.  根据权利要求1至6中任一项所述的免疫原，其还包含N-末端处的信号肽。

8.  根据权利要求1至7中任一项所述的免疫原，其中所述变体具有8至40个氨基酸的长度，更优选地11至27个氨基酸的长度。

9.  根据权利要求1至8中任一项所述的免疫原，其中所述变体的C-末端氨基酸不是G、P、E、D、Q、N、T、S或C。

10.  根据权利要求1至9中任一项所述的免疫原，其中所述变体选自根据SEQ ID NO 17至45的肽。

11.  根据权利要求1至10中任一项所述的免疫原，其中所述变体与热休克蛋白融合。

12.  一种核酸，其编码权利要求1至11中任一项所述的免疫原。

13.  根据权利要求12所述的核酸，其已经进行了密码子优化以在人细胞中表达。

14.  根据权利要求13所述的核酸，其中所述核酸具有根据SEQ ID NO：50的序列。

15.  一种表达盒，其包含权利要求12至14中任一项所述的核酸、启动子序列、3’-UTR和任选的选择标记。

16.  一种表达载体，其包含权利要求12至14中任一项所述的核酸或者权利要求15所述的表达盒。

17.  一种病毒，其包含权利要求12至14中任一项所述的核酸。

18.  根据权利要求17所述的病毒，其中所述病毒是经修饰的安卡拉痘苗病毒。

19.  一种细胞，其包含权利要求12至14中任一项所述的核酸、权利要求15所述的表达盒、权利要求16所述的表达载体或者权利要求17至18中任一项所述的病毒。

20.  一种疫苗，其包含根据权利要求1至11中任一项所述的免疫原性多肽和一种或更多种佐剂。

21.  权利要求1至11中任一项所述的免疫原性肽、权利要求12至14所述的核酸、权利要求15所述的表达盒、权利要求16所述的表达载体、权利要求17至18中任一项所述的病毒、权利要求19所述的细胞或根据权利要求20所述的疫苗，其用于医学。

22.  权利要求1至11中任一项所述的免疫原性肽、权利要求12至14所述的核酸、权利要求15所述的表达盒、权利要求16所述的表达载体、权利要求17至18中任一项所述的病毒、权利要求19所述的细胞或根据权利要求20所述的疫苗，其用于预防或治疗HIV感染或与HIV感染相关的疾病。

23.  根据权利要求22应用的所述免疫原性肽、所述核酸、所述表达盒、所述表达载体、所述病毒、所述细胞或所述疫苗，所述应用包括顺序施用：
i)第一根据权利要求1至11中任一项的免疫原性肽、权利要求12至14中任一项的核酸、权利要求15的表达盒、权利要求16的表达载体、权利要求17至18中任一项的病毒、权利要求19的细胞或权利要求20的疫苗，以及
ii)第二根据权利要求1至11中任一项的免疫原性肽、权利要求12至14中任一项的核酸、权利要求15的表达盒、权利要求16的表达载体、权利要求17至18中任一项的病毒、权利要求19的细胞或权利要求20的疫苗。

24.  根据权利要求23应用的所述免疫原性肽、所述核酸、所述表达盒、所述表达载体、所述病毒、所述细胞或所述疫苗，其中所述第一免疫原性肽、核酸、表达盒、表达载体、病毒、细胞或疫苗与所述第二免疫原性肽、核酸、表达盒、表达载体、病毒、细胞或疫苗不同。

25.  根据权利要求24应用的所述免疫原性肽、所述核酸、所述表达盒、所述表达载体、所述病毒、所述细胞或所述疫苗，其中施用根据权利要求16所述的表达载体，随后施用根据权利要求18的经修饰的安卡拉痘苗病毒。

26.  根据权利要求25应用的所述免疫原性肽、所述核酸、所述表达盒、所述表达载体、所述病毒、所述细胞或所述疫苗，其中根据权利要求16所述的表达载体被施用至少两次。

27.  一种试剂盒，其包含权利要求1至11中任一项所述的免疫原、权利要求12至14所述的核酸、权利要求15所述的表达盒、权利要求16所述的表达载体、权利要求17至18中任一项所述的病毒、权利要求19所述的细胞或权利要求20所述的疫苗。

