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1、10申请公布号CN104073460A43申请公布日20141001CN104073460A21申请号201410350862722申请日20140723C12N1/21200601C12N15/74200601A61K39/02200601A61P35/00200601C12R1/0120060171申请人南京医科大学地址211100江苏省南京市江宁区天元东路818号72发明人陈云杨雨林喆孙倍成姜润秋万昕姚堃赵玮唐俊伟卓晗74专利代理机构江苏圣典律师事务所32237代理人杨文晰孙忠浩54发明名称引入EB病毒LMP2A核苷酸序列的转化减毒李斯特菌及其疫苗57摘要本发明公开一种引入EB病毒LMP。
2、2A核苷酸序列的转化减毒李斯特菌及其疫苗，其中EB病毒LMP2A核苷酸位于P1565穿梭质粒上，并在减毒李斯特菌或其子代中复制并表达；本发明提供的减毒李斯特菌疫苗具有较高的安全性和可靠性，对各种组织器官无明显的损伤作用，同时无氯霉素抗性的减毒李斯特菌疫苗，可避免鼻咽癌患者治疗过程中出现氯霉素耐药性。51INTCL权利要求书1页说明书6页序列表1页附图2页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书6页序列表1页附图2页10申请公布号CN104073460ACN104073460A1/1页21一种引入EB病毒LMP2A核苷酸序列转化的减毒李斯特菌或其子代，其特征在于所述E。
3、B病毒LMP2A核苷酸位于P1565穿梭质粒上，并在减毒李斯特菌或其子代中复制并表达。2一种转化减毒李斯特菌的方法，其特征在于将EB病毒LMP2A核苷酸序列引入P1565穿梭质粒后，与减毒李斯特菌感受态细胞电转复苏后获得转化减毒李斯特菌。3一种包含转化的减毒李斯特菌或其子代的疫苗，其特征在于包括引入EB病毒LMP2A核苷酸序列的步骤，所述EB病毒LMP2A核苷酸位于P1565穿梭质粒上，并于减毒李斯特菌或其子代中复制并表达。4根据权利要求3所述的包含转化的减毒李斯特菌或其子代的疫苗，其特征在于将减毒李斯特菌菌体通过氯霉素抗性筛选，优选得到稳定的无氯霉素抗性的减毒李斯特菌疫苗。权利要求书CN10。
4、4073460A1/6页3引入EB病毒LMP2A核苷酸序列的转化减毒李斯特菌及其疫苗技术领域0001本发明涉及微生物领域，特别是一种引入EB病毒LMP2A核苷酸序列的转化减毒李斯特菌及其疫苗。背景技术0002肿瘤及其相关性疾病对人们的健康产生了越来越多的威胁。目前，据统计全世界鼻咽癌有80发生在我国，是我国南方多发的恶性肿瘤之一，死亡率在恶性肿瘤中居第五位。鼻咽癌好发于解剖结构复杂的咽隐窝，肿瘤生长隐蔽，以早期淋巴结转移为特征，其侵袭性强、复发率高等特点给临床治疗带来很大的难度。0003研究表明EB病毒（EPSTEINBARRVIRUS,EBV）的感染与鼻咽癌的发生具有密切关系，EBV潜伏基因。
5、产物在致瘤中发挥重要作用，其中潜伏膜蛋白2A（LATENTMEMBRANEPROTEIN2A,LMP2A）是能在静止B细胞中唯一可检测到的EBV潜伏基因表达产物，研究已经证实在非角化鼻咽癌约有大于95的患者表达LMP2A，但其对肿瘤演进的机制目前不是十分清，由于LMP2A受人类白细胞抗原限制的抗原决定簇较多且序列相对保守，无致癌潜能，因此在鼻咽癌的免疫治疗中扮有十分重要的作用，是非常理想的疫苗靶标。0004李斯特菌（LISTERIAMONOCYTOGENES是一种格兰染色阳性的胞内寄生菌，对体抗力较差的老人、孕妇和小孩能够引起腹泻，20世纪，李斯特菌被认为是最有潜力的活疫苗载体，目前全球十大最。