用于HIV疫苗接种的免疫原
技术领域
本发明涉及基于重叠肽(overlapping peptide，OLP)及由其衍生的肽的新免疫原。其还涉及表达这些免疫原的分离的核酸以及包含这样的核酸的载体和细胞。本发明的化合物可用作疫苗，特别地用于预防和治疗AIDS和机会性疾病(opportunistic disease)。
背景技术
HIV感染诱导强的并且广泛指向的I类HLA限制性T细胞应答，对于所述应答，特异性表位和限制性HLA等位基因参与相关的体内控制。参见Brander C等，Current Opinion Immunol.2006；18：1-8。尽管大部分抗病毒CTL应答表现为受限于HLA-B的，但是依然不清楚靶病毒区域和限制性HLA分子对于这些应答的效果的相对贡献。参见Kiepiela P等，Nature 2004；432：769-775和Ngumbela K等，AIDS Res.Hum.Retroviruses 2008；24：72-82。
此外，不清楚HIV序列多样性在病毒特异性T细胞免疫的体内相关性中的作用，这是因为逃逸变体(escape variant)的功能约束、个别蛋白质位置处的密码子使用、T细胞受体(TCR)可塑性和功能亲和力以及交叉反应潜力都可能有助于特异性T细胞应答的整体效果。参见Brockman M等，J.Virol.2007；81：12608-12618和Yerly D等，J.Virol.2008；82：3147-3153。值得注意的是，对HIV Gag的T细胞应答最一贯地与HIV分化体B和分化体C感染群二者中降低的病毒载量有关。参见R等，J.Virol.2006；80：3122-3125和Kiepiela P等，Nat.Med.2007；13：46-53。
但是，这些分析都未对针对可诱导特别有效的应答的靶蛋白的较短区域的应答的作用进行评估。此外，尚不清楚Gag的相对益处是否是由于该蛋白质的其他特性，例如表达水平、氨基酸组成和固有的较强免疫原性。因此，可行的是，Gag外部的蛋白质亚基和这些亚基中特定的短表位富集区域可被认为：i)诱导在HIV控制者中主要可见的应答和ii)其可在多 种HLA类型中的个体中检测，而不限于表达了先前与有效病毒控制有关的等位基因的个体。
尽管一些早期研究的确控制了呈现在“良好”I类HLA等位基因上的Gag衍生表位的潜在的过表达，但是关注点依然在于纯粹的基于Gag的HIV疫苗可能主要使具有有利的HLA基因型的那些人受益，而不能利用Gag外部的潜在有益的靶标。参见Kiepiela，2007，同上和Honeyborne I等，J.Virol.2007；81：3667-3672。此外，CTL逃逸和病毒适合度研究极大地局限于在相关保护性HLA等位基因如HLA-B57和HLA-B27的背景下存在的Gag衍生表位。参见Schneidewind A等，J.Virol.2007；81：12382-12393和Leslie A等，Nat.Med.2004；10：282-289。因此，可利用信息可能未提供用于被设计为保护遗传多样的大部分的人宿主群的免疫原序列相关信息。
此外，许多研究仅集中于免疫优势靶标，但是一些在HIV和SIV感染方面最近研究证明了次优势应答在体内病毒控制中的关键贡献，其中靶标位于Gag外部。参见Frahm N等，Nat.Immunol.2006；7：173-178和Friedrich T等，J.Virol.2007；81：3465-3476。总之，因此对于可构成对HIV的保护性细胞免疫应答的目前的观点可能相当偏颇地集中于免疫优势应答和受频繁的I类HLA等位基因和与较好的疾病结果有关的HLA等位基因限制的应答。因此，HIV疫苗的开发部分地受限于能够诱导广泛的免疫应答的免疫原的缺乏。本发明满足了这样的免疫原的设计。
发明内容
在第一个方面，本发明涉及免疫原性多肽，其具有包含序列SEQ ID NO 1至16或所述SEQ ID NO：1至16的变体的氨基酸序列，其中每一个所述变体均具有至少8个氨基酸的长度，前提条件是所述氨基酸序列不包含除了根据SEQ ID NO 1至16或其变体中的任一者的氨基酸序列之外的来源于HIV基因组的8个或更多个氨基酸长度的任何序列片段。
在第二个方面，本发明涉及免疫原性多肽，其具有包含选自SEQ ID NO 1至16或其变体的至少一个序列的氨基酸序列，其中所述变体具有至少8个氨基酸的长度，前提条件是：
i)所述免疫原氨基酸序列不包含除了根据SEQ ID NO 1至16或者其变体或片段中的任一者的氨基酸序列之外的来源于HIV基因组的8个或 更多个氨基酸长度的任何序列片段，并且
ii)当所述免疫原仅包含一个选自SEQ ID NO 1至16的序列时，则该序列不选自SEQ ID NO：3、5、6和16。
在另一个方面，本发明涉及编码第一个方面和第二个方面的免疫原的核酸，以及包含所述核酸的表达盒、载体、病毒和细胞。
在另一个方面，本发明涉及疫苗，其包含根据权利要求1至11中任一项所述的免疫原性多肽和一种或更多种佐剂。
在另一个方面，本发明涉及免疫原性多肽，第三个方面的核酸、表达盒、表达载体、病毒或细胞，或者组合物疫苗，其用于医学。
在另一个方面，本发明涉及免疫原性多肽，第三个方面的核酸、表达盒、表达载体、病毒或细胞，或者组合物疫苗，其用于预防或治疗HIV感染或与HIV感染相关的疾病。
在另一个方面，本发明涉及试剂盒，其包含第一和/或第二个方面的免疫原，第三个方面的核酸、表达盒、表达载体、病毒或细胞，或者第四个方面的组合物。
微生物保藏
质粒298H GMCSF-HIVACAT DNA于2012年1月13日以登记号DSM 25555保藏在德国微生物和细胞培养物保藏中心(DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen，Inhoffenstraβe7B，D-38124Braunschweig，Federal Republic of Germany)。
附图说明
图1.表达质粒中包含的基因的示意图。点指示起始密码子和终止密码子。
图2.通过流式细胞分析术在合并脾细胞中分析的细胞免疫应答。在(a)中示出了组间总Gag、Pol和Nef-Tat-Vif特异性干扰素γ应答的频率以及在(b)中示出了CD4和CD8应答的分布。
图3.通过干扰素γELISpot测定在小鼠脾细胞中测量的对Gag、Pol、NTV和HIVACAT T细胞免疫原序列的应答。利用编码全Gag、Pol和 Nef-Tat-Vif多肽的质粒对个体小鼠进行免疫接种。示出了靶向HIVACAT T细胞免疫原中包含的区域的应答对总干扰素γGag-Pol-NTV特异性应答的贡献。
图4.免疫小鼠中靶向HIVACAT T细胞免疫原的干扰素γ应答的宽度(a)和量级(b)的比较。利用编码全蛋白质或最小T细胞序列的质粒处理对象。
图5.利用20μg编码全Gag、Pol加上Nef-Tat-Vif多肽的质粒和HIVACAT T细胞免疫原对小鼠进行免疫接种，应答针对Gag、Pol、Vif或Nef的干扰素γ的平衡。在图(a)中示出了利用全蛋白质进行免疫接种的小鼠优势Gag特异性应答，而在图(b)中示出了利用HIVACAT T细胞免疫原进行免疫接种的小鼠更加平衡的结果。
图6.使用来自HEK 293细胞的细胞提取物通过Western免疫印迹检测p24、p37和p55的结合抗体，所述细胞已利用1mg gag和gag-pol表达载体(示出p55gag，和经处理的p24、p37和p55gag亚单位)转染并在12％SDS-Page上分离，利用以下血清探测膜：a)HIV感染患者的人血清，b)来自利用高剂量免疫原进行了免疫接种的小鼠的合并血清和c)来自利用低剂量的免疫原进行了免疫接种的小鼠的合并血清(全部1∶100稀释)。
图7.a)来自治疗的小鼠的Gag-p24特异性结合抗体的终点滴度。由来自个体4倍连续稀释的合并血清样品的ELISA进行确定。b)内部开发的使用HIV-1IIIB pr55Gag重组蛋白的(Cat.No.3276，NIH Reagent Program，Bethesda，MD，US)gag p55ELISA。在1∶100稀释的个体小鼠血清中进行确定。
图8.a)小鼠免疫接种的示意图。使用6组C57BL/6小鼠来比较不同异源重组的免疫原性(2×DNA初次对比3×DNA初次接1×MVA加强)，使用100μg pDNA-HIVACAT或10^6pfu的MVA-HIVACAT通过肌内注射进行。b)个体免疫的小鼠中靶向HIVACAT T细胞免疫原的IFNγ应答的宽度和量级的比较。c)个体免疫的小鼠中Gag、Pol、Vif和Nef特异性应答的分布。d)示出了不同免疫组中HIVACAT T细胞免疫原中包含的8种蛋白质亚基(Gag p17、Gag p24、Gag p2p7p1p6、Pol-蛋白酶、Pol-RT、Pol-整合酶、Vif和Nef)的分布。
发明详述
本发明公开了多种在宽范围的对象中有效诱导针对HIV的高免疫应答的免疫原性化合物。特别地，利用这些化合物获得了对于关键HIV编码表位的HIV特异性CD4⁺和CD8⁺T细胞应答。
1.一般术语和表达的定义
本文使用的术语“佐剂”是指改变免疫原的效果，同时在施用其本身时具有很少(若有的话)直接效果的免疫试剂。其通常被包含在疫苗中以增强接受者对所提供抗原的免疫应答，同时保持注射的外源物质最少。向疫苗中添加佐剂以刺激免疫系统对靶抗原的应答，但是其本身不提供免疫力。可用的佐剂的非限制性实例包括：矿物盐、多核苷酸、聚精氨酸、ISCOM、皂苷、单磷脂酰脂质A、咪喹莫特、CCR-5抑制剂、毒素、聚磷腈、细胞因子、免疫调节蛋白质、免疫刺激融合蛋白、共刺激分子及其组合。矿物盐包括但不限于：AlK(SO₄)₂、AlNa(SO₄)₂、AlNH(SO₄)₂、二氧化硅、明矾、Al(OH)₃、Ca₃(PO₄)₂、高岭土或碳。可用的免疫刺激多核苷酸包括但不限于：具有或不具有免疫刺激复合物(immune stimulating complexes，ISCOM)的CpG寡核苷酸，具有或不具有聚精氨酸、聚IC或聚AU酸的CpG寡核苷酸。毒素包括霍乱毒素。皂苷包括但不限于QS21、QS17或QS7。可用的免疫刺激融合蛋白的实例是IL-2与免疫球蛋白的Fc片段的融合蛋白。可用的免疫调节分子包括但不限于CD40L和CD1a配体。可用作佐剂的细胞因子包括但不限于：IL-1、IL-2、IL-4、GMCSF、IL-12、IL-15、IGF-1、IFN-α、IFN-β和干扰素γ。另外，实例是胞壁酰二肽、N-乙酰基-胞壁酰-L-苏氨酰-D-异谷氨酰胺(thr-DMP)、N-乙酰基-去甲胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺(CGP 11687，也称为nor-MDP)，N-乙酰基胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺-L-丙氨酸-2-(1′2′-二棕榈酰-sn-甘油基-3-羟基磷酰氧基)-乙胺(CGP19835A，也称为MTP-PE)、2％角鲨烯/TWEEN80乳剂中的RIBI(MPL+TDM+CWS)、脂多糖及其多种衍生物，包括脂质A、弗氏完全佐剂(FCA)、弗氏不完全佐剂、Merck佐剂65、多核苷酸(例如，聚IC和聚AU酸)、来自结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)的蜡D，在小棒状杆菌(Corynebacterium parvum)、百日咳博德特氏菌(Bordetella pertussis)和布鲁氏菌属的成员中发现的物质，Titermax、Quil A、ALUN、脂质A衍生物、霍乱毒素衍生物、HSP衍生物、LPS衍生物、合成肽基质或GMDP、Montanide ISA-51和QS-21、CpG寡核苷酸、聚I：C和GMCSF。 参见Osol A编辑的Remington′s Pharmaceutical Sciences(Mack Publishing Co.，Easton，PA，US，1980，第1324-1341页)，Hunter R，US5,554,372和Jager E，Knuth A，WO1997028816。也可使用佐剂的组合。
本文使用的术语“AIDS”是指HIV感染的症状阶段，包括获得性免疫缺陷综合症(通常称为AIDS)和“ARC”或AIDS相关综合征。参见Adler M等，Brit.Med.J.1987；294：1145-1147。AIDS的免疫学和临床表现是本领域中周知的，包括例如免疫缺陷导致的机会性感染和癌症。
本文使用的术语“氨基酸接头”是指除出现在天然蛋白质的特定位置以外的氨基酸序列，通常被设计成柔性的或在两个蛋白质部分之间插入结构，例如α-螺旋。接头也称为间隔子。接头通常是非抗原性的，并且基本上可以为任何长度(例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多个氨基酸)。接头还可以是细胞抗原加工机可开始降解免疫原性多肽而不破坏强效的T细胞表位的位置或序列。
本文使用的术语“抗逆转录病毒抗性突变位点”是指这样的位点，其在突变时，赋予对抗逆转录病毒剂的抗性。这样的位点可通过查阅已知数据库如斯坦福大学HIV药物抗性数据库(Stanford University HIV Drug Resistance Database)来鉴别，在该数据库中，例如，可找到具有特定突变病毒的序列和处理或者针对具有选择突变的隔离群的药物敏感性数据。用于测试HIV的抗药性的试验是本领域中已知的。参见Dong J，US20040106136和Shafer R，Assay for Antiretroviral Resistance，HIV InSite Knowledge Base Chapter(http：//hivinsite.ucsf.edu/InSite？page＝kb-02-02-03，2012年1月)。HIV中已知的抗逆转录病毒抗性突变位点由世界卫生组织(World Health Organization)或国际抗病毒协会-USA定期公开(例如，Johnson V等，ISA-USA Topics Antiviral Med.2011；19(4)：153-164。
本文使用的表达“细胞免疫应答”描述了由T细胞及其分泌产物介导的针对外来抗原的免疫应答。
本文使用的术语“中心树序列(center-of-tree sequence)”或“COT”是指从其到相关变体序列的系统发生图的每一端的平均进化距离最小化的序列。参见Nickle D等，Science2003；299，1515-1517。
本文使用的术语“密码子优化”涉及修改核酸分子中的密码子以反映 宿主生物的典型密码子使用来改善表达，其不改变由DNA编码的多肽。先前已经报道了用于密码子优化的多种方法和软件工具。参见Narum D等，Infect.Immun.2001；69(12)：7250-7253，Outchkourov N等，Protein Expr.Purif.2002；24(1)：18-24，Feng L等，Biochemistry 2000；39(50)：15399-15409和Humphreys D等，Protein Expr.Purif.2000；20(2)：252-2。
本文使用的术语“包括”或“包含”根据普遍接受的专利实践还公开了“由......组成”。
本文使用的表达“与HIV感染相关的疾病”包括对象已经显现出AIDS的状态，而且还包括对象被HIV感染但是未表现出疾病的任何迹象或症状的状态。因此，当向没有感染的临床迹象的对象施用时，本发明的疫苗可具有预防活性，因为其可预防疾病的发生。所述免疫原性组合物能够预防或减缓感染和对这样的对象中健康CD4+T细胞的破坏。其还指预防和减缓获得性免疫缺陷疾病的症状的发生，例如极低的CD4+T细胞数以及被机会性病原体反复感染，所述机会性病原体例如分支杆菌物种(Mycobacteria spp.)、卡氏肺孢子虫(Pneumocystis carinii)和隐球菌肺孢子虫(Pneumocystis cryptococcus)。有益的或期望的临床结果包括但不限于：绝对的幼稚CD4+T细胞数的提高(10-3520范围)、总循环免疫细胞中CD4+T细胞百分比的提高(1％至50％范围)和/或以未感染对象中正常CD4+T细胞数的百分比表示的CD4+T细胞数的提高(1％至161％范围)。
本文使用的术语“变体”或“片段”是指来源于SEQ ID NO 1至16中的任一者的通过在单个SEQ ID NO的N末端或C末端缺失一个或更多个末端氨基酸的多肽。变体或片段的长度优选为至少8个氨基酸或多达为其各自SEQ ID NO的10％、多达20％、多达30％、多达40％、多达50％、多达60％、多达70％、多达80％、多达90％或多达99％。
本文使用的术语“HIV基因组”是指由HIV衣壳包装的约8749个核苷酸长的RNA序列，其编码基因gag、pol、env、tat、rev、vif、nef、vpr、vpu、vpx和任选的tev。HIV基因组序列是高可变性的基础，因为这个原因，在本发明中提及的HIV基因组不限于任何特定序列。优选序列是本文列举的HIV型和亚型的那些。
本文使用的术语“人免疫缺陷病毒”或“HIV”是指属类上的(generically)人免疫缺陷病毒，包括HIV 1型(“HIV-I”)、HIV 2型 (“HIV-2”)或其他HIV病毒，包括例如HIV-1、HIV-2、新出现的HIV以及其他HIV亚型和HIV变体，例如广泛分布或地理隔离的变体和猿猴免疫缺陷病毒(“SIV”)。例如，可确定以下病毒的env和gag基因的祖先病毒基因序列：HIV-1例如HIV-1亚型A、B、C、D、E、F、G、H、J和K以及亚型间重组如AG、AGI以及组M、N、O，或者HIV-2病毒或HIV-2亚型A或B。HIV-1、HIV-2和SIV包括但不限于细胞外病毒颗粒以及与其各自的感染细胞缔合的病毒形式。
本文使用的术语“体液免疫应答”描述了由B细胞产生的抗体介导的针对外来的一种或更多种抗原的免疫应答。
本文使用的术语“免疫原性组合物”是指引起产生抗体的免疫应答或针对特定免疫原的细胞介导的免疫应答的组合物。
本文使用的术语“免疫原性多肽”或“免疫原”是指如果将其本身或与佐剂一起注射时，能够诱导适应性免疫应答(即，体液或细胞介导的免疫应答)的多肽抗原。
本文使用的术语“试剂盒”是指有助于工艺、方法或应用的制品的组合。这些试剂盒提供了实施本发明所述应用所需的材料。
本文使用的术语“可操作地连接”旨在意味着目标核苷酸序列与一个或更多个调控序列以允许所述核苷酸序列表达(例如，在体外转录/翻译系统中或当将载体被引入到宿主细胞中时在宿主细胞中)的方式连接。参见Auer H，Nature Biotechnol.2006；24：41-43。
本文使用的术语“肽标签”或“标签”是指可用在所述免疫原的分离或纯化中的肽或氨基酸序列。因此，所述标签能够高亲和力地与一个或更多个配体结合，例如亲和基质(如色谱载体或珠)的一个或更多个配体。可用于蛋白质的分离或纯化的标签的说明性、非限制性实例包括：Arg标签、FLAG标签、His标签或Strep标签；能够被抗体识别的表位，例如c-myc标签(被抗c-myc抗体识别)、SBP标签、S标签、钙调蛋白结合肽、纤维素结合结构域、壳多糖结合结构域、谷胱甘肽S-转移酶标签、麦芽糖结合蛋白、NusA、TrxA、DsbA或Avi标签；氨基酸序列，例如AHGHRP(SEQ ID NO：53)，PIHDHDHPHLVIHS(SEQ ID NO：54)或GMTCXXC(SEQ ID NO：55)；或者β-半乳糖苷酶。参见Terpe K等，Appl.Microbiol.Biotechnol.2003；60：523-525。
本文可互换地使用的术语“可药用载体”、“可药用稀释剂”或“可药用 赋形剂”或“可药用载剂”是指任何常规类型的无毒性固体、半固体或液体填充剂、稀释剂、包封材料或配制助剂。可药用载体在使用剂量和浓度对于接受者基本无毒并且与制剂的其他成分可相容。例如，用于含多肽的制剂的载体可能不包含通常的氧化剂和其他已知对多肽有害的化合物。合适的载体包括但不限于：水、葡萄糖、甘油、盐水、乙醇及其组合。载体可包含另外的试剂，例如润湿剂或乳化剂、pH缓冲剂或增强制剂的效力的佐剂。
本文使用的术语“预防”是指抑制动物中疾病的开始或降低疾病的发生。预防可以是完全的(例如，对象中完全不存在病理细胞)。预防也可以是部分的，例如对象中病理细胞的出现低于无本发明时已出现的。预防还指降低对临床病症的易感性。
术语“分泌信号肽”是指必须横穿过膜以到达其功能性细胞定位处的蛋白质的高疏水氨基酸序列(例如，优选15至60个氨基酸长)。通过与信号识别颗粒结合，这些序列引导初生蛋白-核糖体复合物到达膜，所述蛋白质在翻译过程中插入至所述膜。信号肽通过多种膜(例如，内质网、线粒体、叶绿体、过氧化物酶体)引导对蛋白质的翻译摄取。非膜蛋白质上的前导信号序列最终通过特定肽酶而被移除。所使用的一些信号肽包括：MCP-3趋化因子，用于促进抗原呈递细胞的分泌和吸引；针对增加的蛋白酶体降解的连环蛋白(CATE)-衍生肽；和溶酶体相关蛋白LAMP1，用于靶向MHC II隔室。参见Rosati M等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA2009；106：15831-15836。
本文使用的表达“顺序施用”意味着不是同时施用，而是进行第一次施用，接着一个或更多个连续施用。
本文使用的表达“基本保持免疫原性多肽的免疫学能力”意味着如果单独注射或与佐剂一起注射，变体在诱导适应性免疫应答(即，体液或细胞介导的免疫应答)方面显示出免疫原性多肽的至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或100％的能力。
本文使用的术语“治疗”是指在临床症状已出现之前或之后施用本发明的免疫原性组合物或包含所述组合物的药物以控制疾病的发展。控制疾病发展应理解为意指有益的或期望的临床结果，包括但不限于：减轻症状、降低疾病的持续时间、稳定病理状态(特别是避免额外恶化)、延迟疾病的发展、改善病理状态和缓减(部分地和全部地二者)。控制疾病的发展 还包括与如果不应用治疗的预期存活相比延长存活。
本文使用的术语“疫苗”是指通过诱导适应性免疫应答(包括免疫记忆)来建立或改善对特定疾病的免疫力的物质或组合物。疫苗通常包含类似于导致疾病的微生物或其一部分(例如，多肽)的试剂。疫苗可以是预防性或治疗性的。
本文使用的术语“变体”是指通过影响一个或更多个氨基酸的改变或突变(包括替换(优选保守替换)、插入或非末端缺失)衍生自SEQ ID NO1至16的任一者的所有那些氨基酸序列，并且其基本保持免疫原性多肽的免疫原性能力。
本文使用的术语“载体(vector)”是指线性或环状核酸分子，其包含根据目的核酸或根据目的表达盒的片段，所述目的核酸与为其提供在目的宿主细胞中的自主复制的另外的片段可操作地连接。
2.本发明的免疫原性多肽
在第一个方面，本发明涉及免疫原性多肽，其具有包含序列SEQ ID NO 1至16或所述SEQ ID NO：1至16的变体的氨基酸序列，其中每一个所述变体均具有至少8个氨基酸的长度，前提条件是所述氨基酸序列不包含除了根据SEQ ID NO 1至16或其变体中的任一者的氨基酸序列之外的来源于HIV基因组的8个或更多个氨基酸长度的任何序列片段。
在一个具体实施方案中，第一个方面的免疫原性多肽的氨基酸序列包含SEQ ID NO：49。
在第二个方面，本发明涉及免疫原性多肽，其具有包含选自SEQ ID NO 1至16或其变体或其片段的至少一个序列的氨基酸序列，其中所述片度具有至少8个氨基酸的长度，前提条件是：
i)所述氨基酸序列不包含除了根据SEQ ID NO 1至16或其变体或其片段中的任一者的氨基酸序列之外的来源于HIV基因组的8个或更多个氨基酸长度的任何序列片段，并且
ii)当免疫原仅包含一个选自SEQ ID NO 1至16的序列时，则该序列不选自SEQ ID NO：3、5、6和16。
优选地，根据第一个方面和第二个方面的变体与其相关序列等效，并且来源于不同HIV毒株或是人造HIV序列。在该方面上等效意为一个或更多个氨基酸残基不同但是对应于相同序列(例如，由基因组中的位置或 序列相似性确定的)。换言之，在一个优选实施方案中，变体是“天然存在的变体”，其是指来源于当前或之前传播的病毒的HIV基因组并且可从现有数据库(例如，GenBank和Los Alamos序列数据库)中鉴定的核酸序列。传播的病毒的序列还可通过分子生物学算法确定。参见Brown T，“Gene Cloning”(Chapman&Hall，London，GB，1995)；Watson R等，“Recombinant DNA”，第二版(Scientific American Books，New York，NY，US，1992)；Sambrook J等，“Molecular Cloning.A Laboratory Manual”(Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，US，1989)。优选地，SEQ ID NO 1至16中任一者的变体与其对应序列(即，SEQ ID NO 1至16)具有至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的氨基酸序列一致性。适合确定序列同一性和序列相似性百分比的算法的实例是BLAST和BLAST2.0算法。参见Altschul S等，Nuc.Acids Res.1977；25：3389-3402和Altschul S等，J.Mol.Biol.1990；215：403-410。可使用BLAST和BLAST2.0程序确定本发明的核酸和蛋白质的序列一致性百分比。用于进行BLAST分析的软件可以通过国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information)为公众所获得。参见http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast.cgi，2012年1月。
变体还可包含一个或更多个经修饰的氨基酸残基(例如，通过连接取代基来修饰的残基)或者一个或更多个非天然氨基酸，例如β氨基酸。
用于确定细胞应答的程度的方法是本领域中已知的。可使用任何适于评估响应于Ag的T细胞刺激的方法。以下描述的程序提供了合适的方法的一些实例：
1)酶联免疫印迹(ELISpot)：将来自预培养孔的非粘附细胞转移到平板上，所述平板涂覆有期望的抗细胞因子捕获抗体(Ab，例如抗IFN、抗IL-10、抗IL-2、抗IL-4)。利用生物素化第二Ab和标准比色或荧光检测法(例如链霉亲和素-碱性磷酸酶和NBT-BCIP)进行显影并对印迹计数。然后将ELISpot读出值表示成斑点形成细胞(SFC)/10⁶输入细胞。
2)上清液细胞因子分析：通过不同技术测量释放到培养物上清液中的细胞因子，例如酶联免疫吸附测定(ELISA)、BD流式细胞珠阵列、Biorad Bio-Plex分析及其他。
3)I类HLA四聚体：利用该方法，使用市售试剂(例如，MHC Class I Dexamers，Immudex，Copenhagen，DK)或自行制备的试剂(例如，Novak E等，J.Clin.Invest.1999；104：R63-R67)检测识别特定肽表位的 Ag反应性T细胞。
4)II类HLA四聚体：利用该方法，使用市售试剂(例如，MHC Class II Ultimers^TM，ProImmune Ltd，Oxford，GB)或自行制备的试剂(例如，Novak，1991，同上)检测识别特定肽表位的Ag反应性T细胞。
5)活化标记(例如，CD69、CD25、CD137)上调：利用该方法，通过在Ag识别之后其暴露在膜上的活性标记的差异表达来检测Ag特异性T细胞应答。
6)细胞因子捕获测定：根据其细胞因子应答，该系统在使Ag-特异性T细胞可视化上是ELISpot的有效替选(Miltenyi Biotec GmbH，Bergisch Gladbach，DE)。此外，其允许直接分选和克隆目的T细胞。
7)CD154测定：该方法限于检测Ag特异性CD4+T细胞。参见Chattopadhyay P等，Nat.Med.2005；11：1113-11117和Frentsch M等，Nat.Med.2005；11：1118-1124。
8)CD107测定：该方法允许利用细胞毒性潜力使Ag特异性CD8+T细胞可视化。参见Betts M等，J.Immunol.Methods2003；281：65-78。
9)CFSE稀释测定：该方法在Ag识别之后根据其扩增检测Ag特异性T细胞(CD4+和CD8+)。参见Mannering S等，J.Immunol.Methods2003；283：173-183。
用于确定变体的体液应答的程度的方法是本领域中已知的。可使用任何适于评估响应于Ag的T细胞的刺激的方法。合适的方法的实例包括但不限于：检测或定量已经利用免疫原性多肽或变体进行治疗的对象的血清中特异性识别抗原剂或免疫原性剂的抗体相对于未治疗对象中抗体的量的相对量。可使用标准测定如酶联免疫吸附测定(ELISA)、单向免疫扩散测定(Single Radial Immunodiffussion Assay，SRID)或酶免疫测定(ETA)来确定抗体滴度。
在一个优选实施方案中，SEQ ID NO 1至16中任一者的变体是所述一种或更多种序列的片段。
在一些具体实施方案中，确定HIV-1B或C亚型的env基因或者B或C亚型的gag基因的祖先病毒序列。在另一些实施方案中，确定其他HIV基因或多肽如pol或辅助基因或多肽的祖先病毒序列。在又一个实施方案中，通过共有序列或中心树技术确定病毒序列。
在一个优选实施方案中，HIV是M群HIV。M群是主要传播的HIV-1群。其已被分成用字母表示的亚型和用数字表示的亚-亚型。亚型A1、A2、A3、A4、B、C、D、E、F1、F2、G、H、J和K是当前识别的。HIV-1亚型(也称为分化体)是HIV-1系统进化上关联的毒株，其彼此为大约相同的遗传距离；在一些情况下，亚型也是地理上或流行病学上联系的。亚型内部的遗传变异可以是15至20百分比或更高，而亚型之间或同一亚型的分散成员之间的变异通常为25至35百分比。HIV的全基因组测序的发展已导致识别为传播重组形式和独特的重组形式(分别为CRF或URF)。在双重感染的人中，存在亚型之间重组的结果，重组形式然后从这些人传播到其他人。如果在三位或更多位没有直接的流行病学联系的人中鉴定了重组后代，则将其归类为传播的重组形式，否则就将其描述为独特的重组形式。
在一个实施方案中，所述免疫原的氨基酸序列包含至少一个选自SEQ ID NO 1至16或其变体的序列，其中所述前提条件ii)是：当免疫原仅包含一个选自SEQ ID NO 1至16的序列时，则该序列不选自SEQ ID NO 1至16。
在一个优选实施方案中，所述免疫原包含至少两个、至少三个或至少四个选自SEQ ID NO 1至16或其变体的序列，其中所述前提条件ii)是：当所述免疫原仅包含两个、三个或四个选自SEQ ID NO 1至16或其变体的序列时，则这些序列并非全都选自SEQ ID NO：3、5、6和16。在另一个实施方案中，所述免疫原的氨基酸序列包含至少两个、至少三个、至少四个、至少五个、至少六个、至少七个、至少八个、至少九个或至少十个选自SEQ ID NO 1至16或其变体的序列，其中所述前提条件ii)是：当所述免疫原仅包含两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个选自SEQ ID NO 1至16的序列时，则这些序列并非全都选自SEQ ID NO 1至16。
在一个优选实施方案中，根据第一个方面的免疫原以1至16的顺序包含根据SEQ ID NO 1至16或其变体的序列。
在一个实施方案中，本发明涉及第一个方面的免疫原，其中至少两个序列通过氨基酸接头邻接。
在另一个实施方案中，本发明涉及第二个方面的的免疫原，其中，如果所述免疫原包含至少两个选自SEQ ID NO 1至16或其变体的序列时，则所述序列通过氨基酸接头邻接。
在第一个方面和第二个方面二者的免疫原的一个优选实施方案中，接头具有氨基酸序列A、AA或AAA。在另一个优选实施方案中，当位于相对于接头N-末端的序列的C-末端残基或者位于C-末端的序列的N-末端残基是丙氨酸残基时，可缩短接头从而在相邻序列之间的连接区中形成AAA序列。因此，在一个优选实施方案中，如果位于相对于接头N-末端的序列的C-末端残基是丙氨酸或者如果位于相对于接头C-末端的序列的N-末端残基是丙氨酸时，则接头具有序列AA。在另一个优选实施方案中，如果位于相对于接头N-末端的序列的C-末端残基和位于接头的C-末端的序列的N-末端残基二者都是丙氨酸时，那么接头为序列A。
在另一个实施方案中，所述免疫原还在N-末端包含分泌信号肽，其中所述信号肽优选地增强免疫原从表达所述免疫原的细胞的分泌。优选的分泌信号肽来源于GMCSF(粒细胞巨噬细胞集落刺激因子)，优选地接着缬氨酸以增强稳定性。GMCSF信号肽的序列优选为：MWLQSLLLLGTVACSIS(SEQ ID NO：46)或MWLQSLLLLGTVACSISV(SEQ ID NO：47)。
在另一个实施方案中，所述免疫原还任选地包含肽标签。肽标签可位于信号肽和免疫原性多肽之间的N-末端，或者优选地，可在终止密码子之前位于C-末端。
优选地，所述标签是FLAG肽。FLAG系统使用短的亲水性8-氨基酸肽，其与目的重组蛋白融合。FLAG肽包括多种高特异性抗FLAG单克隆抗体(M1、M2、M5；Sigma-Aldrich Corp.，Saint Louis，MO，US)的结合位点，其可用于评估目的蛋白在来自转染细胞的物质中的表达。由于FLAG肽标签的小尺寸，其通常不屏蔽其他表位、结构域或者改变融合蛋白的功能、分泌或运输。优选地，所述FLAG肽具有序列DYKDDDDKL(SEQ ID NO：48)。
在一个优选实施方案中，所述标签仅用于免疫原的表达分析和纯化，并且在其使用前被移除以引起免疫应答。
在另一个实施方案中，本发明涉及所述免疫原，其中所述氨基酸序列包含至少一个抗逆转录病毒抗性突变位点。
突变可发生在病毒基因组中的任何位点。优选地，突变发生在编码整合酶、蛋白酶或逆转录酶基因的区域。
对整合酶抑制剂赋予抗性的整合酶内突变包括但不限于：SEQ ID  NO：1内的T66、E92、F121、E138、G140、Y143、S147、Q148、S153、N155、E157和R263及其组合。在一个优选实施方案中，所述突变选自整合酶蛋白质中的突变E92Q、G140S、G140A和Y143R及其组合。
与蛋白酶抑制剂(PI)抗性有关的蛋白酶内的突变包括主要蛋白酶、附属蛋白酶和蛋白酶裂解位点突变。参见Shafer R等，AIDS Rev.2008；10(2)：67-84。十七个主要的非多态性位点具有最主要的临床意义，包括L231、L241、D30N、V321、L33F、M461/L、147/V/A、G48V/M、150L/V、F53L、154V/T/A/L/M、G73S/T、L76V、V82A/T/F/S、184V/A/C、N88D/S、L90M。附属蛋白酶突变包括多态性突变L101/V、113V、K20R/M/I、M36I、D60E、I62V、L63P、A71V/T、V77I和193L以及非多态性突变L10F/R、V111、E34Q、E35G、K43T、K45I、K55R、Q58E、A71I/L、T74P/A/S、V751、N83D、P79A/S、185V、L89V、T91S、Q92K和C95F。
在另一个实施方案中，抗逆转录病毒抗性突变位点位于逆转录酶中，导致对核苷逆转录酶抑制剂(NRTI)或非核苷逆转录酶抑制剂(NNRTI)的抗性。NRTI抗性突变包括M184V、胸苷类似物突变(TAM)、通过缺少胸苷类似物的方法选择的突变(Non-TAM)和多核苷抗性突变(Multi-NRTI突变)和众多最近描述的非多态性附属突变。总之，M184v、非胸苷类似物相关突变如K65R和L74V以及多核苷抗性突变Q151M通过降低NRTI整合来作用。胸苷类似物突变、与多核苷抗性相关的T69插入和许多附属突变有利于引物解阻断。参见Shafer，20008，同上。M184V是最常发生的NRTI抗性突变。最常见的抗药性氨基酸突变是M41L、D67N、K70R、L210w、T215Y/F和K219QE。具有病毒学失败(virologic failure)同时接受含有NRTI骨架的非胸苷类似物(Non-TAM)的患者中最常见的突变包括单独M184V或者M184V与K65R或L74V的组合。其他Non-TAM突变包括K65N、K70E/G、L741、V75T/M、Y115F。在密码子69处的氨基酸插入通常在多TAM的存在下发生，并且在这种环境下与对3TC和FTC的中等抗性和对每一种其余NRTI的高水平抗性相关。Q151M是2-bp突变(CAG.fwdarw.ATG)，其通常伴随着两种或更多种以下突变：A62V、V751、F77L和F116Y。Q151M复合物导致对ZDV、d4T、ddI和ABC的高水平抗性，以及对TDF、3TC和FTC的中等抗性。参见Shafer R等，AIDS Rev.2008；10(2)：67-84。
NNTRI抗性突变包括但不限于：初级NNRTI抗性突变(K103N/S、 V106A/M、Y181C/I/V、Y188L/C/H和G190A/S/E)、NNRTI抗性次级突变(L1001、K101P、P225H、F227L、M230L和K238T)和稀有突变(V179F、F227C和L2341)。
小的非多态性突变——A98G、K101E、V1081和V179D/E是常见的NNRTI抗性突变，其使对奈韦拉平和依法韦仑的敏感性降低约2倍至5倍。
多种非核苷逆转录酶抑制剂抗性突变(如K101Q、1135T/M、V1791和L2831)使对奈韦拉平和依法韦仑的敏感性降低约2倍并且可与初级NNRTI抗性突变协同作用。其他突变例如L74V、H221Y、K223E/Q、L228H/R和N3481主要通过NRTI选择，也造成NNRTI敏感性略微降低。
优选地，所述抗逆转录病毒抗性突变位点位于SEQ ID NO 9至11中任一者中。更优选地，所述抗逆转录病毒抗性突变位点是SEQ ID NO：9的氨基酸残基8，其中氨基酸Leu被氨基酸Met替换。
在另一个实施方案中，变体或片段具有8至40个氨基酸的长度，更优选地11至27个氨基酸的长度。优选地，所述变体或片段不包含与SEQ ID NO 1至16中的任一者相邻的氨基酸接头。另外，优选地所述变体或片段的C-末端氨基酸不是G、P、E、D、Q、N、T、S或C，因为这些残基通常不形成用于I类HLA限制性T细胞表位的C末端锚。
在一个最优选的实施方案中，所述变体或片段选自根据SEQ ID NO 17至45的肽。
另外，设想将所述变体或片段与热休克蛋白组合或融合。本发明还涉及包含所述变体或片段和热休克蛋白的融合蛋白。优选的热休克蛋白是Hsp10、Hsp20、Hsp30、Hsp40、Hsp60、Hsp70、Hsp90、gp96或Hsp100。
在另一个实施方案中，所述变体或片段是根据第一个方面和第二个方面的变体或片段。优选地，所述变体或片段不包含与SEQ ID NO 1至16中的任一者相邻的氨基酸接头。此外，优选地所述变体或片段的C-末端氨基酸不是G、P、E、D、Q、N、T、S或C，因为这些残基通常不形成用于I类HLA限制性T细胞表位的C末端锚。
在一个最优选的实施方案中，所述变体或片段选自根据SEQ ID NO 17至45的肽。
另外，设想了将所述变体或片段与热休克蛋白组合或融合。本发明还涉及包含所述变体或片段和热休克蛋白的融合蛋白。优选的热休克蛋白是 Hsp10、Hsp20、Hsp30、Hsp40、Hsp60、Hsp70、Hsp90、gp96或Hsp100。
3.本发明的核酸、载体、病毒和细胞
在第三个方面，本发明涉及编码第一个方面的免疫原的核酸及包含所述核酸的表达盒、载体、病毒和细胞。