6、有潜力的疫苗中，李斯特菌疫苗独占两席，李斯特菌在体内主要被巨噬细胞、肝库普佛细胞及脾淋巴细胞吞噬。李斯特菌溶血素O能够溶解细胞膜，使得李斯特菌能够自由进出细胞，在细胞与细胞之间传播，李斯特菌在胞内期分泌的蛋白可被蛋白酶降解并递呈给MHCI类通路，同时，该分泌蛋白可以直接被递呈并激活MHCII分子通路；因此，李斯特菌疫苗可以激活CD4和CD8的T淋巴细胞，具有很强的激发细胞免疫应答的能力。0005申请号为“2013105985749”的中国专利，公布一种利用PKSV7穿梭质粒引入人源CD24核苷酸序列的转化减毒李斯特菌疫苗，用以表达人CD24蛋白，但是通过分子克隆技术使李斯特菌表达及分泌EB病毒。
7、LMP2A蛋白，激活机体免疫应答，产生相应抗体，但是它不适于治疗及预防鼻咽癌，如何将减毒李斯特菌用于治疗及预防鼻咽癌的技术目前未见有报道。发明内容0006为克服现有技术中鼻咽癌治疗的诸多不足，提供一种治疗鼻咽癌，特别是能够预防鼻咽癌的发生且具有较高安全性的转化减毒李斯特菌疫苗。0007本发明的技术方案是一种引入EB病毒LMP2A核苷酸序列转化的减毒李斯特菌或其子代，所述EB病毒LMP2A核苷酸位于P1565穿梭质粒上，并在减毒李斯特菌或其子代中复制并表达；所述P1565穿说明书CN104073460A2/6页4梭质粒含有编码枯草芽孢杆菌的右旋丙氨酸合成酶基因序列，为减毒李斯特菌存活所必须。00。
8、08本发明中，转化减毒李斯特菌的方法，包括引入EB病毒LMP2A核苷酸序列的步骤，所述EB病毒LMP2A核苷酸位于P1565穿梭质粒上，并于减毒李斯特菌或其子代中复制并表达，所述P1565穿梭质粒含有编码减毒李斯特菌存活必须的右旋丙氨酸合成酶的基因序列。0009本发明中，一种包含转化的减毒李斯特菌或其子代的疫苗，包括引入EB病毒LMP2A核苷酸序列的步骤，所述EB病毒LMP2A核苷酸位于P1565穿梭质粒上，并于减毒李斯特菌或其子代中复制并表达，所述P1565穿梭质粒含有编码减毒李斯特菌存活必须的右旋丙氨酸合成酶的基因序列。0010本发明中，所述的包含转化的减毒李斯特菌或其子代的疫苗，其特征在。
9、于将减毒李斯特菌菌体通过氯霉素抗性筛选，在无抗性的BHI培养基中，优选得到稳定的无氯霉素抗性的减毒李斯特菌疫苗。0011本发明提供的转化的减毒李斯特菌能够过表达及分泌EB病毒LMP2A蛋白，有效的激活机体免疫系统，产生特异性抗体和有效的细胞免疫应答，杀伤鼻咽癌细胞，具有很好的防治肿瘤的作用。0012本发明提供的包含转化的减毒李斯特菌或其子代的疫苗和现有技术相比具有以下优点1、静脉注射本发明提供的减毒李斯特菌疫苗具有较高的安全性和可靠性，对各种组织器官无明显的损伤作用。00132、减毒李斯特菌鼻咽癌疫苗无抗生素抗性本发明为了能够筛选出能够成功导入穿梭质粒P1565LMP2A的李斯特菌菌体，而人为。
10、的在P1565质粒载体中加入了氯霉素抗性。但是，该疫苗将来是要用于临床治疗和预防鼻咽癌的，人为引入的氯霉素抗性可能会使疫苗的使用者产生氯霉素耐药性，本发明通过将李斯特菌菌体在无抗性的BHI培养基中传7代，优选得到稳定的无氯霉素抗性的减毒李斯特菌疫苗，可避免鼻咽癌患者治疗过程中出现氯霉素耐药性。附图说明0014图1为转化的减毒李斯特菌疫苗分泌EB病毒LMP2A蛋白免疫印迹图。0015图2减毒李斯特菌疫苗在体内细胞和组织的感染结果示意图。0016图3减毒李斯特菌疫苗在组织感染的染色示意图。0017图4为减毒李斯特菌疫苗预防鼻咽癌实验结果示意图。0018图5为减毒李斯特菌疫苗治疗鼻咽癌实验结果示意图。
11、。具体实施方式0019结合具体实施例，进一步阐明本发明，应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。0020实施例1减毒李斯特菌疫苗的制备方法本实施例中的菌株由宾夕法尼亚大学FRANCKLE教授提供，该李斯特菌菌种为缺陷型说明书CN104073460A3/6页5菌株，自身缺乏合成细菌细胞壁的右旋丙氨酸合成酶而不能独立存活，我们使用的P1565载体含有枯草芽孢杆菌的右旋丙氨酸合成酶基因。当导入P1565质粒载体后，细菌便能够合成枯草芽孢杆菌的右旋丙氨酸，使得细菌能够在一定程度上独立存活，有限程度的自我复制，而不对组织器官产生明显的损伤。0021实施例涉及的培养基/试剂改良BHI心脑。
12、灌注液培养基100ML去离子水37GBHI干粉20MG右旋丙氨酸；BHIS（蔗糖心脑灌注液）100ML去离子水37GBHI干粉17115G蔗糖20MG右旋丙氨酸；SGWB（甘油蔗糖缓冲液）1000ML去离子水17115G蔗糖100ML甘油02383G4羟乙基哌嗪乙磺酸；BHI培养基100ML去离子水37GBHI干粉；BHI平板100ML去离子水37GBHI干粉100G琼脂糖；BHI氯霉素抗性培养基100ML去离子水37GBHI干粉1MG氯霉素；BHI氯霉素抗性平板100ML去离子水37GBHI干粉1MG氯霉素100G琼脂糖；其中，BHI干粉由OXOID公司生产，货号750364。00221构建。
13、携带EB病毒LMP2A蛋白基因的P1565穿梭质粒利用合成的针对LMP2A的引物对SEQIDNO1前引物5ATCATGGGGTCCCTAGAAATGGT3SEQIDNO2后引物5GGCCGCTTATACAGTGTTGCGATATG3以带有EB病毒的B958细胞（南京医科大学微生物与免疫学系保存）为模板，采用聚合酶链式反应（PCR），体外合成LMP2A基因序列，将该序列直接连接入T载体后立即转化入DH5大肠杆菌感受态细胞内，摇菌37过夜，得到高拷贝的LMP2ADNA序列，经基因序列测序，证明LMP2A序列正确无误后，以ECORV和NOTI为酶切位点，将从高拷贝扩增的LMP2A序列从T载体上切下来。
14、，在T4DNA连接酶的作用下使其与酶切处理后充分线性化的P1565载体相连，从而连接入P1565载体。随后，将连接好的反应体系，转化入DH5大肠杆菌感受态细胞内，摇菌37过夜，得到浓度1000NG/L的P1565LMP2A质粒序列；2李斯特菌感受态细胞的制备A）菌种活化挑选减毒李斯特菌单菌落，接入改良BHI培养基，在37摇床过夜培养；B）转接将活化的李斯特菌菌种按1100转接入200ML改良BHI培养基中，继续培养，当600NM下吸光值（OD600）达到02025时，加入氨苄青霉素，使氨苄青霉素的终浓度为10G/ML；然后在37继续培养2H，当600NM下吸光值（OD600）为0506时；将培。
15、养好的李斯特菌菌体冰浴10MIN，然后在4，5000转/分钟离心10MIN，取菌体用200MLSGWB液重悬菌体，然后在4C，5000转/分钟离心10MIN；取菌体用90MLSGWB液重悬菌体，然后在4下5000转/分钟离心10MIN；取菌体再用45MLSGWB液重悬菌体，加入溶菌酶，使溶菌酶的浓度达到10G/ML后37C水浴20MIN；然后在4下3000转/分钟离心10MIN，然后取菌体用20MLSGWB液重悬菌体；然后在4，3000转/分钟离心10MIN，再用1MLSGWB液重悬菌体，得李斯特菌感受态细胞，50L/管分装，保存于80C，备用；在实际操作过程中，B）步骤中也可以按照140的比。