优选地，所述核酸是多核苷酸，是指核苷单体的单链或双链聚合物(核酸)，其包括但不限于：通过核苷酸磷酸二酯键连接的2′-脱氧核苷酸(DNA)和核糖核苷酸(RNA)。编码本发明免疫原的本发明多核苷酸基本不包含HIV基因组的另外区域。
在一个实施方案中，所述核酸是密码子优化的。在一个优选实施方案中，将所述核酸密码子优化以在人中表达。可通过用“人源化”密码子(即，密码子是在高表达的人基因中频繁出现的那些)替换编码所述免疫原的核酸的密码子来制备用于根据本发明使用的密码子优化的核酸。参见André S等，J.Virol.1998；72：1497-1503。在一个优选实施方案中，所述密码子优化核酸具有根据SEQ ID NO：50的序列。
可能需要用限制酶切割第三个方面的核酸以将其连接到载体中。该方法可致使移除多个末端核苷酸(例如，1、2或3)。因此，在一个实施方案中，本发明涉及所述核酸，其中其已经被限制酶在每一端切割。
在另一个实施方案中，本发明涉及表达盒，其包含第三个方面的核酸、启动子序列和3’-UTR以及任选的选择标记。优选地，所述启动子序列是人巨细胞病毒(CMV)启动子或早期-晚期p7.5启动子序列。优选地，所述3’-UTR是牛生长激素(BGH)聚A。所述任选的选择标记优选地是抗生素抗性基因(例如，卡那霉素、氨苄青霉素、四环素、壮观霉素)。
在又一个实施方案中，本发明涉及包含第三个方面的核酸或表达盒的表达载体。
在一个实施方案中，所述载体是表达载体。因此，根据本发明合适的载体包括：原核载体，例如pUC18、pUC19和Bluescript质粒及其衍生物，如mp18、mp19、pBR322、pMB9、ColE1、pCR1和RP4质粒；噬菌体和穿梭载体，例如pSA3和pAT28载体；酵母中的表达载体，例如2-微米质粒型载体；整合质粒；YEP载体；着丝粒质粒(centromeric plasmid)及类似物；昆虫细胞中的表达载体，例如pAC系列和pVL系列的载体；植物中的表达载体，例如pIBI、pEarleyGate、pAVA、pCAMBIA、pGSA、pGWB、pMDC、pMY、pORE系列的载体及类似 物；以及高等真核细胞中的表达载体，其基于病毒载体(例如MVA、腺病毒、腺病毒相关病毒、逆转录病毒和慢病毒)和非病毒载体，例如pSilencer 4.1-CMV(Ambion，Life Technologies Corp.，Carslbad，CA，US)、pcDNA3、pcDNA3.1/hyg pHCMV/Zeo、pCR3.1、pEF1/His、pIND/GS、pRc/HCMV2、pSV40/Zeo2、pTRACER-HCMV、pUB6/V5-His、pVAX1、pZeoSV2、pCI、pSVL和pKSV-10、pBPV-1、pML2d和pTDT1载体。
在一个具体实施方案中，表达载体是哺乳动物表达载体，其包含哺乳动物启动子和多腺苷酸化位点。优选地，所述启动子是人巨细胞病毒(CMV)启动子。优选地，所述多腺苷酸化位点是牛生长激素(BGH)多腺苷酸化位点。可修饰哺乳动物表达载体以优化载体在细菌中的复制。哺乳动物表达载体还可包含选择基因，例如，编码赋予抗生素抗性的蛋白质的基因。在一个具体实施方案中，哺乳动物表达载体包含卡那霉素抗性基因。
在另一个具体实施方案中，表达载体是病毒载体，优选经修饰的安卡拉痘苗(Modified Vaccine Ankara，MVA)病毒载体。
在另一个实施方案中，本发明涉及包含第三个方面的核酸的病毒。合适的病毒是安全的、低毒性并且是遗传稳定的。非限制性实例是逆转录病毒，特别是痘病毒如MVA、慢病毒、腺病毒和腺伴随病毒(AAV)。
在另一个特别优选的实施方案中，本发明涉及重组经修饰的安卡拉痘苗病毒(MVA)，其包含编码本发明的免疫原性多肽的多核苷酸或基因构建体。经修饰的安卡拉痘苗(MVA)病毒涉及痘苗病毒，其为痘病毒科正痘病毒属的成员。已经通过痘苗病毒的安卡拉毒株(CVA)在鸡胚成纤维细胞上的516次连续传代来产生MVA。参见Mayr A等，Infection 1975；3：6-14以及Sutter G等，US 6,440,422和CH 568,392。MVA病毒是公众可获得的(例如，ATCC登记号VR-1508)。MVA以其弱化(例如，在某些哺乳动物细胞中弱化的毒力和有限的繁殖感染性病毒的能力)，同时在鸟类细胞中保持好的免疫原性以及复制和产生感染性病毒的全部能力为特征。合适的MVA毒株包括因以下原因而具有提高的安全性的毒株：i)在鸡胚成纤维细胞(CEF)中具有在体外繁殖性复制的能力，但是在人细胞系中不具有繁殖性复制的能力，如在人角质形成细胞系HaCaT、人胚肾细胞系293、人骨肉瘤细胞系143B和人宫颈腺癌细胞系HeLa；ii)不能在无法产生成熟B细胞和T细胞因此是严重的免疫受损并对复制型病毒高度敏感的小鼠模型中复制；以及iii)与DNA初次免疫/痘苗病毒加强免 疫的方案相比，在痘苗病毒初次免疫/痘苗病毒加强免疫的方案中诱导至少相同水平的特异性免疫应答。毒株中合适的弱化MVA毒株是指如MVA-BN。参见Chaplin P等WO2002042480、ECACC登记号V00083008。
在另一个实施方案中，本发明涉及包含第三个方面的核酸、表达盒、表达载体或病毒的细胞。待使用的细胞可以是任意细胞类型，包括真核细胞和原核细胞二者。优选地，所述细胞包括真核细胞、酵母细胞或哺乳动物细胞。哺乳动物细胞的优选实例是COS细胞、HeLa细胞、HEK293T细胞或从患者(例如，HIV患者)分离的细胞。
4.本发明的组合物
在第四个方面中，本发明涉及组合物，其包含根据第一和第二个方面的变体或片段和热休克蛋白。可作为例如可注射剂制备所述免疫原性组合物，所述可注射剂例如作为液体溶液、悬液或乳液。优选的热休克蛋白是Hsp10、Hsp20、Hsp30、Hsp40、Hsp60、Hsp70、Hsp90、gp96或Hsp100。
此外，本发明涉及药物组合物，其包含根据本发明的免疫原、核酸、表达盒、载体或细胞或根据第四个方面的组合物和可药用载体。在一个实施方案中，所述药物组合物和第四个方面的组合物可用作疫苗，如以下指出的那些。
5.本发明的疫苗
在另一个方面，本发明涉及疫苗，其包含第一和第二个方面的免疫原、第三个方面的核酸、表达盒、表达载体、病毒或细胞或者第四个方面的组合物。
在一个优选实施方案中，所述疫苗能够产生细胞应答和体液应答。更优选地，所述疫苗产生细胞毒性T细胞应答。在利用同源和异源HIV毒株的病毒序列进行亚基因组免疫接种(subgenomic immunization)之后，可使用细胞毒性T细胞或细胞毒性T淋巴细胞(CTL)测定来监控细胞免疫应答。参见Burke S等，J.Inf.Dis.1994；170：1110-1119和Tigges M等，J.Immunol，1996；156：3901-3910。用于检测T细胞应答的常规测定包括，例如增殖测定、淋巴因子分泌测定、直接细胞毒性测定和有限稀释测定。例如，可测定已经与肽一起孵育的抗原呈递细胞在应答细胞群中诱导CTL应答的能力。抗原呈递细胞可以是细胞如外周血单核细胞(PBMC)或树突细胞(DC)。或者，有内部加工的肽装载I类MHC分子能力缺陷并且已经利用合适的人I类MHC基因转染的突变型非人哺乳动物细胞系 可用来测定感兴趣的肽诱导体外初次CTL应答的能力。可使用PBMC作为CTL前体的应答细胞源。将合适的抗原呈递细胞与肽一起孵育，之后将装载蛋白质的抗原呈递细胞与应答细胞群一起在优化的培养条件下孵育。可通过测定培养物中杀死放射性标记的靶细胞的CTL的存在来确定阳性CTL激活，所述靶细胞为特异性肽-脉冲的靶标和表达内源加工形式的抗原(由其衍生出肽序列)的靶细胞二者。例如，可利用⁵¹Cr对靶细胞进行放射性标记，并且由靶细胞释放的放射性可计算细胞毒活性。另一种合适的方法允许利用荧光素标记的HLA四聚体复合物的染色来直接定量抗原特异性T细胞。参见Altman J等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA1993；90：10330-10334和Altman J等，Science1996；274：94-96。其他相关的最近技术发展包括用于细胞内淋巴因子和干扰素释放测定的染色或ELISpot测定。
在一个实施方案中，第四个方面的疫苗还包含一种或更多种佐剂或热休克蛋白。
佐剂如上文限定。优选的热休克蛋白是Hsp10、Hsp20、Hsp30、Hsp40、Hsp60、Hsp70、Hsp90、gp96或Hsp100。
6.治疗方法
在一个优选实施方案中，根据本发明的免疫原性多肽、本发明的核酸、本发明的表达盒、本发明的表达载体、本发明的病毒、本发明的细胞或根据本发明的疫苗可用于预防或治疗HIV感染或与HIV感染相关的疾病。
因此，在另一个方面，本发明涉及根据本发明的免疫原性多肽、本发明的核酸、本发明的表达盒、本发明的表达载体、本发明的病毒、本发明的细胞或根据本发明的疫苗，其用于预防或治疗HIV感染或与HIV感染相关的疾病。
在另一个方面，本发明涉及根据本发明的免疫原性多肽、本发明的核酸、本发明的表达盒、本发明的表达载体、本发明的病毒、本发明的细胞或根据本发明的疫苗用于生产用于预防或治疗HIV感染或与HIV感染相关的疾病的药物的应用。
在另一个方面，本发明涉及用于预防或治疗有需要的对象中的HIV感染或与HIV感染相关的疾病的方法，其包括向所述对象施用根据本发明的免疫原性多肽、本发明的核酸、本发明的表达盒、本发明的表达载体、本发明的病毒、本发明的细胞或根据本发明的疫苗，用于生产用于预防或 治疗HIV感染或与HIV感染相关的疾病的药物。
在一个具体实施方案中，免疫原性肽、核酸、表达盒、表达载体、病毒、细胞或疫苗用于根据本发明使用，包括顺序施用以下组分：
i)第一根据权利要求1至11中任一项的免疫原性肽、权利要求12至14中任一项的核酸、权利要求15的表达盒、权利16的表达载体、权利17或18的病毒、权利要求19的细胞或权利要求20的疫苗，以及
ii)第二根据权利要求1至11中任一项的免疫原性肽、权利要求12至14中任一项的核酸、权利要求15的表达盒、权利16的表达载体、权利17至18的病毒、权利要求19的细胞或权利要求20的疫苗。
在一个具体实施方案中，第一免疫原性肽、核酸、表达盒、表达载体、病毒、细胞或疫苗与第二免疫原性肽、核酸、表达盒、表达载体、病毒、细胞或疫苗不同。优选地，首先施用根据本发明的表达载体，然后施用根据本发明的经修饰的安卡拉痘苗病毒。
在一个具体实施方案中，根据本发明的第一表达盒施用至少两次，优选至少三次。
与HIV感染或AIDS症状有关的疫苗的有益预防或治疗效果包括，例如，预防或延迟暴露于HIV的个体的初次感染；降低被HIV感染的个体中的病毒负荷；延长HIV感染的无症状阶段；保持已经通过抗逆转录病毒治疗(ART)降低了病毒水平的HIV感染患者中低病毒载量；提高HIV-1特异性和非特异性两种CD4 T细胞的水平或减缓所述CD4 T细胞的降低，在首次用药(drug naive)的患者和利用ART治疗的患者中，提高HIV特异性CTL的宽度、量级、活动性和功能，提高具有AIDS的个体的整体健康或生命质量；以及延长具有AIDS的个体的预期寿命。临床医师可通过治疗之前患者的病症或未治疗患者的预期病症来比较免疫效果，以确定治疗是否对抑制AIDS有效。
优选地，所述疾病是AIDS、ARC或HIV机会性疾病。HIV机会性疾病的非限制性实例是伯基特氏淋巴瘤(Burkitt′s lymphoma)，支气管、气管、肺或食管中的念珠菌病，宫颈癌，球孢子菌病(弥散性或肺外部)，隐球菌病(肺外部)，隐孢子虫病(在肠中持续超过1个月)，巨细胞病毒感染(肝、脾或淋巴结外部)，巨细胞病毒性视网膜炎(伴随着失明)、HIV脑病，持续超过一个月的单纯疱疹损伤，支气管、肺或食管中的单纯疱疹，组织胞浆菌病(弥散性或肺外部)，免疫母细胞淋巴瘤，侵入性 宫颈癌(癌症)，肠中持续超过一个月的等孢子球虫病，卡波西肉瘤(Kaposi′s sarcoma)、淋巴瘤(主要在脑中)、鸟分枝杆菌(Mycobacterium avium)复合物(弥散性或肺外部)，堪萨斯分枝杆菌(Mycobacterium kansasii)(弥散性或肺外部)，结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)(弥散性或肺外部)，卡氏肺孢子虫(Pneumocystis carinii)肺炎，肺炎(12个月周期中复发)，进行性多灶性白质脑病(PML)，沙门氏菌败血病(复发)，弓形虫病(脑中)，消耗综合征(wasting syndrome)和任何其他通过HIV感染患者中的受损的免疫系统促进的感染的疾病。
本发明的疫苗可用于治疗HIV-1感染。尽管所有可能患有HIV-1或其等同物的动物都可以用该方式治疗(例如，黑猩猩、猕猴、狒狒或人)，但是本发明的免疫原性组合物特别针对于其在人中的治疗应用。通常，可能需要施用超过一次以获得期望的治疗效果，精确方案(剂量和频率)可通过标准临床方法建立。
本发明还涉及预防或减轻与HIV感染相关的症状。这些包括与HIV感染的次要症状阶段有关的症状，包括，例如：带状疱疹、皮疹和指甲感染、口疮、复发性鼻和喉感染以及重量减轻。此外，与HIV感染的主要症状阶段相关的另外的症状包括，例如：口腔和阴道疮(念珠菌症)、持续性腹泻、重量减轻、持续性咳嗽和再活化的结核病(reactivated tuberculosis)或复发性疱疹感染，例如唇疱疹(单纯疱疹)。可根据本发明治疗的完全发展的AIDS的其他症状包括，例如，腹泻、恶心呕吐、鹅口疮和口疮、持续的复发性阴道炎和宫颈癌、持续泛发性淋巴结病(PGL)、重度皮肤感染、疣和癣、呼吸道感染，肺炎(特别是卡氏肺孢子虫肺炎(PCP))、带状疱疹，神经系统问题，例如手和足的疼痛、麻痹或“针刺感(pins and needles)”、神经异常、卡波西肉瘤、淋巴瘤、结核病或其他类似机会性感染。
本发明的有益效果包括例如：预防或延迟暴露于HIV的个体的初次感染，降低被HIV感染的个体中的病毒负荷，延长HIV感染的无症状阶段，保持已经通过抗逆转录病毒治疗(ART)降低了病毒水平的HIV感染患者中低病毒载量，提高HIV-1特异性和非特异性两种CD4 T细胞的水平或减缓所述CD4 T细胞的降低，在首次用药的患者和利用ART治疗的患者中，提高HIV特异性CTL的宽度、量级、活动性和功能，提高具有AIDS的个体的整体健康或生命质量，以及延长具有AIDS的个体的预期寿命。临床医师可通过之前患者的病症或未治疗患者的预期病症 或者在疫苗治疗和未治疗的个体的临床试验中比较免疫效果，以确定治疗是否对抑制AIDS有效。
可以将免疫原性组合物设计成将核酸或表达载体引入到期望的作用部位并以适当的并且受控的速率释放。制备控释制剂的方法是本领域中已知的。例如，可通过使用聚合物复合或吸收免疫原或免疫原性组合物来生产控释制剂。可使用已知提供期望的控释特征或释放曲线的适当大分子(例如，聚酯、聚氨基酸、聚乙烯、吡咯烷酮、乙基乙酸乙烯酯、甲基纤维素、羧甲基纤维素或硫酸鱼精蛋白)来制备控释制剂。通过控释制剂控制作用的持续时间的另外的可能方法是将活性成分并入聚合物材料(例如，聚酯、聚氨基酸、水凝胶、聚乳酸、聚乙醇酸，这些酸的共聚物或乙烯乙酸乙烯酯共聚物)的颗粒中。或者，不将这些活性成分并入聚合物颗粒中，可将这些物质包埋在通过例如凝聚技术或通过界面聚合制备的微胶囊(分别例如羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊)中、在胶状药物递送系统中(例如，脂质体、白蛋白微球、微乳、纳米颗粒、纳米胶囊)或在粗乳剂(macroemulsion)中。参见Voller A等编辑，“New Trends and Developments in Vaccines(UniVersity Park Press，Baltimore，MD，US，1978)和Gennaro A编辑，“Remington′s Pharmaceutical Sciences”，第18版(Mack Publishing Co.，Easton，PA，US，1990)。
本领域技术人员可容易地确定本发明免疫原性组合物中本发明核酸和表达载体(总体来说，免疫原)的合适的剂量。例如，可根据施用途径和对象的体型改变免疫原的剂量。本领域技术人员可通过例如使用常规免疫学技术测量对象(如试验动物)的免疫应答来确定合适的剂量，并将剂量调节合适。用于测量对象的免疫应答的这些技术包括但不限于：铬释放测定、四聚体结合测定、IFN ELISPOT测定、IL-2 ELISPOT测定、细胞内细胞因子测定和其他免疫检测实验。参见Harlow E，Lane D，“Antibodies：A Laboratory Manual”(Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，US，1988)。
可使用任何合适的递送方法施用所述免疫原性组合物，包括但不限于：肌内、静脉内、皮内、经皮、鼻内、黏膜(例如，直肠内、阴道内、经口)和局部递送。这样的技术是本领域中周知的。递送方法的更具体实例是肌内注射、皮内注射和皮下注射。但是，递送未必限于注射法。另外，通过阳离子脂质体直接注射裸DNA到动物肌肉组织或者使用“基因枪”或 电穿孔技术皮内注射DNA，已经实现了将DNA递送到动物组织中。参见Watanabe M等，Mol.Reprod.Dev.1994；38：268-274，Charnock-Jones D，等WO1996020013，Robinson H等，Vaccine 1993：11：957-960，Hoffman S，等，Vaccine1994；12(16)：1529-1533；Xiang Z等，Virology1994；199：132-140，Webster R等，Vaccine1994；12：1495-1498，Davis H等，Vaccine1994；12：1503-1509，Davis H等，Hum.Mol.Gen.1993；2：1847-1851以及Johnston S等，Meth.Cell Biol.1994；43：353-365。也可通过黏膜表面如肛门、阴道或口腔黏膜来完成递送。
7.本发明的试剂盒
在另一个方面，本发明涉及试剂盒，其包含第一个方面的免疫原，第二个方面的肽或其变体，第三个方面的核酸、表达盒、表达载体、病毒或细胞，或者第四个方面的疫苗。这些试剂盒提供了实施如本发明所述应用所需的材料。所述试剂盒还可以是贴片的形式。
此外，所述试剂盒可包含包装，其允许将试剂保持在确定界限内。适合制备这样的包装的材料包括玻璃、塑料(例如，聚乙烯、聚丙烯、聚碳酸酯)、瓶、小瓶、纸或小袋。本发明的试剂盒还可额外地包含用于使用其中包含的组分的说明书，特别是由本发明的止血剂贴片组成的那些。所述说明书可以以印刷材料的形式存在，或者为可储存说明书的电子载体形式，从而使得对象可阅读，例如电子存储介质(例如磁盘、磁带)或光学介质(例如，CD-ROM、DVD)。所述介质可额外地或可选地包含提供所述说明书的因特网网址。
通用方法
1.T细胞免疫原设计
进行以下方法以设计本发明的HIV OLP。
使用共有序列分化体B肽组进行的232位HIV感染的未治疗个体的实验(干扰素γELISpot)筛选揭示了主要被具有优秀的HIV控制的对象主要靶向的病毒蛋白质组区域。参见Frahm N等，J.Virol.2004；78：2187-2200；Mothe B等，J.Transl.Med.2011；9(1)：208。总测试肽组由410个18聚体的重叠肽组成，其跨越整个病毒蛋白质组。在这些中，鉴别了26个OLP，其中OLP应答组比OLP不应答组(即，在干扰素γELISpot测定中不与这些OLP反应的个体)具有显著(p＜0.05，未进行 多重比较校对)降低的病毒载量。这些有益的OLP具有保护比(protective ratio)(PR＞1)，并且位于病毒的HIV Gag蛋白质(n＝10)、Pol(n＝12)以及Vif(n＝3)和Nef(n＝1)蛋白质中。在这26个OLP中，15个是部分重叠的。参见表1。
表1