16、例将活化的李斯特菌菌种接入200ML改良BHI培养基中培养；也可以使用青霉素G代替氨苄青霉素。说明书CN104073460A4/6页600233电转李斯特菌感受态细胞取步骤2制备得到的李斯特菌感受态细胞50L，加入1G步骤1制备得到的P1565LMP2A质粒，在冰上孵育5MIN，然后将李斯特菌感受态细胞和P1565LMP2A质粒混合物加入到电转杯中电转电压10KV/CM,电阻400,电容25F；细胞复苏将1MLBHIS加入到上述电转的混合物中，30C下静置培养15H，然后将复苏后的细胞涂布于BHI氯霉素抗性平板上；实际操作中也可以用3050转/分钟培养15H代替静置培养；4穿梭质粒与李斯特菌重。
17、组传代挑选步骤3转化后的李斯特细菌接入BHI氯霉素抗性培养基中，30过夜培养；然后在42条件下传代，一天传2次，早上一次100传，晚上一次1000传；实现第一次同源重组，至少传5代以后，取菌液分别稀释105，106，107倍，用100UL涂布平板，42过夜培养；挑单菌落，接入BHI培养基中，30过夜培养；然后在30条件下，一天传2次，早上一次100传，晚上一次1000传，至少传7代以后，取菌液分别稀释105，106，107倍，用100UL涂布BHI平板，30过夜培养；实现第二次同源重组。0024对第二次同源重组的菌落进行氯霉素抗性筛选挑选200个单菌落，同时分别接到BHI氯霉素抗性平板和BHI。
18、平板上，30过夜培养，如果菌落在BHI氯霉素抗性平板上菌落不生长，而在BHI平板上生长，与其对应的第二次同源重组的含有菌落的BHI培养基即为重组减毒李斯特菌疫苗。0025实施例2第二次同源重组的减毒李斯特菌分泌EB病毒LMP2A蛋白实验减毒李斯特菌在通过电穿孔转入P1565LMP2A穿梭质粒之后，若要成为一个合格的疫苗必须能够持续稳定地分泌LMP2A蛋白，来有效激活机体的免疫应答。0026本发明对实施例1获得的第二次同源重组菌落在BHI培养基中继续培养，利用TCA/丙酮沉淀法提取BHI培养基中的分泌蛋白，用WESTERNBLOT法鉴定蛋白的表达中的蛋白质进行鉴定，实验结果表明，减毒李斯特菌疫苗。
19、能够稳定的分泌LMP2A蛋白，图1为转化的减毒李斯特菌疫苗分泌EB病毒性LMP2A蛋白免疫印迹图，其中A为CNE1/HLAA2/LMP2A细胞所提取的蛋白，B为实施例1获得的第二次同源重组菌落所提取的蛋白，C为FRANCKLE教授提供的减毒李斯特菌所提取的蛋白。0027实施例3对实施例1重组后的减毒李斯特菌疫苗在体内的分布检测，方法是实验组实施例1提供的重组减毒李斯特细菌疫苗；选择体重10G的C57BL/6小鼠9只，利用实验组的疫苗通过尾静脉注射免疫小鼠三次，105CFU/只，每周免疫一次，连续三周；第三次免疫结束后第1、3天取小鼠的肝、脾、肺、脑中提取李斯特菌菌体，结果表明重组后的李斯特菌主。
20、要分布在肝、脾组织中，在肾脏中发现少量李斯特菌，在肺及脑组织中几乎没有李斯特菌分布，且在肝、脾中的分布无明显统计学差异，在肝、脾中的含量如图2所示。同时，本发明通过电镜观察，如图3所示，其中A为正常状态下肝、脾、肾细胞，B为第三次免疫结束后3天的细胞，结果表明在小鼠的肝、脾中有李斯特菌菌体的存在。0028以上实验结果表明，实施例1提供的重组后的减毒李斯特菌疫苗在细胞和组织的分布有自身的特点。0029实施例4重组李斯特菌疫苗尾静脉免疫的安全性实验说明书CN104073460A5/6页7选择体重10的小鼠3只，利用实施例1的疫苗通过尾静脉免疫小鼠三次，105CFU/只，每周免疫一次，连续三周；在第。
21、三次免疫后的第3天取小鼠的肝、脾进行HE染色以判断组织损伤程度。在免疫过程中，没有小鼠出现死亡；观察HE切片发现，肝脏在免疫后出现轻微的炎症反应，肝脏中央静脉结构无明显损伤，汇管区结构完整，肝细胞未见明显空泡样变、增生及坏死。脾脏炎症反应轻微。而在肾脏，没有看到明显组织损伤的表现。0030以上结果表明，尾静脉实施例1的疫苗具有较高的安全性和可靠性，对各种组织器官无明显的损伤作用。0031实施例5减毒李斯特菌疫苗抗肿瘤实验李斯特菌属于兼性胞内寄生菌，可以同时激活MHCI类和MHCII类抗原递呈通路，此外，李斯特菌还会诱导记忆性T细胞的产生，当再次免疫时，可以迅速产生更为有效的免疫应答，本发明是采。
22、用体内抑瘤实验来评价该减毒重组李斯特菌疫苗的免疫预防和治疗效果。具体步骤如下A）实验动物模型的建立小鼠移植皮下瘤动物模型的建立取稳定转染的CNE1/HLAA2/LMP2A鼻咽癌细胞系，以106/100UL/只的剂量，用1ML注射器将鼻咽癌细胞接种于24只68周龄的HLAA2转基因小鼠的右侧腹股沟皮下。同时以105/CFU/只的剂量用尾静脉免疫小鼠，记录肿瘤生长情况。0032B）、实验分组治疗组和预防组均使用实施例1提供的疫苗，附图中标示为LMDDLMP2A；对照组的疫苗为LMDD（由宾夕法尼亚大学FRANCKLE教授提供的减毒李斯特菌疫苗；）空白对照组疫苗为疫苗稀释剂PBS；治疗组的小鼠4只，。
23、来源于本实施例的A步骤；预防组的小鼠4只，来源于本实施例的A步骤；对照治疗组的小鼠4只，来源于本实施例的A步骤；对照预防组的小鼠4只，来源于本实施例的A步骤；空白对照治疗组的小鼠4只，来源于本实施例的A步骤；空白对照预防组的小鼠4只，来源于本实施例的A步骤；C）、小鼠免疫方案预防组、对照预防组和空白对照预防组在接种肿瘤前3天，通过尾静脉给小鼠免疫剂量为105/CFU/只的相应疫苗进行免疫，然后以106/100UL/只的剂量向小鼠接种CNE1/HLAA2/LMP2A肿瘤细胞，以相同剂量和方法每周免疫小鼠一次，连续两周。以游标卡尺测量小鼠皮下肿瘤的最长径和最短径，取最大径和最小径之和的平均值计入，。
24、每3天测量一次，当肿瘤大小大于20MM时处死小鼠,截取1640天的数据标绘制图4。0033治疗组、对照治疗组和空白对照治疗组于接种CNE1/HLAA2/LMP2A肿瘤细胞（106/100UL/只）后3天开始尾静脉注射服105/CFU/只的相应疫苗免疫小鼠，以后每周免疫一次，连续两周，以游标卡尺测量小鼠皮下肿瘤的最长径和最短径。取最大径和最小径之和的平均值计入，每3天测量一次，当肿瘤大小大于20MM时处死小鼠。截取1034天的数据标绘制图5。0034D）实验结果说明书CN104073460A6/6页8实验结果如图4和图5所示，本发明提供的减毒重组李斯特菌疫苗能够明显抑制鼻咽癌细胞的生产，与对照组。
25、相比，具有明显差异，显示出了很好的抗鼻咽癌活性，尤其是针对表达LMP2A的鼻咽癌细胞，能够对其产生有效的杀伤作用，可以预防肿瘤的转移和复发。0035以上实验结果表明，本发明提供的减毒重组李斯特菌疫苗，不仅具有高的安全性，并且具有强的抑制肿瘤细胞生产的活性，有望开发成为新一代用于防治鼻咽癌的药物，具有很好的应用前景。0036以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。说明书CN104073460A1/1页9SEQUENCELISTING南京医科大学引入EB病毒LMP2A核苷酸序列的转化减毒李斯特菌及其疫苗22PATENTINVERSION33123DNA人工合成1ATCATGGGGTCCCTAGAAATGGT23226DNA人工合成2GGCCGCTTATACAGTGTTGCGATATG26序列表CN104073460A1/2页10图1图2图3图4说明书附图CN104073460A102/2页11图5说明书附图CN104073460A11。