＊黑体的PR值表示PR＞1，即在具有低病毒载量的个体中更频繁地见到OLP应答
为了建立连续的免疫原序列，将26个OLP对齐并装配成总计16个片段，长度范围为11至78个氨基酸。这些片段的精确起始和结束位置基于对所鉴定的26个OLP上游和下游的残基的分析并且基于应用于不同侧翼位点的若干考虑。这些考虑包括：
1)OLP免疫原性数据
2)保守区域反应性数据
3)延长或截断片段，以包含/排除好的或坏的已知表位
4)CD4表位覆盖范围
5)HLA覆盖范围
6)序列可变性(2010共有和HBX2限定的表位)
7)多变量OLP分析
8)新表位/自身表位的产生
9)保持天然序列，尽管不包含有益的OLP
10)引入变化以避免表位识别，以及
11)避免被禁止的残基(G、P、E、D、Q、N、T、S或C)
该方案导致设计了SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：16作为潜在的免疫原。
2.载体
在片段之间利用一个、两个或三个丙氨酸来连接序列SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：16，以确保最优处理并避免不成熟表位的消化。
然后，使用已连接的片段作为用于包含在DNA和MVA载体中的HIV T细胞免疫原序列。为了仅使用可溶性肽或将其与热休克蛋白组合来递送免疫原，设计了跨越16个片段但不包含三元AAA接头的较短重叠肽(中值长度23个残基)。这些OLP以有助于在C-末端处避免被禁止残基的方式产生(对于优化在HLA I类分子上表位呈现很重要。参见SEQ ID NO：17至SEQ ID NO：45，2012年1月)。这些重叠肽长度范围为11至27个氨基酸。
3.T细胞免疫原
T细胞免疫原已被设计成多肽，并由通过三丙氨酸接头一体化的HIV-1基因组的16个不同大小(11至78aa)的片段装配。区域的描述包括：

全长：529(包括A、AA或AAA接头)
4.包含前导序列
信号肽一般是必须横穿过膜以到达其功能性细胞定位处的蛋白质的高疏水氨基酸序列(15至60个氨基酸长)。通过结合信号识别颗粒，这些序列引导初生蛋白-核糖体复合物到膜，蛋白质在翻译过程中插入至所述膜。信号肽通过多种膜(例如，内质网、线粒体、叶绿体、过氧化物酶体)引导对蛋白质的翻译摄取。非膜蛋白质上的前导信号序列最终通过特定的肽酶而被移除。
使用的一些信号肽包括MCP-3趋化因子，用于促进抗原呈递细胞的分泌和吸引；针对增加的蛋白酶体降解的连环蛋白(CATE)-衍生肽；以及溶酶体相关蛋白LAMP1，用于靶向MHC II隔室。参见Rosati M等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA2009；106：15831-15836。
在本设计中，可在免疫原的氨基末端引入来自GMCSF(粒细胞巨噬细胞集落刺激因子)的信号肽，以增强来自表达细胞的免疫原分泌，然后通过缬氨酸增强稳定性。GMCSF信号肽的序列是：
MWLQSLLLLGTVACSIS(SEQ ID NO：46)
5.包含用于体外表达试验的标签
出于评估感染细胞的表达的目的，使免疫原序列在C末端区域在终止密码子之前首先包含FLAG肽，其为
DYKDDDDKL(SEQ ID NO：48)
FLAG系统使用短的、亲水的8氨基酸肽，其与目的重组蛋白融合。FLAG肽包含针对多个高特异性抗FLAG单克隆抗体(M1、M2、M5，Sigma-Aldrich Corp.，Saint Louis，MO，US)的结合位点，其可用于评估目的蛋白质在转染细胞的材料中的表达。
由于FLAG肽标签的小的尺寸，其通常不屏蔽其他表位、结构域或改变融合蛋白的功能、分泌或运输。随后移除该序列来用于小鼠免疫原性测定。在免疫接种之前，从最终免疫原(298H)中移除FLAG标签。
6.T细胞免疫原的描述
T细胞免疫原具有以下序列(SEQ ID NO：49)：

其中，
以下划线示出了GMCSF信号肽，紧接信号序列的缬氨酸突出显示，单、双或三A(AAA)接头以黑体字示出，FLAG表位(在用于体内研究的最终构建体中被移除)，括号中示出的不同片段如下：

7.核苷酸序列密码子优化
将T细胞免疫原序列翻译成RNA/密码子优化的核苷酸序列以增强表达和分泌(Mr.Gene GmbH，Regensburg，DE)。密码子优化是基于引入多个核苷酸改变以破坏先前鉴定的RNA加工，抑制mRNA中的序列并使其不稳定，但是不影响编码的蛋白质。参见Schwartz S等，J.Virol.1992；66(12)：7176-7182。该处理还可包括通过适当的密码子改变从编码序列中删除预定的剪接位点(计分＞0.4)，以最小化剪切的可能性。
作为上述核苷酸改变的结果，T细胞免疫原的最终GC含量为63％。免疫原的完全密码子优化的核酸序列是(SEQ ID NO：50)：


其中，编码GMCSF信号肽的序列加有下划线，紧接编码信号序列的序列下游的缬氨酸密码子突出显示，编码免疫原性多肽的序列以标准字体示出，编码Flag标签的序列以斜体字示出，tga和taa终止密码子以小写字母示出。
8.克隆策略
将密码子优化的T细胞免疫原克隆到哺乳动物表达质粒BV5中，其由被优化用于在细菌中生长的经修饰的CMV基础质粒骨架组成，其具有人巨细胞病毒(CMV)启动子、牛生长激素(BGH)多腺苷酸化位点和卡那霉素抗性基因——缺少Xho位点。克隆步骤如下：
1)在第一步中，向合成的T细胞免疫原中——包含FLAG表位的一种T细胞免疫原，在RT 41位(片段9)处引入从Leu到Meth的氨基酸改变，以涵盖一个主要的抗逆转录病毒抗性突变位点。将T细胞免疫原基因(起始载体)克隆在具有壮观霉素抗性的质粒中。将PCR产生的涵盖RT M41改变的片段插入到T细胞免疫原中SpeI/HindIII。将感受态细胞DH108B用于转化并生长在LB-壮观霉素培养基中。所得质粒名为HIVACAT RT M41。使用涵盖片段9序列的有义引物和反义引物通过 PCR测序确认点突变的插入。
2)在第二步中，通过将载体与凝胶纯化的消化的HIVACAT RT M41片段连接，将HIVACAT RT M41基因插入到在卡那霉素抗性基因中缺少Xho位点的BV5质粒中，作为SalI/EcoRI。将感受态细胞DH108B用于转化并生长在LB-Kan培养基中。所得质粒名为297H(GMCSF-HIVACAT-FLAG)。通过限制性消化和使用有义引物(来自CMV启动子)和反义引物(来自聚A BGH区域)的PCR测序来确认基因的插入。
3)在第三步中，通过BstEII-EcoRI消化从297H质粒中移除用于FLAG标签的表位并插入退火引物298H Plus和298H Minus：
298HPlus
GTCACCGGGCGGCTGCATGGCTGGAGGCTCAGGAGGAGGAGGAG
GTGGGCTTCtgataaG(SEQ ID NO：51)
298H Minus
aattCttatcaGAAGCCCACCTCCTCCTCCTCCTGAGCCTCCAGCCATGC
AGCCGCCCG(SEQ ID NO：52)
所得质粒名为298H GMCSF-HIVACAT，登记号DSM 25555)。参见图1。使用反义引物(来自聚A BGH区域)通过PCR测序来确认FLAG标签的移除。
实施例1 体外表达研究
进行数个瞬时转染以评估HIVACAT T细胞免疫原的表达、定位和稳定性。
简单地说，将完全DMEM加10％胎牛血清(FBS)中的1×10⁶人293细胞平板接种在60mm组织培养皿上并允许粘附过夜。利用总计7μg DNA(100ng或250ng的297H GMCSF-HIVACAT-FLAG质粒DNA、50ng的GFP表达质粒pFRED143，利用Bluescript DNA加满至7μg)通过CaPhosphate DNA共沉淀来转染HEK 293细胞。
转染后6小时，将培养基更换成增补有2％FCS的3ml DMEM。在24小时和48小时后，将细胞和上清液收集在0.5X RIPA中。
通过Western免疫印迹进行蛋白质表达的分析。装载1/250的总细胞 提取物和上清液。通过在10％十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶(Nu-Page Bis-Tris，NuPAGE，Invitrogen，Life Technologies Corp.，Carlsbad，CA，US)上进行电泳来解析蛋白质并转移到硝酸纤维膜上。
通过利用以1∶3.000稀释的辣根过氧化物酶辍合的抗FLAG单克隆抗体(Sigma-Aldrich Corp.，Saint Louis，MO，US)探测膜来检测297H质粒。
使用ECL使条带显现。在ChemiDoc XRS+上对膜成像。
使用阳性对照，其包含编码分化体B p55Gag的质粒DNA，其还具有FLAG标签。
利用1∶3.000稀释的来自HIV-1感染对象的人血清接着1∶10.000稀释的辣根过氧化物酶辍合的人抗IgG探测来自使用298H质粒(编码不具有FLAG-标签的HIVACAT T细胞免疫原)瞬时感染的细胞提取物。
297H和298H质粒稳定地(24小时和48小时相同的估计量)表达HIVACAT T细胞免疫原构建体，其在细胞提取物隔室中显现。没有分泌构建体的证据。
实施例2 小鼠中的细胞应答
产生无内毒素的1ml(2mg/ml)298H GMCSF-HIVACAT DNA的储液用于小鼠中的体内研究。
在6-8周龄雌性C57BL/6小鼠(Charles River Labs，Inc.，Frederick，MD，US)中评估HIVACAT T细胞免疫原的免疫原性。
在第0周和第4周，使用Inovio系统(Inovio Pharmaceuticals，Inc.，Blue Bell，PA，US)通过电穿孔在左和右四头肌中肌内递送20μg和5μgDNA(20μg/50μl每剂量，每个部位25μl)。在最后一次免疫接种2周后处死小鼠。收集小鼠脾细胞和血清用于免疫原性研究。使用的对照DNA为：
1)114H p55gag分化体B：表达全gag蛋白；
2)132H NTV：表达nef、tat和vif的嵌合蛋白；
3)133H pol：表达全pol蛋白；以及
4)BV4CMV-kan-Basic：SHAM对照，没有任何被表达的转基因的相似DNA质粒骨架。
试验中使用35只小鼠，每组合计5只小鼠。每组免疫接种分配如下：

在第一步中，使用合并的脾细胞(来自组内五只小鼠的细胞)中的细胞内细胞因子染色(ICS)并使用涵盖全部gag、pol、nef、tat和vif蛋白质的重叠肽的库对细胞免疫应答进行表征。
简单地说，在肽库(15-聚体，通过涵盖分化体B gag、共有序列B pol和NL43nef、tat和vif序列的11aa重叠，每一种肽1μg/ml，总计约12小时，1小时不具有Golgi stop，以防止细胞因子分泌)的存在下将来自每一组小鼠的合并的分离小鼠脾细胞以2×10⁶细胞/ml的密度以1ml共培养中孵育过夜。利用CD3-别藻蓝蛋白-Cy7、CD4-PerCP、CD8-Pacific Blue(BD Biosciences，Inc.，Franklin Lakes，NJ，US)进行表面免疫染色。在透化之后使用干扰素γ-FITC抗体(BD Biosciences，Inc.，Franklin Lakes，NJ，US)进行细胞内细胞因子染色。
从第一免疫原性分析，在C57BL/6小鼠中，20μg和5μg DNA二者都产生了对于全gag、pol和nef-tat-vif肽库的干扰素γ-+可检测的应答。参见图2a。示出了CD4+和CD8+应答的分布。参见图2b。
在个体小鼠水平，使用了冷冻的脾细胞对应答去卷积(deconvoluted)，在干扰素γELISpot测定中，利用8个肽库刺激所述脾细胞以涵盖免疫原中包含的蛋白质亚基。
根据制造商的指示并进行小的改进，使用小鼠干扰素γELISpot试剂盒(ALP)(Mabtech AB，Stockholm，SE)进行ELISpot测定。对于所有测定，将小鼠脾细胞以4×10⁵细胞/孔的输入细胞数单独或与HIV-1-特异性肽库 (每一种肽终浓度为14μg/ml)一起添加到96-孔聚乙二烯平板(Millipore Corp.，Bedford，MA，US)中的具有10％胎牛血清的140μl Rosewell Park Memorial Institute培养基1640中，在5％CO₂中于37℃下16小时。将各自包含2至12种基于2001共有序列-B序列的18个氨基酸的肽的8个肽库合并到不同的蛋白质亚基(gag-p17、gag-p24、gag-p2p7p1p6、pol-RT、pol-蛋白酶、pol-整合酶、vif和nef)中，其跨越HIVACAT T细胞免疫原中包含的片段。参见http：//hiv-web.lanl.gov/content/hiv-db/CONSENSUS/M_GROUP/Consensus.html，2012年1月。在利用表达全gag、pol、nef、tat和vif蛋白质的DNA进行免疫接种的小鼠中使用的HIV肽库由具有11个残基的重叠的18-聚体肽组成，其跨越整个gag(6个库，11个肽/每个库)、pol(8个库，16或17个肽/每个库)、nef(2个库，13或14个肽/每个库)、tat(1个库，12肽)和vif(2个库，12个肽/每个库)蛋白质。
使用5mg/ml的Concavalin A(Sigma-Aldrich Corp.，Saint Louis，MO，US)作为阳性对照。利用一步5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸盐/氮蓝四唑(BCIP/NBT，Bio-Rad Laboratories，Inc.，Irvine，CA，US)对板显影。使用ImmunoSpot软件用自动化ELISPOT阅读系统(CTL Analyzers LLC，Cleveland，OH，US)对板上的斑点计数，应答的量级表示为每百万输入脾细胞中的斑点形成细胞(SFC)。阳性应答的阈值定义为每孔至少5个斑点和超过“阴性对照孔中斑点的平均数加上阴性对照孔的3标准差)”和“阴性对照孔的平均值的3倍”其中更高者的应答。
1)在利用编码整个gag、pol、nef、tat和vif蛋白质的质粒进行免疫接种的小鼠中发展的优势的干扰素γ应答针对HIVACAT T细胞免疫原涵盖的片段(靶向HIVACAT免疫原区域/全部gag+pol+nef+tat+vif的应答的中值比为0.26(0.17-0.42的范围))外部的区域，并且在利用高剂量(20μg)或低剂量(5μg)的DNA免疫接种的组中没有差异。参见图3。
2)在利用20μg HIVACAT免疫接种的小鼠中，对HIVACAT T细胞免疫原序列中包含的蛋白质亚基的应答的中值宽度为4(2-5的范围)，相对地，在利用20μg编码全部蛋白质(ns)的质粒免疫接种的小鼠中2应答(1-3的范围)，在应答的量级上没有显著差异。在利用HIVACAT T细胞免疫原免疫接种的小鼠中，8种蛋白质亚基中的6种被至少靶向一次。参见图4。

4)在利用编码gag、pol、nef、tat和vif的全部蛋白质的质粒进行免疫接种的小鼠中的优势应答被驱动89％主要朝向gag，而在利用高剂量的HIVACAT T细胞免疫原进行免疫接种的小鼠中对免疫原中包含的所有蛋白质组分(gag、pol、vif和nef)更平衡。参见图5。
实施例3 小鼠中的体液应答
首先在合并的小鼠血清中分析体液应答。使用来自HEK 293细胞的细胞提取物通过western免疫印迹检测p24、p37和p55的结合抗体并利用来自小鼠的合并血清(以1∶100稀释)探测膜，所述HEK 293细胞已用分离在12％SDS-Page上的1mg gag表达载体转染。通过ELISA测量gag p24的抗体滴度。评估连续4倍稀释的合并血清样品并确定450nm的吸光度(Advanced BioScience Lab，Inc.，Kensington，MD，US)。结合滴度报道为最高稀释记分阳性，其具有高于由利用SHAM DNA免疫接种的小鼠的对照血清获得的平均值+3标准差的值。
a)由第一体液免疫原性分析，可通过Western印迹在利用20μg免疫接种的小鼠的组中确定HIVACAT T细胞免疫原诱导的结合抗体对于gag p55，p37和p24应答。参见图6。
b)通过ELISA定量p24的结合抗体。通过ELISA由个体连续4倍稀释的合并血清样品确定接受所述质粒的小鼠的gag-p24特异性结合抗体的终点滴度。在利用HIVACAT T细胞免疫原进行免疫接种的小鼠的高剂量组中，滴度为1∶4,000，其低于利用全gag构建体进行免疫接种的小鼠中检测的滴度。在低剂量组中没有可测量的p24结合抗体。参见图7a。在个体小鼠水平，利用1∶100稀释的小鼠血清使用HIV-1IIIB pr55gag重组蛋白(Cat.No.3276，NIH Reagent Program，Bethesda，MD，US)进行内部开发gag p55ELISA。在利用高剂量的免疫原进行免疫接种的3只小鼠中，在2只中检测到了低水平的抗体。参见图7b。
实施例4 小鼠中的异源初次免疫/加强免疫的体内免疫原性
材料和方法
pDNA-HIVACAT和MVA-HIVACAT疫苗的制备
将密码子优化的T细胞免疫原克隆到哺乳动物表达质粒BV5中，其由被优化用于在细菌中生长的经修饰的CMV基础质粒骨架组成，其具有人巨细胞病毒(CMV)启动子、牛生长激素(BGH)多腺苷酸化位点和卡那霉素抗性基因——缺少Xho位点。使用Endo-Free Megaprep(Qiagen)制备用于小鼠免疫接种的质粒DNA并储存在-80℃下直至使用。
如之前描述(Letourneau，2007#235；Nkolola，2004#321)制备表达HIVACAT基因的重组MVA。简单地说，利用亲本MVA以MOI 1感染生长在增补有10％FBS、青霉素/链霉素和谷氨酰胺(DMEM 10)的Dulbeco经修饰的Eagle培养基上的鸡胚成纤维细胞(CEF)，并使用具有3ug pDNA-HIVACAT的Superfectin(Quiagen)转染，所述pDNA-HIVACAT携带有β-半乳糖苷酶基因作为标记。2天后，收获全部病毒并用于再感染CEF细胞。对MVA进行5个噬斑纯化循环，之后生长主要的病毒储液，在36％蔗糖垫上纯化，滴定并储存在-80℃下直至使用。
在C57BL/6小鼠中的体内免疫原性
对于小鼠中的异源初次免疫/加强免疫的体内免疫原性实验，使用多组5只6至8周龄的雌性C57BL/6(Harlan Laboratories Ltd.，Barcelona， Spain)。利用100μg pDNA-HIVACAT(2或3次疫苗接种)对小鼠进行肌内初次免疫，接着通过10^6pfu的MVA-HIVACAT进行加强免疫(组：分别为2×DNA、3×DNA、2×DNA+IMVA和3×DNA+1MVA)。全部的疫苗接种间隔三周。
每个实验中最后一次疫苗接种2周后处死全部小鼠。收获小鼠脾细胞和血清用于免疫原性研究。切下脾脏并使用5-ml注射器橡胶活塞单独加压通过细胞过滤器(Falcon)。在rbc裂解后，洗涤脾细胞并重悬在增补有10％FCS、青霉素/链霉素的RPMI 1640(R10)中，冷冻直至使用。
所有动物程序和养护经当地Ethical Comitte批准。
重叠肽和肽库的分布
为了评估异源法的免疫原性是pDNA或仅表达HIVACAT T细胞免疫原的MVA并排除潜在的连接表位的免疫原性，使用9-芴基甲氧基羰基(Fmoc)-化学新合成15个氨基酸长的147个肽的重叠肽组(通过11个残基重叠)，其跨越整个HIVACAT T细胞免疫原(包括前导序列和接头区)。根据免疫原的蛋白质亚基和片段，将肽分布在18个不同的库中(1个信号肽序列库，n＝4个肽；7个Gag库，n＝8-11个肽/每个库；7个Pol库，n＝5-11个肽/每个库；2个Vif库，n＝6-8个肽/每个库，以及1个Nef库，n＝2肽)。结果通过特异性针对8个蛋白质亚基(Gag p17、Gag p24、Gag p2p7p1p6、Pol-蛋白酶、Pol-RT、Pol-整合酶、Vif和Nef)的IFNγ应答分组表示。
小鼠INFγELISPOT测定
根据制造商的说明并进行小的修改，使用小鼠IFNγELISpot试剂盒(ALP)(Mabtech AB，Stockholm，SE)进行ELISpot测定。对于所有测定，首先将冷冻的小鼠脾细胞解冻，并在使用前在R10中于37℃静止5小时。将细胞以4×10⁵细胞/孔的输入细胞数单独或与HIV-1-特异性肽库(每一种肽为14μg/ml终浓度)一起添加到96孔聚乙二烯平板(Millipore Corp.，Bedford，MA，US)中的140μl R10中，在5％CO₂中于37℃下16小时。使用5mg/ml的Concavalin A(Sigma-Aldrich Corp.，Saint Louis，MO，US)作为阳性对照。利用一步5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸盐/氮蓝四唑(BCIP/NBT，Bio-Rad Laboratories，Inc.，Irvine，CA，US)对板显影。使用ImmunoSpot软件用自动化ELISPOT阅读系统(CTL Analyzers LLC，Cleveland，OH，US)对板上的斑点计数，应答的量级表示为每百万输入脾 细胞中的斑点形成细胞(spot forming cell，SFC)。阳性应答的阈值定义为每孔至少5个斑点和超过“阴性对照孔中斑点的平均数加上阴性对照孔的3标准差)”和“阴性对照孔的平均值的3倍”其中更高者的应答。
结果
在这些试验中，因为没有使用编码全蛋白质的质粒对小鼠进行免疫接种，所以合成了与精确的免疫原序列匹配的第二组重叠肽并用于免疫原性比较。利用100μg pDNA-HIVACAT进行三次肌内(i.m.)免疫接种能够在全部小鼠中诱导频繁的IFNγ应答，其比得上利用电穿孔Inovio系统通过免疫接种诱导的IFNγ应答的频率。但是，发现两次pDNA i.m.疫苗接种仅在3个动物(60％)中具有免疫原性，相比之下，在三次pDNA i.m.免疫接种之后，100％的动物诱导了应答。有趣的是，在两个分析的组中，MVA-HIVACAT疫苗能够在宽度和量级两方面强化应答(图8B)，但是当小鼠之前已利用三个剂量的pDNA-HIVACAT进行了初次免疫时，其仅显著增加应答的量级(图8B和8C)。如在之前的EP实验中看到的，在所有动物中观察到了对于免疫原中包含的全部蛋白质亚基中的大部分蛋白质亚基的平衡并且广泛的应答，其之间没有明显的优势模式。在研究的小鼠中未检测到对nef或gag-p15的特异性应答(图8D)。
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尽管为了清楚和理解的目的详细描述了本发明，但是本领域技术人员应理解的是，通过阅读本公开内容，可在形式和细节方面进行多种改变，而不脱离本发明和所述权利要求的真实范围。
上述全部出版物均通过引用整体并入本文。